工程化血管肌瓣

摘要

迄今为止，厚组织缺损通常通过应用自体组织皮瓣或工程组织来重建。在该协议中，我们提出了一种新方法，用于设计带有自体椎弓根的血管化组织皮瓣，以替代自体皮瓣。

摘要

限制组织结构厚度及其在体内的生存能力和适用性的主要因素之一是对细胞微环境氧气供应的控制，因为被动扩散仅限于非常薄的层。尽管已经描述了各种材料可以恢复腹壁全层缺损的完整性，但由于移植物血管化程度低、组织排斥反应、感染或机械性能不足，还没有任何材料被证明是最佳的。该协议描述了一种设计完全血管化皮瓣的方法，其厚度与肌肉组织重建相关。将细胞包埋的聚 L-乳酸/聚乳酸-羟基乙酸共聚物构建体植入小鼠股动脉和静脉周围，并在体内维持一到两周。然后将血管化移植物作为皮瓣转移到腹部形成的全层缺损。该技术取代了自体组织切割的需要，并可能在许多外科应用中使用体外工程血管化皮瓣。

引言

腹壁缺损经常出现以下严重创伤，癌症治疗，烧伤和清除感染的网格。这些缺陷往往涉及显著组织损失，需要复杂的外科手术，并提出一个重大的挑战，重建整形外科医生^1-4。组织工程研究人员寻求新的来源为人工组织已经探索不同的材料，细胞来源和生长因子。以前报道进行了各种组织，如气管^5,6，膀胱^7，角膜^8，骨⁹和皮肤^10，通过工程化组织中植入的成功修复体。然而，一个厚血管工程化组织，制造的尤其是用于重建的大的缺陷，仍然在组织工程一个显著挑战。

一的限制性活组织构建物的厚度的主要因素是氧气供应到其缺点控制tituent细胞。当上扩散依赖，构造厚度限制在一个非常薄的层的。含氧和营养供给毛细管体内之间的最大距离为大约200微米，这与氧气^11,12的扩散限制。血管不足可能导致组织缺血，并升级为组织吸收或坏死^13。

此外，用于组织重建的理想材料必须是生物相容的和非免疫原性的。它也必须是能够促进与生物材料进一步整合宿主细胞，并维持结构完整性。各种生物^14-16和合成^1,17,18矩阵先前已经探索了组织重建，但是它们的使用仍然因缺乏有效的血液供应，感染或组织强度不足的限制。

在这项研究中，生物相容的，细胞 - EMBedded脚手架由食品和药物管理局（FDA）批准的聚L-乳酸（PLLA）/聚乳酸 - 共 - 乙醇酸（PLGA）的是围绕裸小鼠的股动脉和静脉（AV）血管植入和从周围组织中分离，从而确保只从该AV血管血管。一周后植入，移植是可行的，厚好血管。这与AV血管粗血管化组织，然后将其转移作为带蒂皮瓣腹部全层缺损相同的鼠标。一周后转移皮瓣是可行的，血管和周围组织很好的集成，承载足够的强度来支持腹腔脏器。因此，改造的厚，血管化组织瓣，轴承自体椎弓根，提出了一种新颖的方法用于修复全层腹壁缺损。

方案

所有的动物研究批准了工程技术学院动物实验伦理委员会。对于此过程，无胸腺裸小鼠用于避免免疫排斥反应。如果使用另一种类型的小鼠，小鼠应剃前手术过程和环孢素的施用（或另一种抗排斥替代）的建议。

1.支架制备及细胞嵌入

1. 制备的1组成的支架:的聚L-乳酸（PLLA）和聚乳酸 - 共 - 乙醇酸 - 酸共聚物（PLGA）的1:1混合物，以下列方式:
   1. 溶解500mg的PLLA的和在10ml氯仿500mg的PLGA的。
   2. 加0.24毫升聚合物溶液至0.4g聚集在特氟隆模具氯化钠颗粒。使用的212-600微米的盐直径。让氯仿蒸发O / N。
   3. 用蒸馏水导致相互连接的多孔三维支架浸出盐析。
   4. 切聚合物片使用剪刀，然后浸泡在70％乙醇（V / V）30分钟，并在使用前2分钟的PBS洗3次。
2. 制备下列细胞的三 - 培养在1:1的内皮细胞培养基（EGM-2补充有其子弹试剂盒和肌肉细胞培养基（Dulbecco氏最小基本培养基（DMEM），补充有10％胎牛血清的组分（FBS ），2.5％HEPES缓冲液，100U / ml青霉素和0.1mg / ml的链霉素（青霉素 - 链霉素溶液）。
   1. 使用0.5×10 ⁶的C2C12成肌细胞，0.9×10 ⁶人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和^0.2×10 6个正常人真皮成纤维细胞（NHDF）。
3. 的细胞混合在一起，微量离心管中并离心，在200×g离心4分钟，吸出培养基，并重新悬浮沉淀在4微升冰冷的细胞外基质溶液中，4微升的细胞培养基的混合物。
4. 切下一块10毫米×7毫米×1毫米（长x宽x厚）PLLA / PLG加入4 ml的细胞培养基之前的支架和种子细胞悬液在一个6孔板，使细胞外基质溶液固化（30分钟_{，37℃，5％}的CO 2）。
5. 植入前孵育支架十天和更换培养基每隔一天。

