枯否细胞分离的纳米粒子毒性测试

摘要

肝巨噬细胞，称为库普弗细胞，负责捕获循环纳米颗粒。我们在这里描述了一种高细胞纯度和产量的 Kupffer 细胞分离方法。这里使用改良的 LDH 测定法来测量碳纳米管在 Kupffer 细胞中诱导的毒性。

摘要

绝大多数体外 nanotoxicological研究已经使用永生化细胞系为他们的实用性。然而，从纳米颗粒的毒性测试结果在永生化细胞系或原代细胞已经显示不符，强调需要延长使用的原代细胞的体外测定法。这个协议描述了小鼠肝巨噬细胞的分离，命名Kupffer细胞，以及它们的使用来研究纳米颗粒的毒性。 Kupffer细胞是最丰富的巨噬细胞群在体内和构成网状内皮系统（RES），负责循环纳米颗粒的捕获部分。这里报道的枯否细胞的分离方法是基于一种两步灌注法进行纯化上密度梯度。该方法的基础上，胶原酶消化和密度离心，适于从由Smedsrød 等人开发的原始协议。专为大鼠肝细胞的隔离和n和提供高产率（每鼠14×10 ⁶个细胞）和枯否细胞的高纯度（> 95％）。这种隔离方法不需要复杂的或昂贵的设备，因此代表的复杂性和细胞产量之间的理想折衷。使用较重的小鼠（35-45克）提高了分离方法的产量，但也有利于显着的门静脉插管的过程。的官能化的碳纳米管˚F-CNTs毒性测定在该模型由改性的LDH测定。该方法通过测量缺乏的枯否细胞膜结构完整性孵育以f -CNTs后评估细胞生存力。毒性反应为f -CNTs可以使用一致此法来衡量，强调指出，孤立的枯否细胞对纳米颗粒的毒性测试非常有用。纳米毒理学的整体理解可以受益于这种模式，使得纳米颗粒的选择临床翻译更多艾菲cient。

引言

纳米毒理学研究领域的目的是表征纳米颗粒的生物效应。基于在体内研究毒理学研究仍然是最精确的方法。然而，它们的使用受到它们的成本，劳动和时间要求¹限定。作为替代， 在体外测定法已被使用，因为它们的简单性和开发高通量体外测试平台²的可能性-如此延伸的测试条件的数量。最nanotoxicological研究使用体外测定与永生化的细胞系进行。然而，也有关于这些实验的结果外推到体内毒理学影响³担忧。事实上，永生化细胞系的性质可以是显著不同从组织它们衍生自， 例如 ，遗传转化^4，关键形态特征恶化5，细胞极性⁶和功能的改变，如炎症介质⁷的调节的丧失。

Kupffer细胞是最丰富的巨噬细胞群中的主体，并直接与血液接触由衬肝血窦的壁上。作为网状内皮系统（RES）的一部分，这些巨噬细胞是负责循环纳米颗粒和因此的捕获，构成一个非常合适的模型来研究纳米颗粒的毒性。 体内 ⁸ 并在体外与暴露于纳米粒子枯否氏细胞相关的炎症反应⁹研究已在其他地方发表。枯否细胞也参与肝脏疾病的发病机制，如酒精性肝病^10，肝纤维化¹¹或病毒性肝炎^12。据报道，孤立的枯否细胞提供了有益的启示来形容细胞机制INVolved肝破裂^13,14。

几种方法已经报道了分离和纯化Kupffer细胞。细胞的分离可导致机械或酶解^15。胶原酶消化节约表明枯否细胞的功能完整性，而导致高枯否细胞产量¹⁶的优势。许多实验方法，在复杂性和成本不同，已用于Kupffer细胞从其他肝细胞群中分离出来。例如，枯否细胞纯度可通过免疫亲和^17，流电泳^18，选择性粘附¹⁶或通过离心技术^16，根据它们的大小和密度而选择的细胞来实现。这些方法的组合可以被选择为增加的人口¹⁶的纯度。没有关于对枯否细胞分离的理想方法共识的，因为它主要取决于应用和可用的equipmen吨。然而，在纳米颗粒的毒性测试的情况下，简单性和高收率与Kupffer细胞的功能保存相关的技术似乎是对本申请中最适合的。

