方法文章

使用重建人角膜样上皮（RhCE）组织模型进行化学品眼刺激性危害识别的刺激性眼试验（EIT）

DOI：

10.3791/52979

⸱

2015年8月23日

 ,  ,  ,  , 
1MatTek Corporation, 2MatTek In Vitro Life Science Laboratories

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一种眼刺激性测试方法，该方法采用三维重建的人角膜样上皮（RhCE）组织模型。该测试能够区分具有眼刺激性或腐蚀性的物质（GHS 第1类和第2类合并）与无需标注分类的物质（GHS 未分类）。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为符合欧盟化妆品指令第七修正案及欧盟REACH法规的要求，亟需建立经过验证的、无需使用动物的替代方法，以实现对人类眼部毒性的可靠且准确的评估。为满足这一需求，我们开发了一种眼部刺激试验（EIT），该试验采用基于正常人源细胞的三维重建人角膜样上皮（RhCE）组织模型。该EIT能够区分眼部毒性 刺激物和腐蚀物（GHS 第1类和第2类合并）以及无需标签的物质（GHS 无分类）。该测试采用两种独立的实验方案，一种用于液体化学品，另一种类似的方案用于固体测试样品。EIT 预测模型采用单一暴露时间（液体为30分钟，固体为6小时）和单一组织存活力阈值（通过 MTT 法测定为60.0%）。根据83种化学品（44种液体和39种固体）的测试结果，EIT 的敏感性/特异性/准确率达到95.5/68.2/和81.8%（SS&A) 用于液体，100.0/68.4/ 和 84.6% SS&A 用于固体，总体 SS 分别为 97.6%、68.3% 和 83.1%&A. 眼刺激性测试（EIT）将显著推动在无需使用动物的情况下，对多种液态和固态化学品的眼刺激潜力进行分类，以满足法规测试要求。EpiOcular EIT 方法已于2015年被纳入经济合作与发展组织（OECD）测试指南，编号为TG 492。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

化妆品、洗涤剂和家用清洁剂等消费品含有多种化学物质，这些物质在接触眼睛时可能造成严重损伤。因此，为确保消费者安全，美国和欧盟监管机构要求对这些产品进行眼刺激性测试1。根据欧盟化妆品法规、化学品运输、农药及家用产品标签的相关要求，混合物和配方成分的眼刺激性评估也是符合REACH（化学品的注册、评估、授权和限制）法规的必要条件2。目前，监管机构要求采用《全球化学品统一分类和标签制度》（GHS）进行眼部危害评估3。GHS主要基于Draize眼刺激试验，该试验是最广泛使用的眼刺激性检测方法，即将外源性物质或混合物直接注入兔眼的结膜囊内4。根据GHS分类标准，GHS第1类（眼部腐蚀性物质）指在暴露后21天内无法完全恢复的、对眼部组织或视力造成严重初始损伤或严重损害的测试化学品3,5；GHS第2类指在暴露后21天内可完全恢复的眼部显著变化；不属于腐蚀性或刺激性的测试化学品则归为GHS无类别。

40 多年来，Draize 兔眼试验因缺乏可重复性、高估人体反应以及使用活体动物而受到批评5-8。这些担忧促使人们提出了许多改进、减少和替代该in vivo 试验的建议9。《化妆品指令》第七修正案的通过进一步强化了对经过验证的非动物替代方法的需求，该修正案禁止在化妆品成品（2005 年）和化妆品原料（2009 年）的安全性评价中使用动物2。

自1996年以来，重建的角膜样组织模型已被化妆品行业广泛用于评估原料、表面活性剂类配方以及拟用于眼部或眼周产品的刺激性潜力10-13。使用RhCE组织模型可将待测物质以原始未稀释的形式直接施用于组织表面，从而无需使用溶剂稀释即可测试非水溶性配方。为响应欧洲替代方法验证中心欧盟参考实验室（EURL ECVAM）对一种应用广泛、操作简便且经济高效的眼刺激性测试方法的需求，开发了采用单一暴露时间的眼刺激性测试（EIT），该方法能够区分需标注警示标签的眼刺激物和腐蚀性物质与无需标注的物质（图1）14。根据83种化学品（44种液体和39种固体）的测试结果，EIT对液体的敏感性/特异性/准确率（SS&A）分别为95.5%、68.2%和81.8%；对固体的SS&A分别为100.0%、68.4%和84.6%；总体SS&A为97.6%、68.3%和83.1%。

