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方法文章

工程化带血管化肌瓣

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DOI：

10.3791/52984

⸱

2016年1月11日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

迄今为止，厚层组织缺损通常通过自体组织瓣或工程化组织进行重建。在本方案中，我们介绍一种新的方法，用于构建带有自体蒂的血管化工程组织瓣，以作为自体组织瓣的替代方案。

摘要

限制组织构建物厚度及其相应存活率和应用性的主要因素之一 体内，是对细胞微环境供氧的控制，因为被动扩散仅限于非常薄的区域。尽管已有多种材料被用于修复腹壁全层缺损，但由于移植物血管化程度低、组织排斥、感染或机械性能不足，尚无一种材料被证实为理想选择。本方案描述了一种构建完全血管化皮瓣的方法，其厚度适用于肌肉组织重建。将含细胞的聚左旋乳酸/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架植入小鼠股动脉和股静脉周围，并加以维持 体内 为期一至两周。随后将带血管的移植物作为皮瓣转移至腹部制造的全层缺损处。该技术避免了自体组织牺牲的需要，并可能实现以下应用 体外 在多种外科应用中工程化的带血管皮瓣。

引言

腹壁缺损常继发于严重创伤、癌症治疗、烧伤以及感染性补片的移除。此类缺损通常伴有显著的组织缺失，需要复杂的外科手术，给整形重建外科医生带来重大挑战1-4。致力于寻找人工组织新来源的组织工程研究人员已探索了多种材料、细胞来源和生长因子。既往已有报道，通过植入工程化组织成功修复多种组织，如气管5,6、膀胱7、角膜8、骨9和皮肤10。然而，构建较厚且具有血管化的工程化组织，特别是用于大范围缺损的重建，仍是组织工程领域面临的一项重大挑战。

限制可存活组织构建物厚度的主要因素之一是对构成该构建物的细胞供氧的控制。当仅依赖扩散供氧时，构建物的厚度被限制在非常薄的层状范围内。氧气和营养物质供应毛细血管之间的最大距离 体内 约为200 µm，这与氧气的扩散极限相吻合11,12血管化不足可能导致组织缺血，并进一步发展为组织吸收或坏死 13.

此外，用于组织重建的理想材料必须具有生物相容性且无免疫原性。该材料还应能够促进宿主细胞与生物材料的进一步整合，并维持结构完整性。以往已探索了多种生物来源14-16和合成1,17,18的基质材料用于组织重建，但由于缺乏有效的血液供应、感染风险或组织强度不足，其应用仍受到限制。

本研究中，将一种生物相容性良好且含有细胞的支架材料植入裸鼠股动静脉（AV）周围，该支架由美国食品药品监督管理局（FDA）批准的聚左旋乳酸（PLLA）/聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）构成，并与周围组织分离，仅允许来自AV血管的血管化。植入后一周，移植物存活良好，组织厚实且血管化充分。随后，将这一带有AV血管的厚实血管化组织作为带蒂皮瓣，转移至同一只小鼠腹部的全层缺损区域。转移一周后，皮瓣存活良好，血管化充分，并与周围组织良好整合，具有足够的强度以支撑腹腔脏器。因此，这种带有自体蒂的工程化厚型血管化组织皮瓣，为修复腹壁全层缺损提供了一种新颖的方法。

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方案

所有动物实验均经以色列理工学院动物实验伦理委员会批准。本实验采用无胸腺裸鼠，以避免免疫排斥反应。若使用其他类型小鼠，建议在手术前剃除毛发，并给予环孢素（或其它抗排斥替代药物）。

1. 支架制备与细胞包埋

  1. 按以下步骤制备由聚-L-乳酸（PLLA）与聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）按1:1比例组成的支架：
    1. 将500 mg PLLA和500 mg PLGA溶解于10 ml氯仿中。
    2. 取0.24 ml聚合物溶液加入盛有0.4 g氯化钠颗粒的聚四氟乙烯模具中，使用粒径为212–600 µm的盐颗粒，室温下过夜（O/N）使氯仿完全挥发。
    3. 用蒸馏水浸提去除盐颗粒，从而获得具有相互连通孔隙的三维多孔支架。
    4. 使用剪刀将聚合物材料裁剪成适当大小，随后在70%乙醇（v/v）中浸泡30分钟，并用PBS洗涤3次，每次2分钟，之后即可使用。
  2. 在1:1比例的内皮细胞培养基（EGM-2，添加其专用 BulletKit 组分）与肌细胞培养基（DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、2.5% HEPES缓冲液、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素（Pen-Strep溶液））混合培养基中，建立以下三种细胞的共培养体系：
    1. 使用0.5 × 106个C2C12成肌细胞、0.9 × 106个人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 和0.2 × 106个正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）。
  3. 将细胞混合于微量离心管中，在200 × g条件下离心4分钟，吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于4 µl冰浴的细胞外基质溶液与4 µl细胞培养基的混合液中。
  4. 取一块尺寸为10 mm × 7 mm × 1 mm（长×宽×厚）的PLLA/PLGA支架，接种细胞悬液至6孔板中，在加入4 ml细胞培养基前，于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，使细胞外基质溶液凝固。
  5. 植入前将支架培养10天，每隔一天更换一次培养基。