这里报道的枯否细胞的分离方法是基于一种两步灌注法进行纯化上密度梯度。该方法是从由Smedsrød 等人开发的原始协议进行修改^。16设计用于大鼠肝细胞的分离。大多数研究报告，并从大鼠肝脏描述Kupffer细胞的分离。在此，我们描述了一种方法，从小鼠肝脏分离Kupffer细胞，以高收率和纯度。使用小鼠降低了实验成本，并允许几个肝脏的处理，以获得纳米颗粒的毒性测试大量Kupffer细胞。

在下面的协议，枯否细胞与官能化的碳纳米管（六 -CNTs）。碳纳米管的独特的物理化学性质- 即高长径比和表面积大，都取得了碳纳米管有趣候选作为用于治疗和诊断目的的载体。然而，忧虑已提出了关于碳纳米管¹⁹的毒性，以及新的体外测试的发展旨在提高CNT生物效应的理解。在枯否细胞毒性与缺乏细胞膜的结构完整性有关。这是通过胞质酶LDH的损失从细胞到上清液计量。这种方法的原理，因此，是除去任何释放LDH和测量什么留在电池^20。这在要求完成测量所释放的LDH在上清液因为CNT的上清液中的存在干扰测定^21。

我们建议使用这种简单和成本效益枯否细胞的分离实现方法具的d，来分离大量的功能枯否细胞。这允许范围的纳米颗粒的毒性的筛选，在一个相关的初级巨噬细胞的模型。

方案

所有的动物实验均符合所有相关的准则，法规和监管机构执行。所演示的协议英国内政部监管的指导和批准下进行

1.灌注和细胞采集（图1）

图1:肝灌注的小鼠的麻醉之后，消化道横向移动到腹部的左侧，以使门静脉（PV）的访问。光伏使用的EGTA / HBSS溶液缓慢的流速（1-3毫升/分钟）和下veina静脉（IVC）是空心立即破裂，以避免肝脏内的任何超压。内灌注的第一分钟，流速逐渐增加至7毫升/分。胶原酶溶液，然后灌注以10毫升/分钟，直到其完全消化的实现。

1. 编写，J再新鲜的材料表中描述的所有试剂。
2. 暖EGTA（乙二醇四乙酸）/ HBSS（Hank氏平衡盐溶液）溶液（每只小鼠50ml）和胶原酶溶液（每只小鼠100毫升）中30分钟，在40℃。
3. 首先用70％乙醇冲洗泵软管。倾40毫升EGTA / HBSS溶液到离心管浸在水浴中，并冲洗泵软管与预热EGTA / HBSS解。
4. 使用巴比妥类药物的呼吸抑制而死亡之前，可靠地生产无意识进行终端麻醉。苯巴比妥注射1毫克/千克，IP为女性或男性CD1小鼠（35-45克）。确认由麻醉捏脚趾。
5. 剃腹部毛和消毒用70％的乙醇溶液中的腹部表面。
6. 切断通过腹腔和通过横向移动肠道到腹部的左侧露出门静脉和下腔静脉。
7. 明星T中的泵以1-3毫升/分钟，EGTA / HBSS解决方案的速度和导管插入使用23克蝴蝶针门静脉（翅切）。夹住门静脉插管与23政针的部分，然后翻转serrefine镊子在打开小鼠腹部的表面上。肝脏应该在前30秒EGTA / HBSS解决方案灌注内迅速苍白。
8. 快速切割下腔静脉的下部，以避免在肝脏过量压力建筑物，再逐渐增加的流速至7毫升/分钟，在灌注的第一分钟。动物死亡是由于出血继发腔静脉穿刺。
9. 当降到低于5毫升EGTA / HBSS解决方案是将剩余的离心管，填补它与胶原酶溶液（40-50毫升）。逐渐增加的流速10毫升/分钟，在30秒内。
10. 通过将压力施加到下腔静脉 ，使用镊子，5-10秒的间隔使肝脏膨胀。 THIS能周期性地进行（在消化过程中的5-10倍）。此步骤会改善肝细胞​​解离，降低了灌注时间用胶原酶。
11. 当小于10毫升胶原酶溶液保留在离心管内，倒入40-50预热的胶原酶溶液放入离心管中。
12. 后灌注10-15分钟，约70-80毫升胶原酶溶液灌注，应用用钳子肝脏的表面上的小的压力。压力的打印指示肝细胞解离。
13. 从腹腔取出肝作为一件，并将其放置在含有20-30毫升库普弗细胞分离培养基的离心管中。保持肝细胞在冰上或4℃下进行3小时的最大时间段，以避免影响肝细胞活力。
14. 上重复，如果需要几个动物的灌注过程中，同时保持灌注肝脏在冰上。游泳池差一分三时肝脏净化并继续第3阶段。