2007年，由Cosmetics Europe（前身为Colipa）资助、EURL ECVAM主持的多实验室预验证研究评估了EIT的相关性和可靠性，旨在推动其进入正式验证阶段15。该研究在七个独立实验室中开展了298次独立试验。研究结果表明，各参与实验室之间的预测一致性达到99.7%，且变异系数较低15。因此，EIT方案于2010年进入EURL ECVAM正式验证程序。该验证研究使用了104种编码测试化学品，包括单一物质和化学混合物，这些化学品均具有可用的in vivo参考数据（Draize眼刺激性数据）。基于此项工作的成功，2014年提交了OECD测试指南草案。预计EIT将显著促进依据联合国GHS分类和标签系统对多种材料的眼刺激潜力进行分类。

方案

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1. RhCE 组织处理前准备——第 0 天

  1. 收到商用的人类角膜样上皮（RhCE）试剂盒后，检查所有试剂盒组分是否完好无损（试剂盒详细信息参见标准检测试剂盒组分（表1）以及进行EIT检测所需的设备和材料（表2））。在收到试剂盒当天，将组织（连同其24孔运输容器）于室温下平衡15分钟。

数量试剂条件 来源描述有效期
1密封的 EpiOcular 组织 24 孔板
(OCL-200)		2-8 °CMatTek包含 24 个细胞培养插件组织，包装于琼脂糖上72 小时
1 瓶，
200 ml		EpiOcular 检测培养基
(OCL-200-ASY)		2-8 °CMatTek基于 DMEM 的培养基21 天
1 瓶，
100 ml		无 Ca++ 和 Mg++ 的杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)室温Sigma-Aldrich, D5652 或同等产品用于冲洗插件1 年
46 孔板室温 Falcon用于在检测过程中维持组织不适用
212 孔板室温Falcon在检测过程中使用不适用
224 孔板室温Falcon用于进行 MTT 检测不适用
1 小瓶，
0.5 ml		乙酸甲酯
(CAS#79-20-9)		室温Sigma-Aldrich,
货号 186325		在检测中用作阳性对照 (PC)1 个月

表1：标准检测试剂盒组分。 

设备/材料所需用于：
加湿培养箱（37 ± 1 °C，5 ± 1% CO₂）2, 90 ± 10% 湿度在检测前和检测过程中孵育组织
层流罩无菌条件下的安全操作
真空泵（可选）吸取培养基和溶液
酶标仪（适用于96孔板）读取 OD
平板振荡器 甲臜的提取
无菌钝头镊子处理组织插入物
秒表实验材料施加时机及方案中其他时间相关步骤的安排
水浴（37 ± 1 °C）预热培养基和 MTT 溶液
研钵和研杵研磨颗粒固体
正向置换移液器（50 µl）粘性与半固体材料及悬浮液的应用
可调式移液器（200 µl–2 ml）液态材料、检测培养基和 MTT 的应用
预灭菌吸头（200 µl 和 20 µl），Rainin 货号 HR-200F 和 HR-20F（或同等产品）液态材料、检测培养基和 MTT 的应用
宽口预灭菌吸头（250 µl），Rainin 货号 HR-250WS（或同等产品）粘性、半固体材料及悬浮液的应用
8 盎司/220 毫升样本容器，Falcon 货号 3540200（或同等产品）组织清洗
无菌一次性注射器（例如 1 ml 结核菌素注射器 Omnifix-F，B. Braun Melsungen AG，货号 9161406V递送约 50 mg 固体材料（可选）
Ted Pella 微量刮刀/药匙，Ted Pella 公司，货号# 13504（或同等规格的尖勺或骨刮匙）， 例如 Aesculap，编号：FK 623递送约 50 mg 固体材料
Ca++ 和 Mg++ 无钙杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate buffered saline, Ca++Mg++无钙镁DPBS：  Sigma-Aldrich，货号 D5652（或同等产品）检测过程中组织的冲洗 
无菌去离子水，组织培养级（生物学纯度或同等质量）用作阴性对照
96孔平底板，Falcon（或同等产品）用于测定OD
棉签（无菌）用于干燥组织表面（可选）
胶带或Parafilm 覆盖培养板以进行甲臜提取
MTT-100 检测试剂盒含有 MTT-噻唑蓝四氮唑溴盐试剂（Sigma #M-5655）和异丙醇提取液。 