2. 手术开始前

  1. 准备并灭菌（高压灭菌）以下手术器械：小型精细直剪、弹簧剪、直头精细镊子、带齿镊子和持针器。
  2. 在微量离心管中配制氯胺酮：甲苯噻嗪溶液，将425 µl氯胺酮与75 µl甲苯噻嗪混合于1 ml注射器中。
  3. 用无菌生理盐水将0.3 mg/ml的丁丙诺啡稀释（1:20）。

3. 瓣膜构建（移植物植入）

  1. 使用胰岛素注射器，通过腹腔注射氯胺酮与赛拉嗪混合液（每20克体重注射35 µl）对小鼠进行麻醉。
  2. 手术前，皮下注射布托啡诺（终浓度为0.05–0.1 mg/kg）。
  3. 将小鼠置于加热至37 °C的手术台上，以维持正常体温，并使用粘性绷带固定小鼠。
  4. 使用棉签为小鼠眼睛涂抹润滑眼膏（以防止脱水）。
  5. 使用棉签依次用碘液和70%乙醇清洁切口部位，以建立无菌操作区域。
  6. 使用小型剪刀和镊子，从膝关节水平至腹股沟韧带处沿股动静脉走向切开皮肤，直至暴露股动脉和静脉（AV）血管。
  7. 使用牵开器固定皮肤，以便更好地暴露组织。
  8. 使用弹簧剪刀和镊子，小心地将股动脉和静脉从周围组织中分离出来。分离范围从腹股沟韧带水平至腹壁上血管分叉处。保留深动脉（profunda）不受干扰，以维持下肢血流并防止后续发生缺血。
  9. 将第1部分制备的移植物围绕暴露的股动静脉（AV）进行包裹，位置位于深动脉下方、胫前和胫后动静脉分叉上方，并使用8-0丝线缝合移植物两端。
  10. 为确保仅由股动静脉血管出芽的毛细血管实现移植物的血管化，用一片灭菌乳胶膜包裹移植物，并使用6-0缝线固定。
  11. 使用4-0丝线缝合覆盖的皮肤。
  12. 密切监测小鼠直至从麻醉中恢复，之后每日观察，直至移植物作为皮瓣转移。术后2–3天内每天皮下注射两次布托啡诺（终浓度为0.05–0.1 mg/kg）。
    注意：在任何步骤中均可使用生理盐水，以避免暴露组织脱水。

4. 皮瓣转移

  1. 植入后一至两周，使用胰岛素注射器经腹腔注射氯胺酮与赛拉嗪混合液（35 µl/20 g）对小鼠进行麻醉。
  2. 手术前，皮下注射布托啡诺（终浓度为 0.05–0.1 mg/kg）。
  3. 将小鼠置于加热至 37 °C 的手术台上，以维持正常体温，并使用粘性绷带固定小鼠。
  4. 使用棉签为小鼠眼部涂抹润滑眼膏（防止脱水）。
  5. 使用棉签依次以碘液和 70% 乙醇清洁切口区域（从膝部至腹部），以建立无菌操作区域。
  6. 使用剪刀和镊子小心打开皮肤缝合处，并用剪刀沿腹股沟韧带平行方向切开皮肤，继续切开腹侧皮肤。
  7. 用镊子小心取出乳胶片，暴露已形成血管化的皮瓣。
  8. 使用剪刀和镊子将组织皮瓣从周围组织中分离。
  9. 使用镊子和持针器，用 8-0 丝线结扎股动静脉远端，以防止动静脉出血；随后在膝部水平、植入组织折叠处远端及 8-0 缝线远端位置电凝动静脉。
  10. 轻柔地将被移植物包裹的股动静脉向腹侧腹壁方向转移，避免损伤动脉，以确定全层缺损应制作的位置。
    警告：过度牵拉动脉会造成动脉损伤。
  11. 使用精细剪刀在腹侧腹壁上做一切口。
  12. 使用弹簧剪刀切开腹直肌，并连同其上方皮肤一起切除一段约 1 cm × 0.8 cm 的腹直肌组织。
  13. 将被血管化移植物包裹的股动静脉作为轴型皮瓣，转移至腹侧腹壁的全层缺损处。
  14. 使用 8-0 丝线将皮瓣缝合固定于周围肌肉组织，以防止疝形成。
  15. 缝合皮瓣至腹壁肌肉时，用镊子提起肌肉，避免缝到内脏器官；保持腹侧皮肤敞开，以模拟全腹壁缺损的效果。
  16. 用碘伏纱布和无菌敷料覆盖皮肤伤口，防止暴露区域受到污染。
  17. 使用 4-0 丝线缝合腿部皮肤。
  18. 密切监测小鼠直至其从麻醉中恢复，之后每日观察，直至皮瓣取出。  皮下注射布托啡诺（终浓度为 0.05–0.1 mg/kg），每日两次，持续 2–3 天。
  19. 注意：在任何步骤中均可使用生理盐水，以避免暴露组织脱水。