2.制备的密度梯度离心的（图2）

图2:密度梯度的制备所有步骤均在无菌条件下进行。所述SIP通过混合15.3毫升涂布二氧化硅粒子的溶液1.7毫升10×PBS中制备。将5ml的SIP都用15毫升的PBS混合以赚20毫升25％的SIP溶液。 10毫升SIP都用10毫升的PBS混合以赚20毫升50％的SIP溶液。缓慢加入用血清学25毫升吸管含有50％的SIP溶液（20毫升）的倾斜，并使25％的SIP溶液（20毫升）的离心管中。

1. 继续在无菌条件下以下步骤（部分2，3，5，和），并保持细胞在冰上或4℃。通过混合15.3毫升涂布二氧化硅粒子溶液1.7毫升10×PBS准备SIP（等渗包覆二氧化硅粒子溶液）。 为了赚20毫升25％的SIP解决方案，混合5毫升SIP用15毫升的PBS。为了赚20毫升50％的SIP解决方案，混合10毫升SIP用10毫升的PBS。
2. 填空的话就是离心管20毫升的50％的SIP解决方案。倾斜离心管以一个角度接近90°，在侧壁的管慢慢加入25％的SIP溶液（20毫升）用25毫升血清吸管，而不触及50％的SIP层的表面上。当加入25％的SIP溶液，逐步减少管的角度。保持密度梯度在冰上直到使用。

3.库普弗细胞的纯化（图3）

图3:库普弗细胞通过密度梯度离心和细胞粘附的纯化所有步骤均在无菌条件下进行。 （A）中的Glisson囊破裂后，肝细胞通过一个1过滤00微米的过滤器。将悬浮液离心×50克至丢弃肝细胞（粒料），并收集非实质细胞部分（上清液）。这个步骤重复3次。非实质细胞加入上不连续等渗梯度的顶部，并在800×g离心离心15分钟。从25％的SIP坐垫收集库普弗细胞通过细胞粘附的选择进一步纯化。 （B）的细胞接种于24孔板中并在37℃和5％CO ₂的30分钟。非贴壁细胞用500微升的HBSS洗涤一次。 Kupffer细胞显示镀层，当f -CNTs可以加入到细胞中后，其贴壁形态学4小时。比例尺为25μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 放一灌注肝脏在培养皿用15ml枯否细胞分离培养基。破裂格利森囊（用剪刀和释放所有肝细胞进入枯否细胞分离介质肝脏膜）。过滤溶液，虽然以被收集在一个离心管中100微米的细胞滤网。重复上附加灌注肝脏的灌注过程和（从三只小鼠从一个鼠标15毫升，高达45毫升）中汇集的细胞以相同的离心管中。
2. 离心细胞悬浮液，在50×g离心在4℃下2分钟。实质细胞（肝细胞）将在颗粒和非实质细胞（包括Kupffer细胞）将在上清液中。
3. 收集在一个干净的离心管中，离心上清，在50×g离心每2分钟。重复此步骤三次。
4. 离心机在1350×g离心15分钟以沉淀非实质细胞。弃上清，悬浮颗粒在10毫升枯否细胞分离培养基。
5. 添加的非实质细胞溶液的不连续等渗梯度五十分之二十五％，如在2.3中描述。一分钱rifuge在850 XG 15分钟没有加速或休息。
6. 本地化的25％的SIP分数接近25/50％SIP接口（ 图3）内出现混浊的富集库普弗细胞级分。使用10ml的血清吸液管，吸出约12毫升富集库普弗细胞级分的。转移细胞到含35-40毫升库普弗细胞分离培养基的离心管中。轻轻混匀离心机在1350×g离心15分钟，在4℃以沉淀细胞。
7. 丢弃在5-10毫升预热的枯否细胞培养基的上清液和重悬细胞。计数细胞（血球），并使用台盼蓝染色法测定存活率。
8. 板的纯化的非实质细胞在24孔板在^5×10 5细胞/孔的密度。孵育细胞在37℃和5％的CO _2（ 图3）。 30分钟后，轻轻取出介质，洗涤预热Hank氏平衡盐溶液（HBSS）一次，然后更换它用500μl新鲜的和预温热库普弗细胞培养基（每孔）。
9. 离开Kupffer细胞至少4小时，在37℃和5％的CO ₂治疗之前，纳米颗粒，以使它们能够获得他们附着的形态。