表2： 执行EIT所需的设备和材料。

  1. 在无菌条件下，打开装有 RhCE 组织的塑料袋，取出无菌纱布。检查所有组织在琼脂糖凝胶与插入物之间是否存在气泡。若插入物下方有气泡覆盖超过 >50% 的插入物面积、组织存在缺陷或组织被液体完全覆盖，则不得使用这些培养物。
  2. 用测试物品或对照品代码及暴露时间标记 6 孔板。将约 37 °C 预热的 1.0 ml 检测培养基（随试剂盒提供）分装至已预先标记的 6 孔板的各孔中。
  3. 使用无菌镊子取出含有 RhCE 组织的每个插入物，并将其放入已标记的 6 孔板中。在此步骤中，通过在无菌滤纸上轻轻吸拭，去除附着在插入物外侧的任何残留运输用琼脂糖。释放插入物下方困住的任何气泡。
  4. 将 RhCE 组织在 6 孔板中于标准培养条件（SCC，37 ± 1 °C，5 ± 1% CO2 的湿润环境）下预孵育 1 小时。
  5. 1 小时后，将检测培养基更换为 1.0 ml 预热至 37 °C 的新鲜检测培养基，并在 SCC 条件下继续孵育 RhCE 组织（过夜 = O/N） （16–24 小时）。

2. 预处理——第1天

  1. 经过过夜 孵育后，使用适当的移液装置加入 20 µl 无 Ca2+ Mg2+ 的杜氏磷酸缓冲盐水（DPBS，已提供）。如果 DPBS 未覆盖整个组织表面，可轻轻敲击插入物所在的培养板，确保 DPBS 润湿全部组织表面。
  2. 将 RhCE 组织在 SCC 条件下孵育 30 ± 2 分钟。
    注意：此步骤对于组织水合作用以及模拟 in vivo 环境条件是必要的。

3. 测试材料暴露程序 

  1. 将每种受试物及对照品分别施用于两份RhCE组织（n = 2）。液体和固体受试物的给药程序不同。使用移液器在体外皮肤模型上局部施用50 µl液体受试物，暴露时间为30分钟。使用已校准的平勺（可容纳50 mg氯化钠）施用50 mg固体受试物，暴露时间为6小时。
    注：液体定义为可通过移液装置施用的流体物质（例如，液体、凝胶和乳膏）；固体定义为无法通过移液器施用的非流体物质（例如，粉末、树脂状或蜡状材料）。
    1. 若受试物的物理状态不易判断，可将装有受试物的试管置于37 °C水浴中15分钟。对于在37 °C下熔化的受试物，应按照液体受试物的操作流程进行处理。
    2. 对于特别粘稠的材料，应使用正向置换移液器。
  2. 先施用阴性对照和阳性对照，再施用受试物。
    1. 使用标准移液器将50 µl阴性对照（NC）和阳性对照（PC）施用于RhCE组织。阴性对照为无菌去离子水；阳性对照为乙酸甲酯（CAS# 79-20-9）。测试液体受试物时，NC和PC的暴露时间为30分钟 ；测试固体受试物时，暴露时间为6小时。

4. 试验物品暴露——第1天

  1. 对于液态测试样品的处理，请遵循以下步骤 给定的时间表 表3静置1分钟 每次施用各试验物品之间的间隔应保持一致，以确保所有组织暴露条件相等。
    1. 30 ± 2 分钟后 DPBS 预处理后，使用适当的移液装置将 50 µl 的 NC 和 PC 以及每种液态受试物分别局部施用于 RhCE 组织。
    2. 将50 µl液态受试物直接施加于组织表面，确保覆盖其上表面。对于黏稠物质，应剪断移液器吸头的尖端以扩大开口。对于高黏性物质，先将受试物涂抹于给药装置（直径略小于组织插入孔内径的平头圆柱体或塑料图钉）上，然后将该装置倒置并放置在组织上，使受试物均匀接触组织表面。
    3. 如果受试物品未能在组织表面扩散，请轻轻敲击插入物，以确保其覆盖整个组织表面。受试物品的机械扩散（例如，使用移液器吸头）不推荐，因为它可能会损坏组织。
    4. 在SCC中孵育组织30 ± 2分钟。
  2. 对于固体测试样品的处理——第1天，遵循所提供的时序安排 表4静置2分钟 每次施用各测试物品之间的间隔应确保所有组织暴露条件一致。
    1. 30 ± 2 分钟后 DPBS 预处理后，使用适当的移液装置将 50 µl 的 NC 和 PC 分别局部施加于 RhCE 组织上。
    2. 对于固体测试样品的应用，从孔中取出插入物（n = 2），并将其置于无菌表面例如，多孔板的盖子）以避免受试物品溢出到培养基中。
    3. 使用刻度勺，将约 50 mg 的受试物定量涂抹于组织表面；确保组织表面完全被受试物覆盖。如果受试物未能在组织表面均匀铺展，可轻轻左右摇晃小室插件，以确保组织表面完全被受试物覆盖。禁止通过机械方式摊铺受试物（例如，使用移液器吸头）不推荐，因为它可能会损坏组织。
      1. 如有需要，使用研钵和研杵研磨结晶粉末，以确保受试物与组织之间更好的接触。
      2. 或者，使用剪掉头部的1 ml注射器，将粉末直接施加到插入物内的组织培养物上。将活塞向后拉，把粉末装入注射器，然后通过下压活塞进行施加。
      3. 如果插入件的外壁被污染 例如，若为粉末状，用无菌纱布擦去颗粒。
    4. 给药后，将组织放回含有培养基的6孔板中，在SCC条件下孵育6小时±15分钟。

