迄今为止，厚层组织缺损通常通过自体组织瓣或工程化组织进行重建。在本方案中，我们介绍一种新的方法，用于构建带有自体蒂的血管化工程组织瓣，以作为自体组织瓣的替代方案。
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本文内容
摘要
摘要
限制组织构建物厚度及其相应存活率和应用性的主要因素之一 体内，是对细胞微环境供氧的控制，因为被动扩散仅限于非常薄的区域。尽管已有多种材料被用于修复腹壁全层缺损，但由于移植物血管化程度低、组织排斥、感染或机械性能不足，尚无一种材料被证实为理想选择。本方案描述了一种构建完全血管化皮瓣的方法，其厚度适用于肌肉组织重建。将含细胞的聚左旋乳酸/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架植入小鼠股动脉和股静脉周围，并加以维持 体内 为期一至两周。随后将带血管的移植物作为皮瓣转移至腹部制造的全层缺损处。该技术避免了自体组织牺牲的需要，并可能实现以下应用 体外 在多种外科应用中工程化的带血管皮瓣。
引言
腹壁缺损常继发于严重创伤、癌症治疗、烧伤以及感染性补片的移除。此类缺损通常伴有显著的组织缺失，需要复杂的外科手术，给整形重建外科医生带来重大挑战1-4。致力于寻找人工组织新来源的组织工程研究人员已探索了多种材料、细胞来源和生长因子。既往已有报道，通过植入工程化组织成功修复多种组织，如气管5,6、膀胱7、角膜8、骨9和皮肤10。然而，构建较厚且具有血管化的工程化组织，特别是用于大范围缺损的重建，仍是组织工程领域面临的一项重大挑战。
限制可存活组织构建物厚度的主要因素之一是对构成该构建物的细胞供氧的控制。当仅依赖扩散供氧时，构建物的厚度被限制在非常薄的层状范围内。氧气和营养物质供应毛细血管之间的最大距离 体内 约为200 µm，这与氧气的扩散极限相吻合11,12血管化不足可能导致组织缺血，并进一步发展为组织吸收或坏死 13.
此外，用于组织重建的理想材料必须具有生物相容性且无免疫原性。该材料还应能够促进宿主细胞与生物材料的进一步整合，并维持结构完整性。以往已探索了多种生物来源14-16和合成1,17,18的基质材料用于组织重建，但由于缺乏有效的血液供应、感染风险或组织强度不足，其应用仍受到限....
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方案
所有动物实验均经以色列理工学院动物实验伦理委员会批准。本实验采用无胸腺裸鼠，以避免免疫排斥反应。若使用其他类型小鼠，建议在手术前剃除毛发，并给予环孢素（或其它抗排斥替代药物）。
1. 支架制备与细胞包埋
- 按以下步骤制备由聚-L-乳酸（PLLA）与聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）按1:1比例组成的支架：
- 将500 mg PLLA和500 mg PLGA溶解于10 ml氯仿中。
- 取0.24 ml聚合物溶液加入盛有0.4 g氯化钠颗粒的聚四氟乙烯模具中，使用粒径为212–600 µm的盐颗粒，室温下过夜（O/N）使氯仿完全挥发。
- 用蒸馏水浸提去除盐颗粒，从而获得具有相互连通孔隙的三维多孔支架。
- 使用剪刀将聚合物材料裁剪成适当大小，随后在70%乙醇（v/v）中浸泡30分钟，并用PBS洗涤3次，每次2分钟，之后即可使用。
- 在1:1比例的内皮细胞培养基（EGM-2，添加其专用 BulletKit 组分）与肌细胞培养基（DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）、2.5% HEPES缓冲液、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素（Pen-Strep溶液））混合培养基中，建立以下三种细胞的共培养体系：
- 使用0.5 × 106个C2C12成肌细胞、0.9 × 106
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结果
移植物血管化与灌注 体内
移植物在作为轴型皮瓣转移前一周或两周植入。植入后一至两周，对移植物区域进行大体观察，显示移植物组织存活且已实现血管化。通过CD31免疫组织化学染色呈阳性结果，证实这些移植物具有高度血管化。图1A)，并且具有高度灌注性，这通过FITC-葡聚糖尾静脉注射和超声测量得到证实。在植入后一周时已可观察到大量血管，而在AV血管附近再经过一周后，血管数量显著增加。基于FITC-葡聚糖的功能性血管密度（FVD）测定（图1B显示移植体在植入后一周已高度血管化，且在随后的一周内未发生显著变化 体内通过超声成像证实了血管通畅性和灌注情况（FVD 为 5.71 mm）-1 ± 0.51 mm-1和 10.28 mm-1 ± 2.71 mm-1分别在植入后一周和两周。 图1C
