方法文章

啮齿类动物脑部微量注射研究动机行为的分子基础

DOI：

10.3791/53018

⸱

2015年9月16日

 ,  ,  , 
1Virginia Institute for Psychiatric and Behavioral Genetics, Department of Psychiatry, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Institute for Drug and Alcohol Studies, Departments of Psychiatry, Pharmacology, and Neuroscience, Virginia Commonwealth University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

啮齿类动物是研究行为和复杂精神疾病分子基础的合适模型。通过在清醒啮齿类动物中进行脑部微量注射，可用于阐明疾病的神经生物学基础。本文介绍了一种高效且可定制的脑部微量注射方法，以及用于量化动机的工具性条件行为范式。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑内微量注射有助于阐明复杂行为（如动机）的分子基础。啮齿类动物可作为合适的模型，部分原因是人类与啮齿类动物在对行为相关刺激的反应以及解析刺激-行为结果的神经回路方面具有惊人的相似性。在研究复杂行为的分子基础时，微量注射可用来修饰、增强或沉默特定系统的试剂，是一项不可或缺的技术。然而，为准确解读实验结果，必须精确定位微量注射的靶点。本文介绍一种用于制备手术器械和微量注射针的方法，可实现精确的微量注射，并以极低的成本实现高度定制化。重要的是，若结合 JoVE 其他文章中所述的必要手术操作，该技术可在清醒的啮齿类动物中成功实施。此外，已有多种行为范式适用于测量动机。其中，递增比率法是一种常用方法，通过量化强化物在工作量要求（通常呈指数增长）不断增加的情况下仍能维持反应的能力，来评估其有效性。该检测方法对强化物的强度和药理学干预敏感，因而可用于确定强化效果和/或动机水平。本文还介绍了一种简便的方法，用于编程操作式软件以实现递增比率强化程序。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

啮齿类动物和人类对具有行为学意义的刺激表现出极为相似的反应1-3。这表明，啮齿类动物是研究行为及复杂精神疾病分子基础的合适对象4。理解诸如动机等复杂行为过程的分子基础，通常需要进行脑部微量注射。本文将介绍脑微量注射技术以及一种主要的动机行为检测方法。实验将以大鼠为研究对象，但这些操作方法也可轻松适用于经过良好驯养的小鼠。文中还包括所需套管、堵管（假套管或针芯）和微量注射器的制作方法。所介绍的方法比预制器械具有更高的灵活性和成本效益。这种灵活性在优化实验条件时尤为重要。重要的是，由于微量注射技术可用于验证大量科学假设，本文所述技术应具有广泛的适用性。例如，可通过微量注射受体配体来研究神经化学3,5,6；通过微量注射细胞通透性肽段或小分子化合物来研究细胞内信号通路7-10；通过微量注射毒素、离子通道阻断剂或拮抗剂混合物来研究神经环路1,11,12。

尽管此处提供的通用方案可由使用者根据其特定需求进行调整，但该操作尤其适用于行为学实验，因为微注射是在仅接受轻度手动固定且保持清醒状态的啮齿类动物上进行的。此过程无需麻醉或特殊固定装置。之所以可行，是因为脑组织本身缺乏痛觉感受。然而，若不使用麻醉，则必须通过先前采用立体定位手术植入的导管进行微注射。原因是头皮、脑膜13（即包围大脑的膜状结构）以及颅骨骨膜14（即覆盖颅骨的膜）上均存在伤害性感受器。需要注意的是，在某些情况下，麻醉下进行微注射可能是更理想的选择。例如，当注射病毒时，研究者可能希望直接使用不锈钢针15或玻璃移液管进行注射，因为这可以减少组织损伤并提高转导效率16,17。下文所述的微注射装置可针对此目的进行改装，相关建议可在讨论部分找到。由于其他 JoVE 文章已展示了立体定位脑部导管植入技术18-20，因此本文不再涵盖这些操作步骤。

