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方法文章

利用L-亮氨酸甲酯选择性耗竭小脑颗粒细胞培养物中的小胶质细胞

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DOI：

10.3791/52983

⸱

2015年7月7日

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小胶质细胞可通过多种非细胞自主机制影响培养中的神经元及其他胶细胞。本文介绍一种选择性清除原代神经元培养物中小胶质细胞的实验方案。该方法有望阐明小胶质细胞与神经元相互作用的功能，对神经炎症为特征性表现的神经退行性疾病具有重要意义。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中固有的免疫活性细胞，在调控和维持神经元功能以及介导先天免疫方面发挥多重作用。原代啮齿类细胞培养模型极大地推动了我们对神经元-胶质细胞相互作用的理解，但直到最近，才开始采用能够特异性清除混合培养物中小胶质细胞的方法。其中一种技术——本文所述方法——是使用L-亮氨酸甲酯（L-leucine methyl ester），这是一种溶酶体靶向试剂，可被巨噬细胞和小胶质细胞摄取，进入细胞后引起溶酶体破裂，进而导致细胞凋亡13,14。利用L-亮氨酸甲酯的实验能够识别小胶质细胞在不同培养条件下对周围细胞环境的贡献。根据我们实验室优化的实验方案，本文描述了如何从小脑颗粒细胞（P5期啮齿类动物）培养体系中清除小胶质细胞。该方法有助于评估小胶质细胞对实验数据的相对影响，并判断在模拟中风、阿尔茨海默病或帕金森病等神经系统疾病的体外培养模型中，小胶质细胞发挥的是神经保护作用还是神经毒性作用。

引言

人类大脑估计包含850亿个神经元以及另外850亿个非神经元细胞，其中包括胶质细胞1。在过去大约100年的时间里，神经科学家主要关注神经元细胞群体，认为胶质细胞不过是为神经元提供结构支持的被动辅助细胞——因此“胶质”（glia）一词源自希腊语，意为“胶水”。然而近年来，越来越多的证据表明，神经元与胶质细胞之间的相互作用可能在神经生物学、神经生理学以及多种神经退行性疾病的发病与进展过程中发挥着更为根本性的作用。小脑颗粒细胞（CGCs）是人类大脑中最丰富且均一的神经元群体，主导小脑组织，占其细胞成分总数的90%以上。因此，这些细胞已被广泛用于体外（in vitro）研究神经元的发育、功能及病理过程2-6。

然而，CGC 培养物中仍含有比例可能显著的的小胶质细胞及其他胶质细胞。因此，CGC 实验中看似显示神经元对不同处理产生直接反应的数据，实际上可能部分或全部源于培养物中邻近胶质细胞的间接继发性反应。为评估这一点，我们利用L-亮氨酸甲酯（LME）选择性地清除CGC神经元培养物中的小胶质细胞。LME 是一种溶酶体趋向性试剂，最初用于选择性破坏巨噬细胞7，此后也被用于从神经元、星形胶质细胞及混合胶质细胞培养物中选择性清除小胶质细胞8,9,10。LME 可被巨噬细胞和小胶质细胞内化，导致溶酶体破裂并继而引发细胞凋亡13,14。巨噬细胞和小胶质细胞的特征是富含溶酶体，因此在暴露于 LME 处理时尤为易受损伤。本方案提供了一种强大且简便的方法，用于明确小胶质细胞在利用 CGC 及其他神经元/胶质细胞培养系统进行的实验中的贡献。

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方案

本文所述所有实验均按照1986年英国《动物（科学程序）法》的规定进行。

1. 仪器、培养基和培养皿的准备

  1. 准备两把不锈钢实验解剖剪和两把不锈钢实验镊子。将所有器械进行高压灭菌，并置于超净台内，在紫外灯（UV）下过夜照射以实现消毒。
  2. 配制500 ml最低必需培养基（MEM）培养液（含10%胎牛血清[FBS]、20 mM KCl、25 mM NaHCO3、30 mM D-葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和6 µg/ml氨苄青霉素），经滤膜除菌。4 °C条件下可保存数月。
  3. 准备24孔细胞培养板，每孔放入直径14 mm、1号厚度的盖玻片。将盖玻片进行高压灭菌后，按先前所述方法3用100 mg/L多聚-L-赖氨酸（PDL）包被，并在紫外灯下过夜消毒。