5. 超声评估移植物的血管灌注

注意：在移植后一周和两周时，通过超声成像测量移植物的血管灌注，以评估移植前的灌注情况。

  1. 使用 2% 异氟烷对小鼠进行麻醉。
  2. 将小鼠置于加热至 38 °C 的可移动平台上，以维持正常体温，然后使用粘性绷带固定小鼠。
  3. 使用设置为 B 模式的非线性换能器定位股动脉和股静脉。
  4. 将换能器切换至彩色多普勒模式，检查移植物股血管的通畅性。
  5. 根据制造商说明书配制非靶向对比剂。
  6. 将尾静脉导管（带 27 G 针头的 12 cm 管路）连接至装有生理盐水的 1 ml 注射器。将注射器固定在加热平台上的小鼠旁（以避免注射器移动）。
  7. 将导管连接至小鼠尾静脉，并固定针头。
  8. 注入少量生理盐水，以确认注射进入静脉，并用生理盐水充满管路（避免产生气泡）。
  9. 用 70 µl 对比剂填充 1 ml 注射器，并替换原有的生理盐水注射器。
  10. 设置超声系统以成像对比剂注射过程。在非线性模式的参数设置中，将帧数设为 1,500，破坏脉冲设为总帧数的 30%。
    注意：在破坏 脉冲后，微泡以毛细血管中微泡流动速率决定的速度重新填充血管，该速率与微泡注射速率无关。帧数可根据填充时间进行调整19,20。
  11. 缓慢将对比剂注入尾静脉。
  12. 使用高分辨率超声系统在非线性对比模式下采集图像。
  13. 使用软件分析结果，方法如前所述19,20。
    1. 在破坏 脉冲后立即获取的对比模式图像上绘制感兴趣区域（ROI）。ROI 应仅勾勒出被对比剂填充的区域。
    2. 计算峰值增强（PE），即注射微泡后非线性信号的平均强度与破坏 脉冲后的平均强度之比，用于衡量灌注体积。
    3. 计算流速，该值由达到峰值信号（P）所需的时间（T）确定。

6. 移植物血管化程度的测定

注意：组织移植物的血管化程度在植入后一至两周内确定。

  1. 使用胰岛素注射器，通过腹腔注射氯胺酮与赛拉嗪混合物（35 µl/20 g）对小鼠进行麻醉。
  2. 使用1 ml注射器，经尾静脉静脉注射200 µl浓度为10 mg/ml的异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-Dextran，分子量 = 500,000）。
  3. 注射完成后10秒，通过颈椎脱位法处死小鼠。
  4. 切开小鼠腿部，暴露移植物。
  5. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗移植物区域，并加入10%中性缓冲甲醛固定。
  6. 使用共聚焦显微镜对小鼠腿部的移植物进行成像。
  7. 量化功能性血管密度（FVD）。
    1. 提取共聚焦显微图像中的绿色通道（激发波长 = 488 nm）。
    2. 将所得图像通过高通滤波器，以增强高对比度结构。
    3. 使用去斑点滤波器去除可能因高通滤波而被放大的噪声。
    4. 对所得图像设定阈值；调整阈值，使原始图像中的特征和结构在二值图像中清晰可见。
    5. 设置尺寸阈值，使二值图像中仅保留大于设定尺寸阈值的连通像素群。
    6. 使用Zhang-Suen算法21勾画移植物中血管的骨架结构。
    7. 通过累加每条血管中线的长度，并将总和除以感兴趣区域（ROI）的面积，计算FVD。