5. 漂洗

  1. 为每种测试样品准备三只洁净的烧杯（容量150 ml），每只烧杯中加入100 ml DPBS。每种测试样品使用各自独立的三只烧杯。
  2. 30 ± 2 分钟结束时 液体材料暴露时间为6小时 ± 15分钟 对于固体材料的暴露，若使用了给药装置，则移除并丢弃该装置。
  3. 用精细镊子夹住塑料“环”上缘，将含有 RhCE 组织的插入物从培养基中取出。使用弯头镊子以方便操作和倾倒。用镊子夹住两个插入物的环部，将组织两两一组进行冲洗。注意避免镊子损伤组织。
  4. 将测试物品或对照品从组织表面倾倒至洁净的吸水材料（纸巾、纱布）上， 等等。)
  5. 将小室浸入第一个烧杯的DPBS中，以圆形轨迹轻轻摇动约2秒，提起小室使其内部基本充满DPBS，然后将液体倒回烧杯中。在第一个烧杯中重复此操作三次。
  6. 用同样的方法，在第二和第三个烧杯的DPBS中分别冲洗插入物各三次。
  7. 将插入物中残留的任何液体倾倒至吸水材料上。将插入物旋转至约45°角（开口端向下），并使其上缘接触吸水材料。
    注意：如果无法去除所有可见的测试材料，则不应进一步冲洗，以避免因过度操作而导致组织损伤。

6. 浸泡后处理

  1. 清洗后，立即将组织浸入已预先温育至室温的 5 ml 检测培养基中，置于预先标记好的 12 孔板内。
  2. 将组织在室温下孵育，液体材料孵育 12 ± 2 分钟 ，固体材料孵育 25 ± 2 分钟 ，以促进去除任何残留的受试物。

7. 孵育后处理

  1. 在浸润后孵育阶段结束时，将检测培养基从组织中倾出，并将插入物置于吸水材料上轻轻吸干。
  2. 将插入物转移至预先标记的6孔板中，每孔含1 ml预热的检测培养基。
    1. 对于液态受试物，在标准培养条件下孵育组织120 ± 15分钟 。
    2. 对于固态受试物，在标准培养条件下孵育组织18 ± 0.25小时。