2. CGC 培养液的制备

  1. 在100 ml经高压灭菌和紫外光处理的无菌去离子水（dH2O）中配制“溶液A”，其中包含250 mg葡萄糖、300 mg牛血清白蛋白（BSA）、955 mg磷酸盐缓冲液（PBS）（不含Ca2+和Mg+），以及1 ml 3.8% MgSO4·7H2O。
  2. 在9 ml溶液A中加入1 ml浓度为5 mg/ml的胰蛋白酶，配制“溶液B”（10 ml）。
  3. 将1,000单位DNase、0.5 mg大豆胰蛋白酶抑制剂和100 µl 3.8% MgSO4·7H2O溶于溶液A并定容至10 ml，配制“溶液C”（10 ml） 。
  4. 取3.2 ml溶液C，用溶液A定容至20 ml，配制“溶液D”（20 ml）。
  5. 按先前所述方法配制含EBSS、25 mM NaHCO3、3 mM MgSO4·7H2O和4% BSA的BSA/Earle’s平衡盐溶液（EBSS），调节pH至7.43。
  6. 将纯LME加入5 ml MEM培养基中，使其终浓度为150 mM LME，使用台式pH计调节溶液pH至7.4，并用28 mm聚醚砜（PES）0.2 µm针头滤器过滤除菌，制备LME溶液。

3. 培养颗粒细胞（CGCs）

  1. 按照先前所述方法，采集4至7日龄大鼠幼崽的小脑3立即置于含有5 ml溶液A的培养皿中，并在冰上保存。
  2. 倒掉小脑上多余的溶液，将组织置于培养皿盖中。
  3. 用充分灼烧过的剃刀片在至少三个不同方向上将组织切碎。
  4. 将切碎的组织加入溶液B中（用溶液冲洗培养皿，以确保组织损失最少），置于37 °C水浴中5分钟，每隔几分钟轻轻振荡。
  5. 向管中加入溶液D（20 ml）以中和胰蛋白酶，振荡混匀，于65 × g离心5分钟。
  6. 倒掉上清液。
  7. 用4 ml溶液C重悬组织，使用三支直径依次减小的火焰抛光玻璃移液管充分吹打（每支约10次），直至悬液尽可能均匀。
  8. 缓慢而轻柔地将几滴该匀浆液加至BSA/EBSS液面上方。若匀浆开始沉入BSA/EBSS中，则需进一步吹打，和/或加入少量溶液C。匀浆应形成一层浮于BSA/EBSS液面之上。切勿振荡。以100 × g离心5分钟。
  9. 吸除上清液，将沉淀（松软）重悬于1 ml MEM培养基中。
  10. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将800,000个细胞/盖玻片接种于500 µl MEM培养基中。置于37 °C、6% CO₂的培养箱中培养。2.
  11. 第二天（制备后24-36小时）更换培养基。配制含有10 µM细胞周期抑制剂阿糖胞苷（AraC）的MEM培养基溶液。
    1. 对于每个盖玻片，保留250 µl旧培养基至新的24孔板中，吸除其余部分，加入250 µl正常MEM培养基洗涤细胞，随后吸除该培养基，将之前保留的250 µl旧培养基加回细胞中，并补充250 µl含AraC的培养基。
      注意：细胞可在培养6天后使用 体外 （体外培养天数）