2.在开始手术过程

1. 制备和消毒（高压釜）以下外科工具:一个小的，细的，直剪刀，剪刀弹簧，直链，细尖镊子，锯齿状镊子和针保持器。
2. 通过混合425微升氯胺酮和在1ml注射器将75μl赛拉嗪在一个微量离心管甲苯噻嗪溶液:准备氯胺酮的混合物。
3. 稀释0.3毫克/毫升丁丙诺啡在无菌盐水（1:20）。

3.皮瓣建筑（植骨）

1. 使用胰岛素注射器，麻醉小鼠通过腹腔注射氯胺酮:甲苯噻嗪（每35微升将20克体重）。
2. 皮下注射丁丙诺啡的opperation之前（0.05-0.1毫克/千克最终浓度）。
3. 将鼠标放在加热到37℃的阶段，以确保正常的身体温度，然后加以固定使用粘合剂绷带鼠标。
4. 用棉花提示，管理润滑眼膏鼠标的眼睛（以避免脱水）。
5. 使用棉提示，干净的切口部位用碘，然后用70％的乙醇，以建立一个无菌的工作​​领域。
6. 使用小剪刀和镊子，通过皮肤做一个切口，从膝盖到腹股沟韧带的水平，平行于股血管，直到股动脉和静脉（AV）容器被暴露。
7. 使用牵引器，以获得对组织更好地进入按住皮朝下。
8. 使用弹簧剪刀和镊子，小心翼翼地从周围组织分离的股动脉和静脉血管。从腹股沟韧带的水平开始柔夷花序的腹壁上血管的分叉。离开深在不变，为了保持血液流向腿和防止后续缺血。
9. 折叠移植物（从第1节）在外露的股AV，下方和深在分叉的胫骨和proneal AV以上，并加入用8-0丝线缝合的两端。
10. 为了确保植入血管的毛细血管从只股AV血管发芽，裹一块无菌乳胶周围的移植，缝合用6-0缝线。
11. 关闭用4-0丝线缝合覆皮肤。
12. 密切监视鼠标，直到从麻醉中以及此后每隔一天恢复，直到移植物被转移的皮瓣。皮下注射丁丙诺啡一天两次2-3天（0.05-0.1毫克/千克最终浓度）。
    注意:使用盐水中的任何阶段，以避免暴露组织的脱水。