8. MTT 细胞活力检测——第1天（液体样本操作步骤）和第2天（固体样本操作步骤） 

  1. 在孵育后120 ± 15分钟内进行MTT实验 液体为 18 ± 0.25 小时，固体为 18 ± 0.25 小时。
  2. 配制1.0 mg/ml的MTT溶液，并将0.3 ml该溶液分装至预先标记的24孔板的每孔中。
    1. 使用商用 MTT 试剂盒（表5):
    2. 使用前2小时，将MTT浓缩液在室温下解冻。取2 ml MTT浓缩液与8 ml MTT稀释液混合，配制成1.0 mg/ml的MTT溶液。
    3. 将MTT溶液于4 °C避光保存，直至使用。MTT溶液存放时间不得超过1天。
  3. 孵育结束后，从6孔板中取出每个插入式培养小室，并在吸水材料上轻轻吸去多余液体。
  4. 将小室插入含有0.3 ml MTT溶液的24孔板中。释放插入物下方困住的气泡。将培养板孵育180 ± 10分钟。 在中国台湾。
  5. MTT提取
    1. 180 ± 10 分钟后 在 MTT 溶液中孵育后，从 24 孔板中取出每个插入物，并将其底部在吸水材料上轻轻吸干。
    2. 对于非着色液体测试样品（浸没提取）：将插入物转移至预先标记的24孔板中，加入2.0 ml提取剂溶液（异丙醇），使插入物完全浸没。
    3. 对于固体和液体着色剂（为避免萃取液污染，采用非浸没式萃取）：将小室转移至预标记的6孔板中，每孔加入1.0 ml萃取液（异丙醇），确保萃取液不浸没小室。
      注意：对相应的阴性对照和阳性对照执行相同的非浸没提取操作。
  6. 密封培养板（例如， 用封口膜（Parafilm）覆盖在板盖与孔上缘之间，或使用标准板封膜密封。将酶标板置于轨道摇床上，室温下振荡2至3小时，以充分溶解MTT。
    1. 或者，在 2–8 °C 避光条件下过夜提取，不进行震荡。
  7. 对于非着色液体测试样品（浸没提取）：提取期结束后，将每个插入物中的液体重新倒回孔中，随后丢弃带有重组人表皮（RhCE）组织的插入物。
    1. 将提取液混匀，按照96孔板的预设布局，分别取两份各200 µl的等分试样，转移至相应的孔中图2).
  8. 对于固体和液体着色剂（非浸入式提取）：提取期结束后，弃去组织（注意不要刺穿组织）。
    1. 向含有组织提取液的24孔板的每个孔中加入1.0 ml提取液。混匀提取液后，根据板式布局，将两份200 µl的等分试样转移至预先标记好的96孔板的相应孔中（图2).
  9. 使用酶标仪或分光光度计，在550至590 nm之间的单一波长下测定提取样品的光密度（OD）值（实验室内部应保持一致）。
    1. 若提取液因不溶性固体而浑浊，应在测量OD前对溶液进行离心处理（将离心机冷却至4 °C以避免蒸发）。若冲洗无法去除受试品（TA），且该受试品干扰MTT还原反应，则必须增设额外对照组。有关校正MTT还原的详细操作，请参阅标准操作程序（SOP）16.
    2. 如果待测物被证明具有颜色或在实验过程中产生颜色，且该颜色可能干扰MTT检测，则必须额外进行测试，以确定与组织结合后又被提取出的颜色量。请参考详细的标准化操作程序（SOP）以校正有色测试物质的影响16.

9. 组织活力检测的计算（表6和图3） 

  1. 常规计算
    1. 计算每次实验中空白对照孔的平均吸光度值（OD Blk）。
    2. 从同一次实验的每个吸光度值中减去 OD Blk（空白校正数据）。
    3. 计算每种组织两个等分试样的平均值（= 校正后 OD）。
  2. 相对于平均阴性对照（100% 对照），计算每个对照和待测样品的两个重复组织的存活率（%）。
    存活率（%）= [处理组织的校正后 OD / 阴性对照的校正后 OD] × 100%
  3. 计算存活率的差值（两个重复组织之间存活率的差异）。
  4. 计算待测样品的平均存活率（TA 存活率），并根据预测模型对样品进行分类。

10. 预测模型（图3）

  1. 若TA处理组织的存活率相对于NC处理组织的存活率>60.0 ，则将测试样品标记为无刺激性（NI）（GHS 无类别）。
  2. 若TA处理组织的存活率相对于NC处理组织的存活率 ≤ 60.0 ，则将测试样品标记为有刺激性（I）（GHS 第1类和第2类）。
    注：若满足以下条件，则认为EIT测试结果合格：
    • EIT NC OD >0.8 且 <2.5；
    • EIT PC 组织存活率（相对于NC的%）≤50.0%；
    • 两个重复组织（NC、PC和测试样品）之间的差异<20.0%。 

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用10个测试物品（TA）以及阴性和阳性对照进行的代表性EIT结果见表6和图3。阴性对照（NC）的平均OD值为1.31，对应100%的组织活性，因此阳性对照（PC）（平均OD值为0.41）的相对组织活性为31.2%。当在7个实验室采用液体暴露方案进行15次有效的独立实验，以及在4个实验室采用固体暴露方案进行8次独立有效的实验时，使用液体方案的阳性对照平均组织活性为36.4±4.0%，固体方案为32.3±6.4%。在所有情况下，阳性对照的结果均低于60.0%的判定阈值15。