4. 选择性耗竭小胶质细胞（在6 DIV时进行）

  1. 向5 ml的另一份MEM培养基中加入纯LME，使其终浓度为150 mM LME。
  2. 将溶液调至pH 7.4，并使用28 mm聚醚砜（PES）0.2 µm针头滤器过滤除菌。
  3. 将溶液用MEM培养基稀释至50 mM（2 × LME）的浓度，并置于37℃水浴中 oC，10 分钟，同时以正常 MEM 培养基作为对照培养。
  4. 从CGC培养物中移除一半（250 µl）MEM培养基，并在37 °C下保留。
  5. 用含有2倍LME（250 µl）的MEM培养基处理细胞， 即 按1:1比例稀释，使孔中浓度为25 mM，或用预热的不含LME的MEM培养基（250 µl）进行对照培养。
  6. 在37 °C、含6% CO₂的湿润环境中孵育细胞2 1 小时。
  7. 用新鲜的预温MEM培养基洗涤细胞两次，以去除含LME的培养基，然后将残留的培养基与等体积的新鲜预温MEM培养基替换至相应的孔中。
  8. 将培养物放回培养箱（加湿，含6% CO₂）2 在37 °C下孵育，并静置24小时后再进行任何后续处理。

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结果

该技术能够选择性地从颗粒细胞培养物（CGC）和/或混合培养物中清除小胶质细胞，其有效性依赖于研究者后续能否准确识别并区分小胶质细胞与其周围细胞。可通过使用小胶质细胞特异性标记物（如异凝集素-B4）实现这一目的，如图1所示。如图2所示，各主要处理组在星形胶质细胞和神经元的密度及形态方面均未记录到可观察到的变化。重要的是，当培养物仅用LME处理时，神经元或星形胶质细胞的形态未见显著改变，这支持该化合物具有针对小胶质细胞的特异性作用。 图3A显示，在原代啮齿类动物星形胶质细胞培养物中，星形胶质细胞的密度和形态未见明显变化12，但污染的小胶质细胞数量减少。在图3B中，与A图类似，星形胶质细胞的密度和形态未见改变；然而，污染的小胶质细胞数量及其反应性均有所下降。有关本论文所用免疫细胞化学（ICC）实验方案的简要描述，请参见参考文献11。

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讨论

确保成功选择性清除CGC和/或混合培养物中小胶质细胞的最重要步骤包括：1）维持无菌且健康的CGC培养；2）对含LME的培养基进行滤膜除菌，并将溶液pH调至7.4；3）将保留的CGC培养基和含LME的培养基保持在37 °C，以避免热休克；4）操作迅速，以减少细胞在培养箱外停留的时间。

我们使用 25 mM LME 从 CGC 培养物中清除小胶质细胞——该浓度已在我们的实验室中经过优化。然而，经过 LME 处理后，培养物中仍残留少量小胶质细胞，一些研究人员认为这可能代表了一群已分化且不再增殖的小胶质细胞亚群。事实上，Hamby et al.（2006）发现，在高密度星形胶质细胞单层培养中，需要使用 50–75 mM LME 才能完全清除小胶质细胞13。我们此前还证实，在纯化的小胶质细胞培养体系中，10 mM LME 即可在 24 小时孵育条件下完全杀死所有小胶质细胞14。

近年来，一些清除细胞培养模型中外源性小胶质细胞的替代方法相继被报道。Croc...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

该研究得到了英国Aims2Cure项目和伦敦大学学院（UCL）Impact Award博士生奖学金对JMP的资助，以及英国医学研究理事会（MRC）痴呆症领域能力建设博士生奖学金对JMP的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
镊子 Sigma-AldrichF4142弯曲末端有助于取出小脑 
显微解剖剪Sigma-AldrichS3146直头、尖端锋利，便于对P4-7期啮齿类动物进行解剖 
L-亮氨酸甲酯盐酸盐Sigma-Aldrich7517-19-3
EBSS溶液 Sigma-AldrichE7510-500 ml
聚-D-赖氨酸Sigma-Aldrich27964-99-4盖玻片使用前1天包被 
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA9418
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP4417
脱氧核糖核酸酶（DNase）Sigma-AldrichD5025
大豆胰蛋白酶抑制剂 Sigma-AldrichT6414
小鼠抗ED1抗体 Abcamab31630

参考文献

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