本文展示了小鼠胃食管反流的手术操作流程。这些模型是研究胃食管反流病机制及治疗的有用工具，也可能用于巴雷特食管和食管腺癌的相关研究。
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本文内容
摘要
摘要
已有多种外科手术方法被报道可诱导动物产生胃食管反流。本文报道了三种旨在诱导小鼠发生胃内容物、十二指肠内容物或混合内容物反流的手术模型。文中详细描述了手术操作步骤及基本原理。具备外科经验的研究人员经过短期练习后即可掌握该技术。术后大多数小鼠可存活，并发展出类似于人类的反流性食管炎。然而需要注意的是，小鼠与人类食管在组织学上的差异是这些手术模型固有的局限性。若将这些模型用于巴雷特食管和腺癌的研究，可能需要结合基因修饰手段。
引言
胃食管反流病（GERD）是一种慢性疾病，由远端食管长期暴露于胃内容物或胃十二指肠内容物所引起1。长期暴露于这些有害的反流物会损害食管上皮的内在防御机制，从而导致食管炎2。巴雷特食管发生在慢性反流的背景下，是一种癌前病变，可增加食管腺癌的发生风险3,4。尽管该类疾病具有重要的临床意义，但胃食管反流病、巴雷特食管及腺癌的发生机制尚未被充分阐明。
动物模型对于研究人类疾病的病因、病理、分子机制、预防和治疗至关重要。迄今为止，研究人员已利用模式动物建立了多种胃食管反流病（GERD）、巴雷特食管和腺癌的动物模型5,6。小鼠食管内衬复层鳞状上皮，其组织学结构与人类食管相似。尽管小鼠食管在角化程度以及缺乏黏膜下腺体方面与人类食管存在差异，但由于其维持成本相对较低且易于进行复杂的遗传修饰，小鼠仍是一种极具吸引力的模式动物。目前常用于建立小鼠胃食管反流病、巴雷特食管及腺癌模型的方法主要有两种：反流手术和遗传修饰。反流手术是诱导反流的最佳方式，而遗传修饰则可模拟分子水平的改变5,7。将反流手术与遗传修饰相结合，有助于进一步深入理解疾病的发生机制8。
我们及其他研究者已报道了许多外科手术方法6,9：（1）胃反流：幽门结扎、幽门缩窄联合前胃结扎、Wendel胃底成形术、食管-胃吻合术；（2）混....
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方案
所有动物实验均已获得机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 小鼠准备
- 使用体重超过约20 g或年龄超过约6周的小鼠进行手术。
- 手术前，给予小鼠实验室饲料和水 随意摄取 并维持在12小时光照-12小时黑暗的循环条件下。
- 用毛发剪刀剃除手术区域的毛发。通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg氯胺酮和12 mg/kg赛拉嗪进行麻醉。此剂量可在数分钟内使小鼠进入睡眠状态，并为后续手术操作提供充分的麻醉效果。
- 通过捏压足垫，确认角膜反射和肢体回缩反应消失，以判断麻醉是否充分。涂抹润滑性眼膏 以防止眼睛干涩。
- 使用聚维酮碘溶液对皮肤进行消毒。
2. 胃反流模型（图1B）
- 从剑突开始，沿腹中线上方向肛门方向做一条长约 2 cm 的切口。
- 沿腹中线切开腹腔。使用剪刀切除剑突以增强术野暴露。
- 分离并切断肝脏与胃之间的结缔组织。结扎并切断脾脏与胃底之间的血管束，以完全游离胃底。
- 将胃底轻柔向左翻转，显露食管胃交界处的左侧区域。使用锐利剪刀在远端食管的肌层做一条 5 mm 的纵行切口，暴露上皮层。
- 沿相同方向切开上皮层（切口 1，图 1B）。在前胃部分做三个切口（切口....
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结果
大多数小鼠（>95%）可存活于手术。在围手术期，死亡的主要原因包括麻醉剂过量、出血及未知因素。
术后四周 >90% 患有胃食管反流或混合性反流的小鼠 >80% 经历十二指肠反流的小鼠可存活。在此期间，小鼠主要因食管狭窄和无法进食而死亡。这些小鼠表现出严重应激的迹象（弓背姿势、活动减少、呕吐、眼窝凹陷、发声） 等等。）并需要实施安乐死。使用抗生素和输液等医疗措施通常无法挽救这些小鼠的生命。小鼠术后体重通常会下降数克，尤其是存在十二指肠反流的小鼠。然而，体重随后会逐渐恢复并增加。
术后40周 >80%出现胃和混合性反流的小鼠 >70% 经历十二指肠反流的小鼠可以存活。在此期间，部分小鼠可能因营养不良或未知原因死亡。我们已在手术后维持小鼠存活达80周。总体而言，这些小鼠仍然相当活跃且健康。9.
术后四周，反流或多或少会损伤食管上皮的结构。显微镜下可见上皮增厚，乳头延长。上皮细胞出现过度增殖，并伴有炎性细胞浸润.......
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讨论
已建立了多种手术模型以模拟啮齿类动物中的胃、十二指肠及混合性反流。本文所述的这三种手术方法适用于长期实验，且术后存活率较为理想。具备外科经验的研究人员经过短期练习后即可掌握这些技术。
术前腹腔注射麻醉剂、分离肝脏与胃之间结缔组织时造成肝脏撕裂，以及意外损伤血管均可能导致出血。应尽可能避免上述情况。如确需止血，可酌情使用电池驱动的微型电凝器。操作器官和组织时，应尽可能避免过度牵拉。镊子尖端可用棉絮包裹，或使用棉签代替镊子，如同使用筷子般进行操作。小鼠食管具有两层结构，即外层呈红色的“肌层管”和内层呈白色的“上皮管”。当对食管进行切开时，需将两层同时切开。缝合时应保持针距均匀，并准确对合黏膜与黏膜。若缝合间距过大，可能导致漏液；若间距过小，则可能引发狭窄。然而，狭窄可阻塞食物通过，导致术后死亡；而轻微漏液通常可通过局部粘连及纤维化反应自行修复，一般不危及生命。
在实验方案中，有几个至关重要的通用原则需要遵循。手术时间应尽可能缩短（在实验室中约为20-30分钟）。 手术前后无需禁食。事实上，长时间禁食（>1天）可能.......
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披露
其中一位作者（XC）获得了武田药品工业有限公司提供的资助，该资助用于支持与胃食管反流病相关的基础研究。本文所使用的试剂或仪器均非该公司生产。
致谢
本研究受到中国国家自然科学基金（编号：81400590）、美国国立卫生研究院（U54 CA156735）以及武田药品工业有限公司（MA-NC-D-156）研究资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dumont #1 镊子 Dumostar 尖端 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 微型夹子施加镊子 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn 剪刀 3.5" 直型 15 mm 锐/锐碳化钨刀片 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 手术剪刀 5.5" 直型锐/锐 SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 黑色编织丝线 100 码卷轴 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 外科缝合针 1/2 圆形切边 尺寸 12（25 mm 弦长）每包 12 枚 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey 持针器 5" 光滑型 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 微型持针器 5.125" 弯型锁扣 0.6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm 伤口夹施加器 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm 伤口夹 100 个/盒 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA 聚（六氟丙烯-VDF）缝线 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| 林格氏液 | Henry Schein, Inc. | ||
| 氯胺酮 | Henry Schein, Inc. | ||
| 赛拉嗪 | Henry Schein, Inc. |
参考文献
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal m....
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