4.表征

1. 枯否细胞纯度
   1. 准备用于保持库普弗细胞活力新鲜的PBS / BSA溶液。用500μl的PBS / BSA溶液洗一次细胞。取出PBS / BSA溶液分离枯否细胞在500微升新鲜的PBS / BSA溶液用温柔刮擦。当细胞置于24孔板中，缩短刮刀的末端用剪刀，使脱离更容易进行。传递细胞成流式细胞仪管。
   2. 计数使用血球和离心机1×10 ⁵个细胞在1350×g下Kupffer细胞。重悬Kupffer细胞于30μlF4 / 80抗体（纯）的。拌匀，并在室温下孵育30分钟。保持在冰上的未染色细胞（未孵育的抗体）。
   3. 加入2毫升的PBS / BSA溶液中染色的细胞，离心在1350 g下5分钟，弃去所得的上清液。悬浮在200μlPBS / BSA的染色细胞。
   4. 用于流式细胞术分析，栅万根据它们的大小（前向散射）和粒度（侧向散射）不染色Kupffer细胞。在FL-1通道分析门控细胞的荧光。
   5. 用同样的方法染色枯否氏细胞保持用于未染色术枯否细胞分析流程相同的设置。选择和量化染色细胞的荧光来评估枯否细胞的纯度。
2. 枯否细胞吞噬活性
   1. 用0.5％更换培养基（体积/体积）中的枯否细胞培养基的荧光珠孵育4小时，在37℃和5％的CO _2。
   2. 为了在1350×g离心，二除去非内化珠，离心机Kupffer细胞SCARD上清，悬浮细胞在500μlPBS / BSA溶液。重复此步骤2次以上。
   3. 刮枯否细胞在500微升PBS / BSA解决方案和转移的细胞成流式细胞仪管。
   4. 离心机枯否细胞在1350 XG，丢弃在200微升PBS / BSA溶液的上清，重悬细胞。
   5. 用于流式细胞术分析，栅万根据它们的大小（前向散射）和粒度（侧向散射）不染色Kupffer细胞。在FL-2通道门控分析细胞的荧光。

5.孵化化学官能化的碳纳米管（六-CNTs）

1. 通过超声处理在使用前15分钟，制备˚F-CNTs（1毫克/毫升）的水分散体:F -CNTs制备在内部^22。
2. 准备2倍浓缩碳纳米管F- 分散枯否细胞培养基。 分散在介质中超声处理F-碳纳米管在进行步骤5.3前2分钟）。
3. 对于每个孔，用250微升2倍˚F-CNTs分散取代250微升旧媒体。未处理孔（250微升条件培养基+ 250微升新鲜库普弗细胞培养基的）中，用10％DMSO处理的孔用作阴性和阳性对照，分别为。
4. 孵育Kupffer细胞在37℃和5％CO ₂的24或72小时。

