肝脏巨噬细胞，称为库普弗细胞，负责捕获循环中的纳米颗粒。本文介绍一种高纯度和高得率的库普弗细胞分离方法。此处采用改良的乳酸脱氢酶（LDH）检测法来测定碳纳米管在库普弗细胞中诱导的毒性。
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摘要
摘要
绝大多数 体外 纳米毒理学研究因其实用性而常使用永生化细胞系。然而，纳米颗粒毒性检测在永生化细胞系与原代细胞中的结果存在差异，凸显了有必要扩大原代细胞的应用 体外 检测方法。本方案描述了小鼠肝脏巨噬细胞（称为库普弗细胞）的分离及其在纳米颗粒毒性研究中的应用。库普弗细胞是体内最丰富的巨噬细胞群体，属于网状内皮系统（RES），负责捕获循环中的纳米颗粒。本文报道的库普弗细胞分离方法基于两步灌注法，随后通过密度梯度进行纯化。该方法结合胶原酶消化与密度梯度离心，改编自Smedsrød最初建立的方案。 等专为大鼠肝细胞分离设计，可提供高产量（高达 14 x 106 每只小鼠的细胞数）和高纯度（>95%）的库普弗细胞。该分离方法无需复杂或昂贵的设备，因此在操作复杂性与细胞得率之间实现了理想的平衡。使用体重较大的小鼠（35–45 g）可提高细胞分离得率，同时也显著便利了门静脉插管操作。功能化碳纳米管的毒性 f-在此模型中，通过改良的LDH检测法测定CNTs。该方法通过检测库普弗细胞与样品共孵育后细胞膜结构完整性的缺失来评估细胞活力 f-碳纳米管。由其诱导的毒性 f- 使用该检测方法可对碳纳米管（CNTs）进行一致性测量，表明分离的库普弗细胞可用于纳米颗粒毒性测试。此类模型有助于增进对纳米毒理学的整体理解，从而提高临床转化过程中纳米颗粒筛选的效率。
引言
纳米毒理学研究领域旨在表征纳米颗粒的生物学效应。基于纳米颗粒的毒理学研究 体内 检查仍然是最准确的方法。然而，其应用受到成本、人力和时间需求的限制1作为替代方案， 体外 由于其操作简便且易于实现高通量，已广泛应用于各类检测 体外 检测平台2 - 因而扩展了所测试条件的数量。大多数纳米毒理学研究均采用 体外 使用永生化细胞系进行的实验。然而，人们对于将这些实验结果外推至 体内 毒理学效应3确实，永生化细胞系的特性可能与其来源组织存在显著差异， 例如 遗传转化4关键形态特征的退化5细胞极性丧失6 以及功能改变，例如炎症介质的调控7.
库普弗细胞是体内数量最多的巨噬细胞群体，通过附着于肝窦壁而直接与血液接触。作为网状内皮系统（RES）的一部分，这些巨噬细胞负责捕获循环中的纳米颗粒，因此是研究纳米颗粒毒性的理想模型。体内8 和体外9关于库普弗细胞暴露于纳米颗粒后引发炎症反应的研究已有报道。库普弗细胞还参与多种肝脏疾病的发生发展，如酒精性肝病10、肝纤维化11和病毒性肝炎12
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方案
所有动物实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。本视频所展示的实验方案是在英国政府内政部法规的指导和批准下进行的
1. 灌注与细胞收集（图1）
图1：肝脏灌注。 对小鼠实施麻醉后，将消化道向腹腔左侧横向移位，以暴露门静脉（PV）。使用低流速（1–3 ml/min）的EGTA/HBSS溶液对门静脉进行插管，同时立即切破下腔静脉（IVC），以防止肝脏内压力过高。在灌注开始后的第一分钟内，逐渐将流速提高至7 ml/min。随后以10 ml/min的流速灌注胶原酶溶液，直至肝脏完全消化。
- 根据材料表中所述，所有试剂均需新鲜配制。
- 将 EGTA（乙二醇四乙酸）/HBSS（Hank's 平衡盐溶液）溶液（每只小鼠 50 ml）和胶原酶溶液（每只小鼠 100 ml）于 30 分钟内预热至 40 °C.
- 先用70%乙醇冲洗泵的软管。将40 ml EGTA/HBSS溶液倒入置于水浴中的离心....
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结果
未纯化的实质细胞数量一致，每只小鼠可获得8至14 × 106个细胞（共进行了17次分离）。每次小鼠细胞分离所得细胞足以接种16至28个孔。台盼蓝染色显示细胞活力约为95%。库普弗细胞在37 °C孵育30分钟内呈圆形，与其不完全贴壁的形态相关（图4A）。在孵育4小时及之后，细胞开始铺展并形成细胞簇。
随后对库普弗细胞进行表征，以确认其纯度和吞噬活性。使用F4/80抗体对细胞进行染色，以检测库普弗细胞的纯度。流式细胞术分析显示，库普弗细胞纯度高于95%（图4B）。细胞接种12小时后，与1 µm荧光微球共同孵育，以验证其摄取大颗粒的能力。流式细胞术分析显示，超过85%的库普弗细胞具有吞噬活性，即能够摄取1 µm微球（i.e.，图4C）。培养72小时后，40%的库普弗细胞仍具有吞噬活性，表明库普弗细胞部分丧失了其吞噬功能。
将库普弗细胞与 f-CNTs 共孵育 24 小时和 7.......