4.皮瓣转移

1. 在一个或2周植入后，麻醉小鼠通过腹腔注射氯胺酮:甲苯噻嗪（35微升/ 20克），用胰岛素注射器。
2. 皮下注射丁丙诺啡的opperation之前（0.05-0.1毫克/千克最终浓度）。
3. 将鼠标放在加热到37℃的阶段，以确保正常的身体温度，然后加以固定使用粘合剂绷带鼠标。
4. 用棉花提示，适用润滑眼膏鼠标的眼睛（以避免脱水）。
5. 使用棉提示，清洁切口部位（从膝盖区域到腹部）与碘，然后用70％的乙醇，以建立一个无菌的工作​​领域。
6. 用剪刀和镊子，小心地打开在皮肤的缝线和，使用剪刀，通过平行于腹股沟韧带皮肤做一个切口，通过腹侧皮肤持续。
7. 小心取出乳胶片钳和暴露血管皮瓣。
8. 使用sciss口服补液盐和镊子，解剖从周围组织的组织瓣。
9. 使用镊子和持针器，结扎股骨AV同8-0丝线缝合，以防止从AV出血的前端。然后，烧灼该AV膝盖处的水平，远侧到折叠植入组织和8-0缝线。
10. 轻轻转移股骨的AV由接枝笼罩，朝向腹侧腹壁，避免了对动脉，以确定在该距离的全部厚度缺陷应。
    注意:拉动动脉太远会损伤动脉。
11. 用细剪刀，使腹腹壁切口。
12. 利用弹簧的剪刀，使在所述腹直肌的切口。除去腹直肌与上覆皮肤的大致1厘米×0.8厘米的段。
13. 转移股骨的AV，由血管接枝笼罩，作为轴向挡板，以全层缺损的腹侧abdomINAL墙。
14. 缝合皮瓣到周围肌肉组织，用8-0丝线缝合，防止疝气。
15. 为了避免缝合内脏器官，缝合皮瓣的腹肌，当提高用镊子肌肉。离开腹侧皮肤暴露于模拟的完整腹壁缺损的效果。
16. 支付与碘化纱布和无菌绷带，以防止暴露区域的污染的皮肤伤口。
17. 缝合用4-0丝线缝合腿部的皮肤上。
18. 密切监视鼠标，直到从麻醉中以及此后每隔一天恢复，直到瓣检索。皮下注射丁丙诺啡一天两次2-3天（0.05-0.1毫克/千克最终浓度）。
19. 注:使用生理盐水中的任何阶段，以避免暴露组织脱水。

5.超声测定移植物血管​​灌注

注:转让前，血管灌注Øf显示接枝的测量是在一周和两周植入后，通过超声。

1. 麻醉，用2％异氟醚的鼠标。
2. 将鼠标放在加热至38℃的可动载台，以确保正常的身体温度，然后加以固定使用粘合剂绷带鼠标。
3. 找到股动脉和静脉血管与B模式设置非线性传感器。
4. 检查使用换能器上的彩色多普勒模式中设置的移植物的股血管的通畅。
5. 根据制造商的说明制备非靶向造影剂。
6. 尾静脉导管（12厘米管有27G的针头）连接到1毫升注射器装满盐水。固定旁边的鼠标在加热阶段的注射器（避免注射器的运动）。
7. 导管连接到小鼠尾静脉，并固定针。
8. 注入一些盐水的既确保注射正在作出进入静脉并填补用生理盐水管（避免产生气泡）。
9. 填充1ml注射器，用70微升的造影剂，并更换盐水注射器与造影剂的注射器。
10. 设置了超声波图像注射造影剂。在非线性模式的属性设置的帧数到1500和中断脉冲，以帧的30％。
    注:中断脉冲之后，微泡重新填充容器的速率依赖于毛细管的微泡的流速和是独立于微泡的喷射率。帧的数量可以根据填充时间^19,20被改变。
11. 慢慢造影剂注入到尾静脉。
12. 在高分辨率超声系统的非线性对比度模式拍摄图像。
13. 分析使用软件的结果，如前所述^19,20。
    1. 所获得的图像IM绘制的感兴趣区域（ROI）的区域后治疗中的中断脉冲在造影模式。投资回报率应列出填补只造影剂的区域。
    2. 计算峰值增强（PE），这是在注入微泡与中断脉冲之后的后非线性信号的平均强度的比率，并且是灌注体积的量度。
    3. 计算流率，这是从时间（T）经过多，直到峰值信号（P）决定的。

6.确定移植血管化的程度

注:组织移植血管的程度植入后一两个星期确定。

1. 使用胰岛素注射器，麻醉小鼠通过腹腔注射氯胺酮:甲苯噻嗪（35微升/ 20克）。
2. 用1ml注射器，静脉内注射200微升10毫克/毫升异硫氰酸荧光素缀合的葡聚糖（FITC-葡聚糖，MW = 500000）至尾静脉。
3. 十秒完成注射后，安乐死小鼠通过颈脱位。
4. 打开鼠标的腿，露出移植。
5. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤接枝区域并应用10％中性缓冲福尔马林中。
6. 图片嫁接在老鼠腿上，用共聚焦显微镜。
7. 量化功能性血管密度（FVD）。
   1. 隔离共焦显微图像的绿色通道（激发= 488纳米）。
   2. 通过高通滤波器传递所产生的图像，以突出的高对比度的结构。
   3. 使用去斑点过滤器，以消除可能已经被放大了高通滤波器的噪音。
   4. 设置所产生的图像上阈值;阈值被调整，使得在原始图像中的特征和结构是在二进制图像中可见。
   5. 适用的尺寸阈值，以便只有团连接的像素的比所定义的SIZ较大ê阈保留在二值图象。
   6. 大纲中使用张孙算法²¹的移植物血管的骨架。
   7. 通过累加每个容器的中线的长度和结果除以所述ROI的区域计算FVD。