在枯否细胞˚F-CNTs通过修改乳酸脱氢酶（LDH）测定6毒性评估

1. 弃去上清液。
2. 加入裂解缓冲液的200微升（每24孔板孔）并在37℃下进行30分钟-1小时。
3. 进行剧烈吸移后，收集裂解Kupffer细胞成离心管和离心机以40,000×g离心10分钟沉淀物溶解由细胞和细胞碎片使得f -CNTs。
4. 收集上清（ƒ-CNT免费）到离心管并在-20℃储存或继续执行步骤6.5）。
5. 转移50微升到96孔板中并加入底物混合物溶液（LDH试剂盒）等体积的各孔中。覆盖该平板，加入50μl的终止溶液（LDH试剂盒）之前在室温下孵育15分钟。添加含有50微升裂解缓冲液，50微升底物混合物溶液和50微升的终止溶液空白孔的一式三份。
6. 读取490nm处的吸光度在酶标仪并使用以下公式来计算（％）细胞活力。

结果

非纯化的实质细胞的数目是一致的和远程每只小鼠之间8和14×10 ⁶个细胞（17隔离被执行）。每只小鼠隔离足以板16〜28的孔中。通过台盼蓝染色细胞存活率显示出细胞存活率〜95％。库普弗细胞显示内温育30分钟的圆形状，在37℃，与它们的不完全粘合的形态（ 图4A）。在4小时温育，之后，将细胞分散和细胞簇开始形成。

然后枯否细胞的特点，以确认其纯度和吞噬活性。细胞用F4 / 80抗体以证明枯否细胞的纯度。流式细胞仪分析显示95％（ 图4B）以上枯否细胞纯度。细胞与1微米的荧光珠，电镀后12小时，以确认其占用大颗粒的能力。流式细胞仪检测显示THA吨Kupffer细胞的85％以上是吞噬， 即可以占用1微米珠（ 图4C）。经过72小时培养，枯否细胞40％是吞噬，表明枯否细胞部分失去了他们的吞噬能力。

Kupffer细胞培养和f -CNTs 24和​​72小时的显微成像显示相似的...

讨论

下面的步骤是关键的，以实现高产量和枯否氏细胞的高存活率。在无菌条件应用于限制细菌和真菌污染的风险。所有仪器使用前需要灭菌。试剂应在进行分离步骤之前新鲜制备。

Ⅳ型胶原酶的选择，具有低胰蛋白酶的活性，是至关重要的。不同批次来自同一供应商具有不同的酶活性和它们可能需要最初比较，以便选择最合适的批次库普弗细胞分离。这可以通过评估细胞产量和细胞生存力来判断。此外，还建议联系供应商提供已被用于类似的应用批次。一旦决定了批次被使用，保留供将来使用。

插管过程需要培训。计划使用的几个动物成为自信与门静脉插管过程。与实践，成功的插管将很容易地实现并且过程可以由一个人来处理。请注意，使用重动物增加门静脉的直径，因此有利于该过程。当门静脉的后壁被穿孔，这是技术上难以再次访问静脉，特别是如果你是新与该程序，因此，最好是开始一个新的动物。