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讨论
以下步骤对于获得高产量和高活力的库普弗细胞至关重要。应采用无菌条件以降低细菌和真菌污染的风险。所有器械在使用前均需灭菌。试剂应在进行分离操作前新鲜配制。
选择胰酶活性较低的胶原酶IV至关重要。同一供应商的不同批次其酶活性可能不同，因此在最初需要进行比较，以选出最适合库普弗细胞分离的批次。可通过评估细胞得率和细胞活力来判断其适用性。建议联系供应商，提供曾用于类似应用的批次。一旦确定所用批次，应预留该批次以供后续使用。
插管操作需要经过训练。建议使用多只动物进行练习，以熟练掌握门静脉插管技术。随着操作熟练，成功插管将变得容易，并可由一人独立完成。需要注意的是，使用体重较大的动物可增加门静脉的直径，从而有利于操作。当门静脉后壁被穿破时，再次进入静脉在技术上较为困难，尤其是对于初次操作者而言，因此建议更换新的动物重新开始。
HBSS 和胶原酶溶液的 pH 值应调整至 7.4，并在 40 °C 预热，以使蠕动泵输出的温度达到 37 °C。需要用含 EGTA 的 EGTA/HBSS .......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由欧盟第七框架计划（FP7-ITN）玛丽·居里网络项目RADDEL资助。MB和KAJ谨感谢Joe Varguese和Rui Serra Maia在优化库普弗细胞分离过程中的帮助与建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊巴比妥钠 | Merial | ||
| CD1小鼠 | Charles River | - | 小鼠体重应在35至45克之间。建议使用雄性CD1小鼠，因其体重增长迅速（例如，7周龄的雄性CD1小鼠体重即超过35克）。建议提前联系动物供应商，以便安排提供年龄较大的动物。或者，也可在本单位饲养动物至所需体重。 |
| HBSS（无Ca2+和Mg2+，含碳酸氢盐） | Life Technologies | 14175-053 | HBSS必须无Ca 2+。 |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）四钠盐 | Sigma-Aldrich | E8145 | 也可使用EDTA，但EGTA的优势在于可选择性螯合Ca2+。 |
| HEPES（1 M） | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| IV型胶原酶 | Worthington | CSL-4 | 建议测试不同批次的胶原酶，或至少向供应商说明该产品需适用于肝细胞分离 |
| 低糖DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI（含丙酮酸钠和Glutamax） | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| 胎牛血清 | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| 包被二氧化硅颗粒溶液（Percoll） | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll®非常稳定，可保存数年 |
| 1×磷酸盐缓冲液 | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10×磷酸盐缓冲液 | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| 二甲基亚砜 | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH试剂盒（CytoTox 96） | Promega | G1781 | 避光保存 |
| 无酚红DMEM | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80抗体（Alexa 488） | AbD Serotec | MCA497A488 | 无需稀释，直接用于流式细胞术 |
| 荧光微球 | Sigma | L2778 | 乳胶微球，胺基修饰聚苯乙烯，红色荧光。1 ml |
| 试剂名称 | 公司 | 货号 | 备注/说明 |
| 蝶形采血套装（23 G/305 mm长管） | BD | 367288 | |
| 注射器滤器（0.22 μm 蓝边） | Minisart | 16534-K | |
| 离心管（50 ml 蓝盖） | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| 培养皿（90 × 15 mm） | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm 细胞筛 | BD | 352360 | |
| 蠕动泵 | Watson Marlow | SciQ 300 | 每次使用前后用无菌PBS和70%乙醇冲洗管路。 |
| 24孔板 | Corning | 3526 | |
| 96孔板 | Corning | 3595 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 酶标仪 | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| 血管夹 | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | 血管夹可在灌流过程中夹住插入23 G针头的血管，无需手动持夹。网址：(http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| 流式细胞术管 | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| 微量离心管（1.5 ml） | Elkay | 000-MICR-150 | |
| 细胞刮 | BD Biosciences, Falcon | 353086 | 用剪刀剪去刀片两端，以便在24孔板中刮取细胞。 |
| 试剂名称 | 公司 | 货号 | 备注/说明 |
| EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）/HBSS（Hank平衡盐溶液）溶液 | 含0.5 mM EGTA和25 mM HEPES的HBSS。调节pH至7.4。每灌流一个肝脏准备50 ml。 | ||
| 胶原酶溶液 | 含100 U/ml IV型胶原酶、15 mM HEPES和1%青霉素/链霉素（v/v）的低糖DMEM。调节pH至7.4。每灌流一个肝脏准备100 ml。加入胶原酶后，建议将溶液预热30分钟再使用，以确保胶原酶活性达到最佳。 | ||
| 枯否细胞分离培养基 | 含1%非必需氨基酸（v/v）、1% Glutamax®（v/v）和1%青霉素/链霉素（v/v）的RPMI。每1-3个肝脏至少准备100 ml。 | ||
| 枯否细胞培养基 | 含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸（v/v）、1% Glutamax®（v/v）和1%青霉素/链霉素（v/v）的RPMI。每1-3个肝脏至少准备100 ml。 | ||
| SIP（等渗包被二氧化硅颗粒溶液） | 将1.7 ml 10×磷酸盐缓冲液 与15.3 ml Percoll®混合，得到17 ml SIP。 | ||
| 25% SIP溶液 | 将5 ml SIP与15 ml 1×磷酸盐缓冲液 混合 | ||
| 50% SIP溶液 | 将10 ml SIP与10 ml 1×磷酸盐缓冲液 混合 | ||
| 裂解缓冲液 | 含0.9% Triton X-100的DMEM培养基 | ||
| PBS/BSA溶液 | 新鲜配制pH 7.4的磷酸盐缓冲液，含1%牛血清白蛋白。 |
参考文献
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Ce....
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