我们在此介绍这些显微注射操作步骤，并结合一种用于量化动机的检测方法。目前已有多种啮齿类动物动机行为模型在使用中，例如跑道箱和障碍攀爬模型。本文将重点描述如何利用操作性条件反射的渐进比率强化程序来量化动机，其中操作性反应由强化物维持。渐进比率反应对强化物强度具有敏感性21,22。因此，该检测方法通常被用作动机和/或强化效应的替代指标21,23-30。由于已有大量优秀的综述对该主题进行了详细阐述21,24，本文将主要关注实际操作中的注意事项。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

涉及动物实验的程序已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》。

1. 手术和显微注射前的器械准备

  1. 材料准备设置：
    1. 准备26 G套管管、33 G针芯丝、33 G微量注射针管、微量注射器塑料管（PE20或等效型号）、两个中等重量的直止血钳、实验室胶带、直尺、永久性记号笔、70%乙醇（v/v）、储存瓶（例如，20 ml玻璃闪烁瓶）、超级胶水、小型称量舟、配备非重型切割片的旋转工具。
      注意：使用绑带或胶带将旋转工具固定在移液器吸头盒上会有所帮助，因为这样可以抬高工具。使用旋转工具时佩戴护目镜非常重要，以避免受伤。
    2. 在实验台上贴上一段实验室胶带或高压灭菌胶带。
  2. 套管的制备：
    注意：每只大鼠进行双侧注射至少需要两个套管。另需准备一个套管用于后续步骤。
    1. 取一段足够长的套管管，以避免在标记和切割过程中发生弯曲。
    2. 使用细尖笔在步骤1.1.2中的胶带上画一条15 mm的参考线。此线将作为使用锐利永久性记号笔在套管管上标记连续15 mm段的引导线。
    3. 将套管管在已标记的位置接触缓慢旋转的旋转工具切割片，以在管壁上刻出凹槽。将套管旋转180˚，并在管的另一侧同样刻出凹槽。不要完全切断套管管，以免造成堵塞。
    4. 用力弯曲套管管，使其断裂成约15 mm的段。
    5. 用拇指和食指将套管的每一端垂直夹在切割片上，同时旋转套管管，使管端接触切割片的前大面（即，非边缘部分）。这将形成一个钝化尖端。注意：不要弯曲套管，否则可能导致注射位置偏移。
    6. 使用26 G斜面针（棕色针座）对套管两端进行扩孔，以确保所有毛刺已被清除且套管通畅无阻。
    7. 将一段约35 mm长的针芯丝穿过已切割的套管，以验证内部无任何阻塞。
    8. 使用未夹紧的止血钳逐个夹取每个套管，并用直尺测量每个完成的套管，确保其长度恰好为14 mm。
  3. 针芯的制备：
    1. 用中等重量的直止血钳夹住一个套管约一半长度处。将锁定的止血钳平放在实验台上，使套管垂直于实验台。
      注意：此套管在被锁定止血钳夹持后不应再用于手术，因其可能已发生弯曲。
    2. 将针芯丝的一端插入套管，直至其接触实验台。轻轻弹动针芯丝，确保无毛刺阻碍其到达实验台表面；即，到达套管底部。合适的针芯长度可防止堵塞并减少组织瘢痕形成。
    3. 用手指捏住针芯丝进行弯曲，使其形成约30˚的弯角，同时保持针芯与实验台接触。确保弯角方向使其与头帽贴合紧密，多余部分朝前，以增加大鼠自行拔除的难度。
    4. 将针芯丝从套管中取出，并使用小型斜口钳（剪线钳）在距弯角约2.5 mm处剪去多余部分。