移植物的7免疫组织学和组织学染色

1. 免疫组化染色
   1. 经过共焦成像，获取用小剪刀和镊子的移植。解剖的AV血管移植物的两个端部和检索接枝。
   2. 固定在10％中性缓冲福尔马林的移植物30分钟 - 2小时。
   3. 将组织学盒的移植，并存储在70％乙醇，直到石蜡包埋。
   4. 嵌入使用标准的固定和嵌入协议²²石蜡和切片石蜡包埋组织成使用切片机5微米切片。垂直切片整个组织到AV船只。
   5. Deparaffinize的石蜡包埋切片浸泡于100％二甲苯两次，每次10分钟。
   6. 安排在250毫升塑料科普林缸的幻灯片。
   7. 通过串行浸入在每个3分钟递减的乙醇浓度（100％，96％，90％，80％，70％，50％，30％和双蒸水（DDW））再水化。
   8. 通过稀释2.35毫升用250毫升DDW的抗原修复液制备抗原修复解决方案。加热在微波中设置为95℃2分钟的抗原修复溶液。
   9. 再次插入滑入预热抗原修复溶液和热3分钟，在微波设定为95℃。冷却该载玻片到50℃。
   10. 再加热2分钟，然后冷却至室温。
   11. 孵育载玻片在3.3％的H的甲醇_{2 O 2}溶液进行10分钟，在室温以猝灭内源性过氧化物酶的活性，然后在PBS中冲洗两次。
   12. 准备一个孵化室:地方潮湿ABSO内部的组织学盒rbent表和使用干微妙的任务雨刷器的幻灯片。
   13. 圆切片区域上使用疏水笔和孵育在室温30分钟的滑动，用大约50微升山羊血清阻断每片溶液（2％，PBS中制备）。
   14. 稀释的兔抗CD31抗体1:50封闭溶液，应用每片约50微升抗体孵育O / N，在4℃下。冲洗3次，用PBS，每次5分钟。
   15. 稀释生物素化的羊抗兔二级抗体1:400在PBS中，代替过幻灯片大约50微升每片抗体的孵育在室温30分钟。
   16. 冲洗3次，用PBS，每次5分钟。
   17. 稀释链霉抗过氧化物酶1:400在PBS中，采用大约50微升每片和孵育载玻片30分钟，在RT。冲洗3次，用PBS，每次5分钟。
   18. 应用每片约50微升aminoethylcarbazole的（AEC）底物，根据制造商＆＃8217的说明。浸在DDW幻灯片停止反应。
   19. 通过浸渍部分在大约50微升，2分钟Mayer的苏木溶液染色为蓝色的细胞核。轻轻在水冲洗，然后盖上安装介质中的部分。
   20. 采用双盲的方法量化CD31阳性染色。 CD31染色显示其为棕色色斑。选择双目显微镜下以40倍倍率视野4-5不同的领域。算的CD31阳性流明数。
       1. 除以计数的流明的总数与字段数和fieldarea（根据双眼视数据）计算每个支架的CD31阳性流明的平均数目。
          注:施加试剂量必须足以覆盖整个概述切片。
2. 组织学染色
   1. 固定在10％中性缓冲福尔马林移植物。
   2. 使用标准的石蜡中嵌入移植固定和嵌入程序。
   3. 通过浸没在100％二甲苯中删除从石蜡包埋切片的石蜡两次，每次10分钟。
   4. 快洗两次补液100％异丙醇。
   5. 快洗两次95％乙醇。
   6. 自来水冲洗三次。
   7. 沉浸在苏木10分钟。
   8. 自来水冲洗三次。
   9. Immere在曙红2分钟。
   10. 快洗脱水95％乙醇的两倍。
   11. 快速洗100％异丙醇的两倍。
   12. 快速洗100％二甲苯的两倍。
   13. 盖上DPX胶与玻璃盖1.5mm厚。
   14. 在图像放大40倍的显微镜使用。

