小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

摘要

从头脂肪生成和β-脂肪酸氧化是肝细胞中的关键代谢途径，这些途径在多种代谢性疾病（包括脂肪肝病）中发生紊乱。本文中，我们演示了小鼠原代肝细胞的分离，并描述了β-脂肪酸氧化和脂肪生成的定量方法。

摘要

肝脏中的脂质代谢十分复杂。除了通过脂蛋白进行脂质的摄取和输出外，肝细胞还可通过脂肪酸氧化来分解脂质，或通过从头脂质生成（de novo lipogenesis）合成新的脂质。这些代谢通路的净效应受多种因素调控，在某些疾病状态下可导致脂肪肝病的发生。肝脏内过量的脂质积聚与全身性胰岛素抵抗及冠心病密切相关。研究肝细胞脂质代谢的工具对于理解肝脏脂质代谢在特定代谢紊乱中的作用具有重要意义。

在肝脏中，肝细胞通过β-脂肪酸氧化调控脂肪酸的分解与合成 从头合成 脂质生成。对这些通路中的代谢进行定量分析有助于深入了解肝脏对脂质的处理过程。与 体外 定量分析，使用原代肝细胞，进行测量 体内 在技术上具有挑战性且资源消耗较大。因此，定量β-脂肪酸氧化和 从头合成 在培养的小鼠肝细胞中研究脂质生成是评估肝细胞脂质代谢的简便方法。

本文介绍了一种分离原代小鼠肝细胞的方法，并展示了利用放射性标记底物定量β-脂肪酸氧化和从头脂肪生成的方法。

引言

非酒精性脂肪性肝病是西方化社会中肝病的主要病因之一^1,2肝脏内脂质蓄积通过尚不明确的机制与细胞死亡、纤维化及肝功能衰竭相关^3-6在脂肪肝疾病中，肝细胞介导的β-脂肪酸氧化和 从头合成 脂质生成是净脂质积累的重要决定因素^7,8因此，本文将重点介绍肝细胞的分离，随后进行β-脂肪酸氧化的定量分析 从头合成 脂质生成

已开发出多种方法用于研究肝细胞脂质代谢。尽管可以测定脂肪代谢 体内 使用稳定同位素^9,10这些方法成本较高，且需要使用大量动物。此外，由于其性质所限，对外源性化学物质效应的研究能力也受到限制 体内 实验。相比之下，从小鼠肝脏中分离原代肝细胞为研究提供了一条经济可行的途径¹¹此外，在培养的肝细胞中进行研究可使研究人员在规避活体实验困难的同时，研究不同化学物质对脂质代谢的影响。 体内 实验。最后，由于分离的肝细胞来源于单个动物的肝脏，因此可避免因遗传差异带来的干扰。

本文中，我们分离并培养肝细胞，并利用放射性标记的棕榈酸测定β-脂肪酸氧化和从头脂质生成。de novo 脂质生成的测定方法如下所述，该方案简明、有效且可重复。

方案

所有动物实验均应遵循地方和联邦法规，并获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）及辐射安全管理部门的批准。

1. 准备

1. 在实验开始前数天，将500 ml解冻 一瓶肝消化培养基（LDM）并重新冷冻约35 ml 50 ml 分装液 锥形管。于 -20 °C 保存，直至使用。
2. 实验前一天，使用高压灭菌器对洁净的解剖工具进行预灭菌。
3. 在检测当天，用胶原处理所需数量的24孔培养板。
   1. 混合1份3 mg/ml的溶液 大鼠尾胶原与50份PBS混合。加入约500 µl 向24孔板的每孔中加入胶原溶液，室温（RT）孵育3-5分钟。移除胶原溶液，将板置于生物安全柜中晾干。至少重复此步骤一次。
      注意：胶原包被可提前一周完成，包被后的培养板用塑料膜密封后于4 °C保存。
4. 准备LDM用于检测：将LDM解冻并升温至37 °C，使用1 N KOH调节pH至7.4。用0.2 µm注射器滤器过滤后，置于循环42 °C水浴中。
5. 预热 25 ml 将肝灌注培养基在循环水浴中加热至 42 °C。
6. 制备90%聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅溶液：加入1 ml 10倍浓度DPBS溶液1 ml加至9 ml 用聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅。使用0.1 N HCl调节pH至7.4。用无菌0.2 µm注射器滤器过滤。室温保存。
7. 将铺板培养基预热至 37 °C。