      注意：每只大鼠进行双侧注射至少需要两个针芯，因为每个植入的套管都需要一个针芯。在针芯中部额外制造一个约35˚的弯角也有助于防止动物自行拔除。将套管和针芯分别储存在不同的瓶中（例如，20 ml玻璃闪烁瓶），瓶内盛有70%乙醇（v/v），直至使用前，但至少需浸泡过夜（O/N）。
  4. 微量注射器的制备与测试：
    1. 取一段长约1 m的微量注射器针管。
    2. 用锁定的直止血钳垂直夹住微量注射器管的一端。
    3. 在保持管张力的同时旋转止血钳，将管紧密缠绕在止血钳上至少一圈。
    4. 从微量注射器管的另一端（松端）测量32 mm，并用第二个直的中等重量止血钳垂直夹住该点并锁定。夹持时应将止血钳置于32 mm标记靠近松端的一侧，而不是靠近已缠绕导线的止血钳一侧。
    5. 在保持管张力的同时反复弯折管，直至其断裂。
      注意：一次快速上下弯折将产生钝性断裂，这有助于确保微量注射发生在目标脑区。
    6. 检查微量注射器管，确保两端平直且内径通畅无阻。
    7. 取一段将用于制造微量注射器套环的套管管。
    8. 使用永久性记号笔和在胶带上绘制的5 mm参考线（步骤1.1.2），测量并标记套管管上的连续5 mm段。
      注意：每个微量注射器需要一个套环。套环仅为短段套管，粘附于微量注射器丝上。
    9. 将套管管在已标记位置接触缓慢旋转的旋转工具切割片，以在管壁上刻出凹槽。将套管旋转180˚，并在管的另一侧同样刻出凹槽。完全切断可能导致管腔堵塞。
    10. 用力弯曲微量注射器套环管，使其断裂成约5 mm的段。
    11. 使用26 G斜面针（棕色针座）对套环两端的内径进行扩孔，以确保大部分毛刺已被清除。少量小毛刺可抓住微量注射器丝，有助于粘合。
    12. 将一个套环滑入每个微量注射器管，距离末端约2 cm。
    13. 在小型称量舟的角落处形成一小滴超级胶水。
    14. 使用一段约25 mm长的废弃套管管，将少量超级胶水涂抹在微量注射器管的一端约5 mm处。然后将套环滑过胶水珠，使其距离微量注射器管末端约1 mm。用胶水覆盖套环的两端。
      注意：避免在套环上积聚过多超级胶水，否则会阻碍塑料管在微量注射器周围形成密封。虽然必须避免将超级胶水沾到微量注射器管的开口端（否则会使微量注射器无法使用），但也应尽可能将套环滑至末端，以最小化空腔（非注射）体积。
    15. 将完成的微量注射器斜靠在另一个小型称量舟外侧，套环端朝上，静置干燥24小时。
    16. 取一段长约8 cm的微量注射器塑料管（PE20或等效型号）、一支装有无菌水的1 ml注射器，以及一支26 G斜面针（棕色针座）。
    17. 将26 G（棕色针座）针头连接到注射器上，并将已切割的塑料管滑到针头上，注意不要刺破管壁。
    18. 将塑料管滑过已干燥的完整微量注射器的套环端。
    19. 挤压装水注射器的活塞，测试通畅性。
      注意：水应从微量注射器尖端喷出很远且呈直线。如果水流不直，则注射位置将不准确。侧向或弥散喷射的原因通常是断裂质量不佳（步骤1.4.5）。若喷射呈侧向或弥散，则不应使用该微量注射器。不应使用生理盐水，因其可能堵塞微量注射器或针头。
    20. 回拉注射器以从微量注射器中抽出水分。将其储存在干燥、密封的瓶中；例如，20 ml玻璃闪烁瓶。
      注意：大多数超级胶水制造的微量注射器可在制备后进行高压灭菌31，但需通过实验确定。其他灭菌方法包括环氧乙烷和γ射线辐照。