8.机械性能评估

1. 检索用小剪刀和镊子的移植。
2. 在冲洗PBS移植。
3. 测量移植物的宽度和厚度，并计算所述横截面面积作为宽度乘以厚度。
4. 我们e本测试仪，以产生水合移植物的应力 - 应变曲线。
   1. 挂载系统拉伸夹具之间的移植和测量两个交手（ 即 ，最初的长度）的最终长度。
   2. 适用的0.01毫米/秒的应变速率，直到失败。
   3. 记录使用制造商的协议的开发力和位移。
   4. 产生在Matlab的应力 - 应变曲线。
      1. 根据位移由初始长度划分计算应变。应力计算为所测量的力除以截面积除以。
      2. 确定的刚度作为线性区域中的应力 - 应变曲线的斜率和曲线的最大点是极限拉伸强度。

结果

移植物血管灌注体内

该移植物之前，他们传递的轴型皮瓣植入一个或两个星期。在一周和两周植入后，大体观察接枝区域的揭示可行和血管化组织移植物。这些移植物被证明是高度血管化的，如通过正CD31免疫染色（图1A）来确定，和高度灌注，就证明了FITC-葡聚糖尾静脉注射和超声测量。许多血管已经在一周植入后，这个数字增加一周后在该AV血管附近显著上升观察到。 FITC-葡聚糖基于判定官能血管密度（FVD）（图1B）的结果表明，移植物血管化高度以一周着床后，并且没有显著变化发生在附加周体内 。血管开放和灌注进行了论证通过超声成像（在FVD为5.71毫米^{- 1±0.51}毫米^{- 1和} 10.28毫米^{- 1±2.71}毫米^{- 1，}一周和两周植入后，分别） 图1C确认主机股骨血管开放和完整性接枝植入...

讨论

在组织工程的进展已经达到与替代组织不断增长的需求重建的各种组织类型。各种合成的^1,17,18和生物^14-16材料以及形成方法进行了评估它们，以解决这些需求的能力。然而，尽管在临床护理和组织工程的进展，全层腹壁缺损恢复仍然是一个挑战。一种组织足以重建如此大规模的缺陷必须为（1）厚和（2）血管，并证明（3）的机械完整性，以及（4）存活力随时间^23。

这里，我们提出，用于创建一个厚的，可行的，和血管化组织瓣，它可以作为替代自体组织瓣的工序一步详细协议。在制作瓣分两个步骤构建:（1）PLLA / PLGA支架是围绕谅解备忘录的AV血管植入本身后肢和从周围组织中分离出来，以允许血管由仅在AV血管。 （2）创建的血管，厚组织瓣然后转移与AV艘，其中担任其蒂，成为一个全层腹壁缺损。

正确的皮瓣血管是其主机^17,18,24内成功整合至关重要。各种方法，以提高氧的供应和扩散在厚组织创建血管工程组织，已在文献中讨论。在这些之中，涉及对各种脚手架类型^1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小细直剪刀	精细科学工具 （FST）	14090-09
弹簧剪刀	精细科学工具 （FST）	15003-08
带细尖的直镊子	精细科学工具 （FST）	11251-20
锯齿镊子	精细科学工具 （FST）	11050-10
持针	精细科学工具 （FST）	12500-12
小型容器烧灼机	精细科学工具 （FST）	18000-00
Duratears	Alcon	5686
Sedaxylan	Euravet	DJ03
氯硝胺 1000	Vetoquinol	4A0726B
丁丙诺啡	vetmarket	B15100
4-0 丝线缝合	Assut 缝合线	647
6-0 聚丙烯缝合线	Assut 缝合线	9351F
8-0 丝线缝合		684568
胰岛素注射器（6 mm 针头）	BD	324911
Vevo 2100 高分辨率超声系统	VisualSonics inc.
MS250 非线性传感器	VisualSonics inc.
微标记非靶向造影剂	VisualSonics inc.	VS-11694
尾静脉导管	VisualSonics inc.	VS-11912
Vevo 2100 软件	VisualSonics inc.
异硫氰酸荧光素偶联的葡聚糖	Sigma	FD500S
Matlab	Mathworks， MA， USA
Kimwipes	Kimtech	34120
抗原修复液	载体实验室	H-3300
抗 CD31 抗体	Abcam	ab28364
生物素化山羊抗兔（二抗）抗体	Vector laboratories	BA-1000
链霉亲和素-过氧化物酶	Jackson	016-030-084
Mayer's 金缕木精溶液	Sigma-Aldrich	MHS-16
氨基乙基咔唑 （AEC） 底物试剂盒	Life technologies， Invitrogen	2007
Vectamount	Vector 实验室	H-5501