2. 小鼠原代肝细胞的分离

1. 安装蠕动泵、管路和解剖台：用 5 ml 70% 乙醇（溶于蒸馏水中）冲洗管路进行消毒，随后用 10 ml 无菌水冲洗。将管路置于肝脏灌注培养基中，启动泵使整个管路充满培养基。
2. 采用机构批准的方法处死小鼠。
3. 打开腹腔：在小鼠腹部大量喷洒 70% 乙醇。使用钝头剪刀沿腹部中线切开皮肤至整个腹部长度，并向两侧翻开。在腹膜上做类似切口以暴露内脏。
   1. 使用钝器轻轻移开肠道，暴露腹部血管系统。找到腹部下腔静脉（IVC），并在肾静脉远端的血管下方穿一根缝线。
4. 在缝线远端，将针头和导管插入下腔静脉（IVC），并推进至超过缝线水平。保持针头位置不变，将缝线绑在导管周围以固定导管。小心取出针头。若操作正确，血液将流经导管。
5. 使用移液器将灌注培养基填充至导管剩余空间，确保无气泡存在。极其小心地将管路连接到导管上。
6. 打开胸腔：轻轻上翻肝上叶以暴露膈肌。用尖头剪刀小心刺破膈肌，然后做侧向切口以暴露胸膜腔，注意避免损伤胆囊和胸膜血管。在肝静脉近端处的胸段下腔静脉上放置一个血管夹（ bulldog clamp）。
7. 剪开门静脉，并以 3 - 4 ml/min 的流速启动泵。使用约 20 ml 灌注培养基对肝脏进行 5 分钟的灌注。
   注意：肝脏应立即由红色变为灰/褐色。若肝脏部分区域仍呈红色，可能提示灌注不良，成功分离的可能性将显著降低。灌注过程中需特别注意避免培养基耗尽或气泡进入管路。
8. 完成 5 分钟灌注后，停止泵运行，并将管路切换至肝脏消化培养基。重新启动泵，继续灌注 10 - 15 分钟（直至培养基耗尽）。
9. 灌注结束后停止泵运行。此时肝脏应呈粉红色且略有肿大。通过精细解剖切除肝脏。去除胆囊，并将肝脏转移至 10 cm 组织培养皿中。
10. 在生物安全柜中，向肝脏中加入 10 ml 贴壁培养基（表 1）。使用镊子或手术刀轻轻刮取肝脏以释放肝细胞。用 100 µm 细胞滤网过滤悬液，并转移至 50 ml 离心管中。用额外的 10 ml 贴壁培养基冲洗培养皿，并将冲洗液合并至 50 ml 离心管中。
11. 在 350 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
12. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 ml 贴壁培养基中，再加入 10 ml 90% 聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅。轻轻混匀后，按步骤 2.11 的条件离心。离心后，死细胞将漂浮在混合物上层，而活细胞则沉淀至底部。
13. 吸除上层死细胞及上清液。用 20 ml 贴壁培养基洗涤两次，每次均按步骤 2.11 的条件离心。
14. 将细胞重悬于 10 ml 贴壁培养基中。使用血细胞计数板计数细胞，并将 9 × 10⁴ 个细胞/孔接种于胶原处理过的 24 孔培养板中。在 37 °C 组织培养箱中孵育 2 小时。每块培养板可用于脂肪酸氧化测定或脂质生成测定。
15. 可选：更换为维持培养基（表 1），并在 37 °C 继续培养。细胞可在不影响检测结果的情况下培养 2 - 3 天。