7. 移植物的免疫组织化学与组织学染色

  1. 免疫组织化学染色
    1. 共聚焦成像后，使用小剪刀和镊子取出移植物。解剖移植物两端的动静脉血管，并取出移植物。
    2. 将移植物置于10%中性缓冲福尔马林中固定30分钟至2小时。
    3. 将移植物放入组织学包埋盒中，并保存在70%乙醇中，直至进行石蜡包埋。
    4. 采用标准固定和包埋方案 22进行石蜡包埋，并使用切片机将石蜡包埋组织切成5 µm厚的切片。整个组织切片方向应垂直于动静脉血管。
    5. 通过将切片浸入100%二甲苯中两次，每次10分钟，以脱去石蜡。
    6. 将载玻片放入250 ml塑料Coplin染色缸中。
    7. 依次浸入浓度递减的乙醇溶液（100%、96%、90%、80%、70%、50%、30%）及双蒸水（DDW）中，每次3分钟，进行再水化。
    8. 通过将2.35 ml抗原修复液稀释至250 mL双蒸水中配制抗原修复液。将抗原修复液置于微波炉中，95 °C加热2分钟。
    9. 将载玻片插入预热的抗原修复液中，再次于95 °C微波加热3分钟。随后将切片冷却至50 °C。
    10. 再次加热2分钟，然后冷却至室温。
    11. 在甲醇中加入3.3% H2O2溶液，室温孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，随后用PBS冲洗两次。
    12. 准备孵育湿盒：在组织盒内放置湿润的吸水纸，并用精细擦拭纸将载玻片表面擦干。
    13. 使用疏水笔在载玻片上圈出组织切片区域，每张切片加入约50 µl封闭液（2%山羊血清，PBS配制），室温孵育30分钟。
    14. 将兔抗CD31抗体用封闭液按1:50稀释，每张切片加入约50 µl抗体，4 °C过夜孵育。用PBS冲洗三次，每次5分钟。
    15. 将生物素标记的山羊抗兔二抗按1:400稀释于PBS中，每张切片加入约50 µl，室温孵育30分钟。
    16. 用PBS冲洗三次，每次5分钟。
    17. 将链霉亲和素-过氧化物酶按1:400稀释于PBS中，每张切片加入约50 µl，室温孵育30分钟。用PBS冲洗三次，每次5分钟。
    18. 根据制造商说明，每张切片加入约50 µl氨基乙基咔唑（AEC）底物。将载玻片浸入双蒸水中以终止反应。
    19. 将切片浸入约50 µl Mayer苏木精溶液中染色2分钟，使细胞核呈蓝色。轻轻用水冲洗后，用封片剂封片。
    20. 采用双盲法对CD31阳性染色进行定量分析。CD31阳性染色呈棕褐色。在双目光学显微镜下，选择4–5个不同的40倍放大视野。计数每个视野中CD31阳性管腔的数量。
      1. 通过将总计数的管腔数除以视野数量及视野面积（根据显微镜参数确定），计算每个支架中CD31阳性管腔的平均数量。
        注：所用试剂体积必须足以完全覆盖所圈定的组织切片区域。
  2. 组织学染色
    1. 将移植物置于10%中性缓冲福尔马林中固定。
    2. 采用标准固定和包埋程序将移植物进行石蜡包埋。
    3. 将石蜡切片浸入100%二甲苯中两次，每次10分钟，以去除石蜡。
    4. 用100%异丙醇快速洗涤两次，进行再水化。
    5. 用95%乙醇快速洗涤两次。
    6. 用自来水冲洗三次。
    7. 浸入苏木精溶液中10分钟。
    8. 用自来水冲洗三次。
    9. 浸入伊红溶液中2分钟。
    10. 用95%乙醇快速洗涤两次，进行脱水。
    11. 用100%异丙醇快速洗涤两次。
    12. 用100%二甲苯快速洗涤两次。
    13. 用厚度为1.5 mm的盖玻片，以DPX封片胶封片。
    14. 使用显微镜在40倍放大下进行成像。