在HBSS中与胶原酶溶液应具有其pH值调节至7.4，并预先加热至40℃，从37℃的蠕动泵实现的输出温度。用EGTA / HBSS溶液灌注（ ^钙离子...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Euthatal（戊巴比妥钠）	Merial
CD1 小鼠	Charles River	-	小鼠体重应在 35 至 45 g 之间。我们建议使用雄性 CD1 小鼠，因为它们的体重会迅速增加（例如 7 周龄的雄性 CD1 小鼠体重超过 35 g）。还建议提前联系动物供应商以安排运送老年动物。或者，动物可以在室内达到所需的体重。
HBSS （Ca2+ 和 Mg2+ ，含碳酸氢盐）	Life Technologies	14175-053	HBSS 必须 Ca2+ 免费。
乙二醇四乙酸 （EGTA） 四钠盐	Sigma-Aldrich	E8145	也可以使用 EDTA，但 EGTA 具有选择性螯合 Ca2+ 的优势。
HEPES （1 M）	Life Technologies	15630-056	100 毫升
IV 型胶原酶	沃辛顿	CSL-4	建议测试不同批次的胶原酶，或者至少向供应商提及产品必须适合肝细胞分离
低血糖 DMEM	Sigma-Aldrich	D5523	500 毫升
RPMI（含丙酮酸钠和 Glutamax）	Life Technologies	12633-012	500 毫升
青霉素/Steptomycin	Life Technologies	15140-122	100 ml
胎牛血清	第一链接	60-00-850	500 毫升
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154	100 毫升
涂层二氧化硅颗粒溶液 （Percoll）	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll® 非常稳定，可以保存几年
1x 磷酸盐缓冲盐水	Life Technologies	10010-023	500 毫升
10x 磷酸盐缓冲盐水	Life Technologies	70011-036	500 ml
二甲基亚砜	费舍尔	D/4120/PB08	500 毫升
LDH 试剂盒 （CytoTox 96）	Promega	G1781	避光保存
不含 DMEM 酚红	的 Life Technologies	31053-028	500 毫升
F4/80 抗体 （Alexa 488）	AbD Serotec	MCA497A488	请勿稀释，直接用于流式细胞术
荧光微珠	Sigma	L2778	乳胶微珠，胺改性聚苯乙烯，荧光红。1 ml
材料公司名称		货号	评论/Description
蝶形采血套装（23 G/305 mm 长管）	BD
针头式过滤器 （0.22 μm 蓝边）	迷你萨特	16534-K
离心管（50 ml 蓝帽）	BD Biosciences， 猎鹰	35 2070
培养皿 （90 x 15 mm）	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 μM 细胞过滤器	BD	352360
蠕动泵	沃森·马洛	SciQ 300	每次使用前后用无菌 PBS 和 70% 乙醇冲洗管路。
24 孔板	Corning	3526
96 孔板	康宁	3595
离心机	Eppendorf	5810R
微孔板检测仪	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine 镊子	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	Serrefine 镊子允许用 23 G 针夹住插管的血管，而无需在灌注过程中握住镊子。网址： （http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html）
流式细胞仪管	BD Biosciences， Falcon
微量离心管 （1.5 ml）	Elkay	000-MICR-150
细胞刮刀	BD Biosciences， Falcon	353086	用剪刀剪开刀片末端，刮擦 24 孔板中的细胞。
试剂公司名称		货号	评论/Description
EGTA（乙二醇四乙酸）/HBSS（汉克平衡盐溶液）溶液			HBSS 含有 0.5 mM EGTA 和 25 mM HEPES。将 pH 调节至 7.4。为每个肝脏准备 50 毫升灌注。
胶原酶溶液			DMEM 低葡萄糖含 IV 型胶原酶，100 UI/ml，15 mM HEPES 和 1% 青霉素/链霉素 （v/v）。将 pH 调节至 7.4。为每个肝脏准备 100 毫升灌注。添加胶原酶后，建议在使用前将溶液加热 30 分钟。这使得胶原酶活性达到最佳状态。
Kupffer 细胞分离培养基			RPMI 含有，1% 非必需氨基酸 （v/v），1% 谷氨酰胺®（v/v） 和 1% 青霉素/链霉素 （v/v）。准备至少 100 毫升用于 1-3 个肝脏。
Kupffer 细胞培养基			RPMI 含有 10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸 （v/v）、1% Glutamax®（v/v） 和 1% 青霉素/链霉素 （v/v）。准备至少 100 毫升用于 1-3 个肝脏。
SIP（等渗涂层二氧化硅颗粒溶液）			将 1.7 ml 10x 磷酸盐缓冲盐水与 15.3 ml Percoll® 混合，得到 17 mL SIP。
25% SIP 解决方案			将 5 ml SIP 与 15 ml 1x 磷酸盐缓冲盐水混合
50% SIP 解决方案			将 10 ml SIP 与 10 ml 1x 磷酸盐缓冲盐水混合
裂解缓冲液			含 0.9% Triton X-100
PBS/BSA 溶液			制备新鲜的磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 1% 牛血清白蛋白。