3. 脂肪酸氧化测定

警告：使用放射性物质可能存在危险。放射性材料的采购、储存、操作和处置均须遵循机构、州和联邦的法规与指南。

1. 实验前 16 - 20 小时，用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次。将细胞更换至无血清的饥饿培养基（表 1），其中加入 20 nM 胰高血糖素，并在 37 °C 下过夜孵育。
   注意：由于胎牛血清中含有未知浓度的代谢激素（例如胰岛素、胰高血糖素），需对细胞进行血清饥饿处理，以消除这些激素对实验可能产生的干扰。细胞在饥饿培养基中可存活超过>24 小时。胰高血糖素处理用于刺激肝细胞内的脂肪酸氧化。
2. 实验当天早晨，配制预孵育培养基：将适量棕榈酸钠溶于超纯水中，配制成 100 mM 溶液，并在 70 °C 加热 10 分钟。同时，准备所需量的 DMEM 培养基（每 24 孔板孔 0.5 ml ），其中含 25 mM HEPES、1% BSA 第五组分和 20 nM 胰高血糖素，并加热至 37 °C。
   1. 待棕榈酸钠完全溶解后，将其加入上述培养基中，终浓度为 250 µM。将肝细胞更换至预孵育培养基，在 37 °C 孵育 2 小时。保留部分预孵育培养基于 37 °C 以备后续使用。
3. 在孵育期间，通过氮气吹干适量的¹⁴C-棕榈酸（每孔 0.5 µCi）。
   1. 例如，若需检测 24 孔板中的 24 个样品，可将 120 µl 浓度为 0.1 µCi/ml 的¹⁴C-棕榈酸转移至 1.5 ml 离心管中。在通风橱中，从距离液面 3-5 cm 处缓慢通入氮气，吹除乙醇溶剂。溶剂约在 30 - 40 分钟内完全蒸发，管底将留下干燥的¹⁴C-棕榈酸。
4. 在预孵育结束前约 15 分钟 ，用 0.1 N NaOH（每 µCi 12.5 µl）重悬¹⁴C-棕榈酸，在 70 °C 孵育 10 分钟。加入三倍体积的预热预孵育培养基，通过移液器反复吹打混匀。
5. 向每孔加入 25 µl 稀释后的¹⁴C-棕榈酸。轻轻摇动培养板混匀，于 37 °C 孵育 90 分钟。此即为实验板。
6. 在孵育期间，准备滤纸板（图 1）。
   1. 取下无菌 24 孔板的盖子，在每个孔底部放置一片 2 cm × 2 cm 的滤纸。将一张 4” × 7” 的 Parafilm 膜覆盖在板上。
   2. 使用较大的矩形物体（如移液器吸头盒），在孔位上方按压 Parafilm 膜，使其在孔口处穿孔，同时在其余区域形成密封。移除覆盖在孔口上的穿孔 Parafilm 圆片。此时，除孔口外，整个板表面应被 Parafilm 膜紧密覆盖。
7. 在孵育结束前 10 分钟，向滤纸板的每孔加入 200 µl 3 N NaOH，确保滤纸完全吸收液体。
   1. 可选：在冷冻前，将培养基转移至新的 24 孔板。用 PBS 洗涤一次后，用 0.1 N HCl 裂解剩余细胞，并通过 BCA 法测定蛋白含量。
8. 孵育结束后，立即用液氮速冻实验板。操作时需确保每孔完全冻结后再进行下一步。
9. 向实验板的每孔加入 100 µl 70% 高氯酸。立即盖上滤纸板，将两板置于轨道摇床上，在室温下以 80 rpm 摇动 2 小时。
10. 孵育结束后，处理样品：
    1. 为测定 CO₂ 组分，将滤纸方块转移至含有 4 ml 液体闪烁液的闪烁瓶中，检测¹⁴C 信号。
    2. 为测定酸溶性物质，取 400 µl 培养基转移至 1.5 ml 微量离心管中。最大转速离心 10 分钟。取 100 µl 上清液加入 500 µl 2:1 氯仿-甲醇（v/v）中，短暂涡旋混匀。
       1. 向混合物中加入 250 µl 水，再次涡旋混匀。在 3,000 × g 离心 10 分钟。取 200 µl 上层相转移至含 4 ml 液体闪烁液的闪烁瓶中，检测¹⁴C 信号。

4. 脂质生成检测

1. 开始实验前一晚，用预热的 PBS 洗涤细胞 2 次。将肝细胞更换为含 100 nM 胰岛素的无血清培养基。于 37 °C 培养过夜。
   注意：由于胎牛血清中含有未知浓度的代谢激素（例如胰岛素、胰高血糖素），需对细胞进行无血清饥饿处理，以消除这些激素对实验可能产生的干扰。细胞在无血清培养基中可保持活性超过>24 小时。本实验中使用胰岛素以刺激脂质生成。
2. 配制脂质生成培养基：在无血清培养基中加入 100 nM 胰岛素、10 µM 冷乙酸盐以及每孔 0.5 µCi ³H-乙酸盐。将细胞更换为此培养基，并于 37 °C 培养 2 小时。可根据需要加入待测化合物。
3. 培养结束后，用 PBS 洗涤细胞 2 次。加入 120 µl 0.1 N HCl 刮取细胞进行裂解。保留 10 µl 用于蛋白定量（通过 BCA 法测定），并将 100 µl 转移至 1.5 ml 微量离心管中。
4. 加入 500 µl 2:1 氯仿-甲醇（v/v）进行脂质提取。短暂涡旋混匀，室温孵育 5 分钟。再加入 250 µl 水，再次涡旋混匀，室温继续孵育 5 分钟。样品于室温以 3,000 × g 离心 10 分钟。小心吸取下层有机相，转移至含有 4 ml 液体闪烁液的闪烁瓶中，测定 ³H 放射活性。