8. 机械性能评估

  1. 使用小剪刀和镊子取出移植物。
  2. 用 PBS 冲洗移植物。
  3. 测量移植物的宽度和厚度，并通过宽度乘以厚度计算横截面积。
  4. 使用测试仪器生成水合移植物的应力-应变曲线。
    1. 将移植物安装在系统拉伸夹具之间，并测量两个夹具之间的最终长度（即，初始长度。
    2. 施加0.01 mm/sec的应变速率，直至材料失效。
    3. 根据制造商的方案记录所测得的力和位移。
    4. 在 Matlab 中生成应力-应变曲线。
      1. 根据位移除以初始长度计算应变。应力通过测量得到的力除以横截面积来计算。
      2. 将应力-应变曲线线性区域的斜率确定为刚度，曲线的最大值点为抗拉强度极限。

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结果

移植物血管化与灌注 体内

移植物在作为轴型皮瓣转移前一周或两周植入。植入后一至两周，对移植物区域进行大体观察，显示移植物组织存活且已实现血管化。通过CD31免疫组织化学染色呈阳性结果，证实这些移植物具有高度血管化。图1A)，并且具有高度灌注性，这通过FITC-葡聚糖尾静脉注射和超声测量得到证实。在植入后一周时已可观察到大量血管，而在AV血管附近再经过一周后，血管数量显著增加。基于FITC-葡聚糖的功能性血管密度（FVD）测定（图1B显示移植体在植入后一周已高度血管化，且在随后的一周内未发生显著变化 体内通过超声成像证实了血管通畅性和灌注情况（FVD 为 5.71 mm）-1 ± 0.51 mm-1和 10.28 mm-1 ± 2.71 mm-1分别在植入后一周和两周。 图1C

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讨论

组织工程领域的进展伴随着对各类组织重建所需替代组织日益增长的需求。已有多种合成1,17,18和生物14-16材料以及制造方法被评估其满足这些需求的能力。然而，尽管临床治疗和组织工程取得了进步，全层腹壁缺损的修复仍是一项挑战。适用于此类大范围缺损重建的组织必须具备以下特性：（1）具有足够的厚度；（2）具有血管化结构；并能长期保持（3）机械完整性以及（4）存活能力23。

本文介绍了一种构建厚实、有活性且具有血管化的组织瓣的逐步详细方案，该组织瓣可作为自体组织瓣的替代方案。所构建的组织瓣分为两个步骤完成：（1）将PLLA/PLGA支架植入小鼠后肢动静脉（AV）血管周围，并与周围组织隔离，仅允许动静脉血管对其进行血管化；（2）将所形成的血管化厚组织瓣连同作为其蒂部的动静脉血管一起，转移至腹壁全层缺损部位。

适当的皮瓣血管化对其在宿主体内的成功整合至关重要 17,18,24已有多种旨在构建血管化工程组织以改善厚组织中氧气供应与扩散的方法见于文献报道。...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究得到了欧盟第七框架计划欧洲研究理事会资助项目281501（ENGVASC）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小型精细直剪Fine Science Tools (FST)14090-09
弹簧剪Fine Science Tools (FST)15003-08
细尖直头镊子Fine Science Tools (FST)11251-20
带齿镊子 Fine Science Tools (FST)11050-10
持针器Fine Science Tools (FST)12500-12
小血管电凝器 Fine Science Tools (FST)18000-00
DuratearsAlcon5686
SedaxylanEuravetDJ03
Clorketam 1000Vetoquinol4A0726B
布托啡诺vetmarketB15100
4-0 丝线缝合线Assut sutures647
6-0 聚丙烯缝合线Assut sutures9351F
8-0 丝线缝合线Assut sutures684568
胰岛素注射器（6 mm 针头）BD324911
Vevo 2100 高分辨率超声系统VisualSonics inc.
MS250 非线性换能器VisualSonics inc.
Micromarker 非靶向对比剂VisualSonics inc.VS-11694
尾静脉导管VisualSonics inc.VS-11912
Vevo 2100 软件VisualSonics inc.
异硫氰酸荧光素标记葡聚糖SigmaFD500S
MatlabMathworks, MA, USA
Kimwipes 擦拭纸Kimtech34120
抗原修复液Vector laboratoriesH-3300
抗 CD31 抗体Abcam ab28364
生物素化山羊抗兔（二抗）抗体Vector laboratoriesBA-1000
链霉亲和素-过氧化物酶Jackson 016-030-084
梅耶苏木精溶液Sigma-AldrichMHS-16
氨基乙基咔唑（AEC）底物试剂盒Life technologies, Invitrogen 00-2007
Vectamount 封片剂Vector laboratoriesH-5501

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