如图3所示，TA1、TA2、TA4、TA7和TA8的组织存活力>60.0%，因此被归类为“无刺激性（NI）”。TA3、TA5、TA6、TA9和TA10的组织存活力≤60.0%，因此被归类为“有刺激性（I）”。除TA2外，所有测试样品的重复组织间组织存活力差异均<20.0%。因此，除TA2外，所有测试样品的结果均被视为“合格”，因其满足所有眼刺激性试验（EIT）的接受标准（第10.2节）。由于TA2在初次实验中重复组织间的变异性较高，需进行第二次实验以获得合格的EIT结果。

本文所述利用RhCE组织模型的EIT测试方法已在多项多实验室验证研究中用于评估眼刺激性，其中包括经EURL ECVAM/Cosmetics Europe正式验证15,17-19。在所有研究中，EIT均表现出良好的可重复性，并能够准确识别根据联合国GHS无需进行眼刺激或严重眼损伤分类和标签的化学品（包括单一物质和混合物）15,17-19。EIT测试方法在敏感性、特异性和总体准确性方面均满足验证管理组（VMG）对眼刺激性的接受标准，目前正待正式实施，作为部分替代in vivo 兔子Draize试验的方法19。

MTT实验流程图，比较液体和固体处理物在孵育步骤中的差异。
图1：液体和固体测试样品的EIT实验方案示意图。 使用的缩写：AM，检测培养基；SCC，标准培养条件；PBS，Dulbecco磷酸盐缓冲液；RT，室温。

用于组织样本分析的微孔板布局图，显示对照组和测试样本的分布。
图 2： MTT 组织活力试验的标准 96 孔板配置。 将两份 200 µl 的样品分别转移至已预先标记的 96 孔板中的相应孔位。所用缩写：NC，阴性对照；PC，阳性对照；TA1-TA20，测试样品 1-20；Blank，浸提液。该 96 孔 MTT 板配置需配合专门设计的 Excel 电子表格，用于计算 RhCE 组织活力和 EIT 结果。

显示统计数据的柱状图；紫色柱体，红色阈值线，误差线；实验结果。
图3： 使用RhCE组织模型获得的10种测试样品、阴性对照（NC）和阳性对照（PC）的EIT结果。 该图表由专门用于呈现EIT结果的Excel电子表格生成。与阴性对照相比，使组织存活率降低至≤60.0%的测试化学品被归类为刺激物（“I”，TA3、TA5、TA6、TA9和TA10），而组织存活率>60.0%的测试化学品则被归类为非刺激物（“NI”，TA1、TA2、TA4、TA7和TA8）。

EIT 方案操作步骤的起始时间（一名操作者一天的工作安排）
每一行对应一对组织样本
操作步骤顺序：1234567
液体处理：PBSTA
处理		处理后
浸泡		处理后
孵育		MTT
反应		MTT
提取		测定
30 分钟30 分钟12 分钟120 分钟180 分钟120 分钟OD
NC9:009:3010:0010:1212:1215:12之后
PC9:019:3110:0110:1312:1315:1317:30
TA-19:029:3210:0210:1412:1415:14
TA-29:039:3310:0310:1512:1515:15
TA-39:049:3410:0410:1612:1615:16
TA-49:059:3510:0510:1712:1715:17
TA-59:069:3610:0610:1812:1815:18
TA-69:079:3710:0710:1912:1915:19
TA-79:089:3810:0810:2012:2015:20
TA-89:099:3910:0910:2112:2115:21
TA-99:109:4010:1010:2212:2215:22
TA-109:119:4110:1110:2312:2315:23

表3： 液体测试物品的示例时间安排。 实验步骤包括用DPBS预润湿组织、施加测试物品（TAs）、冲洗与浸泡后处理、孵育后阶段、MTT检测、MTT提取以及MTT光密度（OD）测定，以上内容以列的形式列出。重复组织的时间安排以行的形式组织。整个实验包括10个测试物品及对照组，可在一天内完成。

EIT 实验方案步骤的起始时间（一名操作人员需工作两天）
每一行对应一对组织样本
第1天第2天（次日）
步骤顺序：1234567
固相处理：PBSTA
处理		处理后
浸泡		处理后
孵育		MTT
反应		MTT
提取		测定
30 分钟6 小时26 分钟18 小时180 分钟120 分钟OD
NC9:009:3015:3015:569:5612:56之后
PC9:029:3215:3215:589:5812:5815:30
TA-19:049:3415:3416:0010:0013:00
TA-29:069:3615:3616:0210:0213:02
TA-39:089:3815:3816:0410:0413:04
TA-49:109:4015:4016:0610:0613:06
TA-59:129:4215:4216:0810:0813:08
TA-69:149:4415:4416:1010:1013:10
TA-79:169:4615:4616:1210:1213:12
TA-89:189:4815:4816:1410:1413:14
TA-99:209:5015:5016:1610:1613:16
TA-109:229:5215:5216:1810:1813:18