结果

肝细胞分离通常可获得 1 - 3 x 10⁷ 个总细胞。经过过夜培养后，细胞呈六边形，其中许多为双核细胞（图2）。健康的细胞应无颗粒状物或膜泡，这些结构是细胞死亡的标志。

通常，每种测试化合物的脂肪酸氧化实验需进行三到四个重复。CO₂ 样品的计数值大约为酸可溶性物质计数值的五分之一。我们通常将 CO₂ 与酸可溶性物质的比值作为完全氧化程度的衡量指标（即通过三羧酸循环氧化的量）。能够促进细胞呼吸的物质，例如羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP），会使该比值向 CO₂ 方向偏移，表明三羧酸循环（TCA循环）的氧化作用增强。呼吸链抑制剂则会整体降低氧化水平（图3）。在首次开展该实验时，最好设置无细胞对照，以验证实验操作所产生的活性确实来源于细胞特异性反应。

脂肪生成检测通常与零时间点对照（在收获前立即用底物处理的细胞）进行比较。该检测在至少四小时的孵育时间内应呈现与时间的...

讨论

从处死到开始灌注的时间应少于3分钟，以确保肝脏获得理想的灌注效果和胶原酶消化效果。一旦开始使用灌注液进行灌注，肝脏颜色应立即由红色变为苍白。在低钙消化液（LDM）中孵育约10分钟后，肝脏会呈现肿胀且呈粉红色。如果灌注不充分，肝脏可能不会出现这些变化，通常会导致肝细胞收获量降低。

洗涤步骤完成后，分离的肝细胞可在冰上以悬浮状态保存数小时，然后再进行接种。接种后，培养的肝细胞需要数小时才能贴壁并伸展。在贴壁培养基中孵育2小时后，肝细胞仍保持较小且呈圆形。经过过夜孵育后，肝细胞将呈现更具特征性的六边形形态，其中许多细胞为双核。如果细胞制备状态不佳，则会表现出大量颗粒化现象以及偶发的膜泡化，这是细胞死亡的征象。为最大程度维持培养细胞的活力，应每24小时更换一次培养基，并注意尽量减少细胞暴露于开放空气中的时间。

棕榈酸钠在室温下不溶于水，但在70 °C孵育后应完全溶解。恢复至室温会导致脂质迅速固化，因此必须快速操作。一旦棕榈酸钠溶解于预孵育培养基中，必须将培养基保持在37 °C，以维持脂质的溶解状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肝脏灌注培养基	Life Technologies	17701038
肝脏消化培养基	Life Technologies	17703034	分装后于 -20 °C 保存
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
胶原蛋白	Life Technologies	A1048301
聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅	GE Life Sciences	17-0891-01
丙酮酸钠	Cellgro	25-000-CI
青霉素/链霉素	Cellgro	30-001-CI
胰岛素	Sigma	I0516-5ML
地塞米松	Sigma	D2915-100MG
牛血清白蛋白（BSA），第五组分	MP Biomedicals	103703
24孔培养皿	Corning Falcon	353047
Tygon S3 管路	Cole Parmer	06460-34
雄性鲁尔锁接头转200卡套连接器	Cole Parmer	45518-00
24 G × 3/4" 导管	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk 缝合线	Ethicon	683G
细胞筛	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD 循环水浴箱	Fisher	13-874-3
MasterFlex C/L 蠕动泵	MasterFlex	HV-77122-24
微型钳	Roboz	RS-7438	在高压灭菌器中预先灭菌
5” 直型钝头手术剪	Roboz	RS-6810	在高压灭菌器中预先灭菌
24 mm 刀片直型尖头显微解剖剪	Roboz	RS-5912	在高压灭菌器中预先灭菌
4” 0.8 mm 尖端显微解剖镊	Roboz	RS-5130	在高压灭菌器中预先灭菌
4” 0.8 mm 尖端全弯显微解剖镊	Roboz	RS-5137	在高压灭菌器中预先灭菌
60 ml 注射器	Becton Dickinson	309653
50 ml 锥形管	Corning Falcon	352070
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225
生物安全柜
CO2 培养箱
血清移液管
1,000、200、20 μl 移液器及吸头