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讨论
组织工程领域的进展伴随着对各类组织重建所需替代组织日益增长的需求。已有多种合成1,17,18和生物14-16材料以及制造方法被评估其满足这些需求的能力。然而，尽管临床治疗和组织工程取得了进步，全层腹壁缺损的修复仍是一项挑战。适用于此类大范围缺损重建的组织必须具备以下特性：（1）具有足够的厚度；（2）具有血管化结构；并能长期保持（3）机械完整性以及（4）存活能力23。
本文介绍了一种构建厚实、有活性且具有血管化的组织瓣的逐步详细方案，该组织瓣可作为自体组织瓣的替代方案。所构建的组织瓣分为两个步骤完成：（1）将PLLA/PLGA支架植入小鼠后肢动静脉（AV）血管周围，并与周围组织隔离，仅允许动静脉血管对其进行血管化；（2）将所形成的血管化厚组织瓣连同作为其蒂部的动静脉血管一起，转移至腹壁全层缺损部位。
适当的皮瓣血管化对其在宿主体内的成功整合至关重要 17,18,24已有多种旨在构建血管化工程组织以改善厚组织中氧气供应与扩散的方法见于文献报道。.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了欧盟第七框架计划欧洲研究理事会资助项目281501（ENGVASC）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小型精细直剪 | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| 细尖直头镊子 | Fine Science Tools (FST) | 11251-20 | |
| 带齿镊子 | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| 持针器 | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| 小血管电凝器 | Fine Science Tools (FST) | 18000-00 | |
| Duratears | Alcon | 5686 | |
| Sedaxylan | Euravet | DJ03 | |
| Clorketam 1000 | Vetoquinol | 4A0726B | |
| 布托啡诺 | vetmarket | B15100 | |
| 4-0 丝线缝合线 | Assut sutures | 647 | |
| 6-0 聚丙烯缝合线 | Assut sutures | 9351F | |
| 8-0 丝线缝合线 | Assut sutures | 684568 | |
| 胰岛素注射器（6 mm 针头） | BD | 324911 | |
| Vevo 2100 高分辨率超声系统 | VisualSonics inc. | ||
| MS250 非线性换能器 | VisualSonics inc. | ||
| Micromarker 非靶向对比剂 | VisualSonics inc. | VS-11694 | |
| 尾静脉导管 | VisualSonics inc. | VS-11912 | |
| Vevo 2100 软件 | VisualSonics inc. | ||
| 异硫氰酸荧光素标记葡聚糖 | Sigma | FD500S | |
| Matlab | Mathworks, MA, USA | ||
| Kimwipes 擦拭纸 | Kimtech | 34120 | |
| 抗原修复液 | Vector laboratories | H-3300 | |
| 抗 CD31 抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 生物素化山羊抗兔（二抗）抗体 | Vector laboratories | BA-1000 | |
| 链霉亲和素-过氧化物酶 | Jackson | 016-030-084 | |
| 梅耶苏木精溶液 | Sigma-Aldrich | MHS-16 | |
| 氨基乙基咔唑（AEC）底物试剂盒 | Life technologies, Invitrogen | 00-2007 | |
| Vectamount 封片剂 | Vector laboratories | H-5501 |
参考文献
- Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
- De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular ....
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重印与许可