表4：固体测试样品的示例时间安排。 实验步骤包括用DPBS预润湿组织、测试样品施加、冲洗与后续浸泡、孵育后阶段、MTT检测、MTT提取以及MTT光密度（OD）测定，列于表格的列中。重复组织的时间安排列于行中。整个实验共测试10个测试样品及对照，持续两天完成。

用量试剂储存条件来源描述有效期
1 小瓶，
 2 ml 		MTT 浓缩液 (MTT-100-CON)避光保存 (-20ºC)MatTek冷冻的 MTT 浓缩液2 个月
1 小瓶，
8 ml 		MTT 稀释液2-8ºCMatTek用于 MTT 检测前稀释 MTT 浓缩液2 个月
1 瓶，
 60 ml		异丙醇
(CAS #67-63-0)		室温Sigma-Aldrich提取溶液不适用

表5： MTT-100 检测试剂盒组分。

编号组织原始数据空白校正后数据OD 均值存活率 (%)
n样品 1样品 2样品 1样品 2
NC11.3161.3521.3161.3521.334101.6
21.2771.3091.2771.3091.29398.4
PC10.3790.3970.3790.3970.38829.6
20.4190.4420.4190.4420.43132.8
TA111.2131.2441.2131.2441.22993.5
21.3551.3551.3551.3551.355103.2
TA211.2101.1221.2101.1221.16688.7
20.8280.8370.8280.8370.83363.4
TA310.1670.1680.1670.1680.16712.7
20.1380.1360.1380.1360.13710.4
TA411.1371.1601.1371.1601.14987.4
21.2621.1911.2621.1911.22793.4
TA510.6100.6210.6100.6210.61646.9
20.4800.4840.4800.4840.48236.7
TA610.5020.5130.5020.5130.50838.7
20.3960.4070.3960.4070.40230.6
TA711.0481.0501.0481.0501.04979.9
21.1491.1501.1491.1501.15087.5
TA811.0321.0341.0321.0341.03378.7
20.9410.9350.9410.9350.93871.4
TA910.0220.0220.0220.0220.0221.7
20.1440.1490.1440.1490.14711.2
TA1010.1500.1500.1500.1500.15011.4
20.2540.2550.2540.2550.25519.4
平均值差值存活率 [%] 的平均值存活率差值差值/2分类
OD 平均值OD 差值存活率 [%]存活率差值
NC1.3140.041100.03.121.56NI合格
PC0.4100.04331.23.231.62I合格
TA11.2920.12798.39.634.81NI合格
TA20.9990.33376.125.3612.68NID>20
TA30.1520.03011.62.321.16I合格
TA41.1880.07890.45.942.97NI合格
TA50.5490.13441.810.165.08I合格
TA60.4550.10634.68.074.03I合格
TA71.1000.10183.77.653.82NI合格
TA80.9860.09575.07.233.62NI合格
TA90.0850.1256.49.484.74I合格
TA100.2030.10515.47.953.98I合格

表6： 10种测试样品及阴性对照（NC）和阳性对照（PC）的EIT实验结果。 表格由专门设计用于计算组织存活率和EIT结果的Excel电子表格生成。相对于阴性对照，使组织存活率降低至≤60.0%的受试化学品被判定为刺激物（“I”，TA3、TA5、TA6、TA9和TA10）；而组织存活率>60.0%的受试化学品则被判定为非刺激物（“NI”，TA1、TA2、TA4、TA7和TA8）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了为 EpiOcular 组织模型开发的眼刺激测试（图1）。该眼刺激测试（EIT）能够以高灵敏度和特异性将眼刺激物和腐蚀物（GHS 第1类和第2类合并）与无需标签标识的物质（GHS 无类别）区分开来17.。本文所述的 EIT 无法区分 GHS 第1类与第2类化学品。该测试已针对多种化学品（包括化妆品和药品成分）的眼刺激潜力分类与标签应用进行了验证。结合其他体外测试方法，EIT 将可替代传统的动物体内兔眼刺激试验。

EIT 对液体和固体材料采用两种相似但不同的方案，其区别在于暴露时间及暴露后孵育时间的长短（图1）。EIT 所采用的终点指标是组织活力，通过 MTT 法测定，该方法此前已在经过验证的人类上皮组织模型中使用过20,21。进行此实验时，除标准的细胞培养设备外，无需特殊仪器。由于组织间具有高度的可重复性，本实验采用 n = 2 的组织样本量，而非通常推荐的 n = 3。能够使用 n = 2 的组织样本是本方案的关键特征之一，因为它允许经验丰富的操作人员同时处理两个组织，从而最大限度地减少因单独处理各个组织而可能引起的实验变异14。此外，通过每个测试样品使用 n = 2 的组织，可在一次试剂盒（24 个组织）中完成对 10 种相同物理状态（液体或固体）的测试物质以及阳性和阴性对照物的刺激性评估。

确保材料可靠分类的其他关键点包括：阳性对照物质的规定（组织活性 ≤50.0%）、重复组织之间的可重复性（差异 <20.0%）以及阴性对照的光密度读数（>0.8 且 <2.5）。

进行EIT测试时，必须严格遵守已验证的实验方案以及建议的给药和冲洗时间表（表3和表4），因为偏离方案或改变孵育时间可能导致结果发生变化。同样，若MTT孵育时间偏离3小时，将导致不同的MTT读数，并可能影响检测结果。

有时，受试化学物可能具有光学或其他特性，会干扰 MTT 组织活力检测，或导致 MTT 的还原。例如，受试化学物可能直接将 MTT 还原为蓝紫色反应产物，或本身为有色物质，在与 MTT 噻唑蓝（~570 nm）相同的光吸收范围内吸收光线。然而，只有当 MTT 检测时仍有足量该物质残留在组织表面或被组织吸收，才会产生干扰问题。为避免此类干扰，EIT 方案中已纳入充分的冲洗步骤。如果冲洗无法去除受试物（TA），且该受试物干扰 MTT 的还原，则必须使用额外的对照来检测并校正干扰。简言之，若怀疑受试化学物可直接还原 MTT，则应将 50 µl（固体为 50 mg）该化学物与工作浓度的 MTT 溶液在 SCC 条件下孵育 3 小时（同时平行运行阴性对照 NC，即 50 µl 无菌去离子水）。若 MTT 溶液变为蓝紫色，则表明该受试物已还原 MTT。此时，应使用冻融灭活的组织对照进行功能性检查，以评估受试物是否与组织结合并导致假性的 MTT 还原信号。若在受试物处理的灭活组织对照中观察到明显的 MTT 还原（相对于未处理的活组织中的还原量），则受试物的平均组织活力必须通过减去灭活对照的平均活力值进行校正。

EIT 在安全性方面采取保守策略，这由其假阴性分类率较低的结果所证实14,15,18. 重要的是，在本项检测中，所有属于 GHS 1 类的化学物质（对眼睛具有腐蚀性，代表最严重的眼部危害）均未被归类为无刺激性14,15,18,19。最后，RhCE in vitro 体外测试方法的主要优势之一在于能够直接测试未稀释的液体和固体材料（而二维浸没式细胞培养则无法实现这一点）。

EIT 将  根据联合国GHS分类和标签系统，对多种材料的眼刺激潜力具有重要评估作用。多年来，毒理学研究一直致力于寻找动物实验的替代方法来确定眼毒性。EIT测试方法于2014年完成了由EURL ECVAM支持的正式验证研究，EpiOcular EIT已被纳入OECD测试指南，编号为OECD TG 492 2015年。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文的出版费用由 MatTek Corporation 支付。作者为 MatTek Corporation 的员工。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者谨此感谢 John Harbell 博士在眼刺激试验项目中提供的科学支持与时间投入。作者还感谢德国拜尔斯道夫公司（Beiersdorf AG）、美国体外科学研究所（IIVS）、美国玫凯公司（Mary Kay Inc.）、美国雅芳产品公司（Avon Products Inc.）、瑞士宝洁公司/科思美特公司（Procter & Gamble/Cosmital）、法国皮埃尔·法伯实验室（Laboratoire Pierre Fabre）、英国哈兰实验室（Harlan Laboratories）、法国路威酩轩香水集团（LVMH Parfume）参与眼刺激试验的多中心国际预验证与验证研究15。

参考文献

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MTT

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