2. 显微注射的准备与操作

  1. 准备完成的微注射器、微注射器塑料管（PE20 或等效型号）、微注射泵、两个小型称量舟、无菌水、70% 乙醇（v/v）、丙酮、两个带钝针头（25 G）的耐压 1 μl 玻璃注射器、棉签、备用堵头、1 ml 注射器、26 G（棕色针帽）针头、小型弯头镊子（推荐使用 #7 型号）以及实验室擦拭纸。
  2. 准备用于注射的微注射器：
    1. 在距离微注射器接头端相反方向 15 mm 处将其弯曲，使两段之间的夹角约为 95˚。
      注意：精确的弯曲位置对于准确的注射定位至关重要。使用 #7 镊子（或类似工具）夹住微注射器并向上弯曲较为有效。每次进行微注射前都应重新测量长度。
    2. 将塑料管（PE20）剪至约 70 cm 长，并套入微注射器的接头部分。
      注意：在靠近微注射器和自由端的塑料管上贴胶带标签，有助于完成注射操作，尤其是在注射两种不同溶液时。不建议在两根管子上都贴标签，以免注射过程中操作不便。
  3. 准备用于微注射的泵：
    1. 打开泵的电源。
    2. 设置微注射针头的直径、所需的输注速率和目标注射体积。
      注意：输注速率和注射体积取决于实验需求，相关内容将在“讨论”部分进一步说明。某些泵已预加载注射器参数表；若无，可在制造商网站上查找相应参数表。
    3. 将泵模式设为“体积”模式，以便自动精确输送指定体积。若选择“泵”模式，则实验人员必须手动停止泵。
    4. 调整泵的后挡块，使注射器能够填充至注射体积再额外增加 0.2 μl。
  4. 准备微注射注射器和微注射器用于注射：
    1. 将每个耐压微注射注射器牢固地固定在微注射泵的支架上。
    2. 将耐压注射器的针尖浸入盛有无菌水的小型称量舟中，轻轻抖动活塞以润滑内部金属丝，然后均匀地将活塞拉至泵的后挡块位置，使注射器充满水。
    3. 将连接在微注射器上的 PE20 管（见步骤 2.2）套在装有无菌水的 1 ml 注射器所连接的 26 G（棕色针帽）针头上，推动注射器使无菌水通过微注射器，观察喷雾形态和距离。
      注意：水应从微注射器尖端笔直且远距离喷出。若水流不直，则注射位置将不准确。
    4. 将已灭菌的微注射器放置于无菌操作区域。
    5. 将管子从针头上取下，保持微注射器管口朝上，防止水滴出，同时用锋利剪刀或刀片在被针头损伤的部位下方剪断管子。
    6. 轻微推动微注射注射器的活塞，在针头末端形成一滴液体，然后将充满水的 PE20 管（连接微注射器）套在该针头上。
      注意：这将形成液-液连接，产生适当的反向压力，有助于清除可能在微注射器尖端形成的堵塞。
    7. 将活塞完全向前推进，为样品加载做准备，并确保微注射器中无任何残留乙醇。
    8. 通过多次将微注射器尖端形成的水滴接触干净的实验室擦拭纸，检查装置是否泄漏。
  5. 注意：接触擦拭纸时，仅应形成一个湿润区域。若出现多个水滴，则系统存在泄漏。
  6. 通过控制胶水的使用量（见步骤 1.4.14）以及每次从连接处取下 PE20 管时均使用锋利剪刀或刀片修剪管端，可避免泄漏。此外，可重复步骤 2.4.3 至 2.4.8 以排除泄漏问题。
  7. 将注射器活塞向后拉 0.2 μl，在 PE20 管/微注射器中的无菌水与待注射溶液之间形成一个气泡。
  8. 注意：该气泡可防止注射液被稀释、防止水被污染，并可在注射过程中通过观察气泡移动来监控注射进程。应形成一个完整、连续的气泡。若气泡断裂，则表明存在泄漏或微注射器尖端堵塞，此时应重复步骤 2.4.8 及其相关注意事项。
  9. 将微注射器插入待注射的试剂中，缓慢将注射器活塞拉至后挡块位置。
  10. 准备动物以进行注射：
  11. 将大鼠胸部紧贴实验者胸部固定。用浸有 70% 乙醇（v/v）的棉签清洁套管周围区域。
  12. 注意：通过适当操作，小鼠可用手掌轻柔固定；否则可能需要捏住颈部皮肤进行固定。
  13. 使用小型镊子取下堵头，并将其放入盛有 70% 乙醇（v/v）的称量舟中。
  14. 进行注射：
  15. 将已装液的微注射器（见步骤 2.4.10）插入套管中。启动微注射泵，并观察气泡移动情况。
  16. 注意：可能需要施加轻微压力，以确保微注射器不会上抬。气泡（见步骤 2.4.9 形成）应均匀前移并完全进入微注射器。
  17. 注射完成后，在注射后扩散期结束时，将微注射器从套管中取出并重新插入堵头。
  18. 注意：典型的注射后扩散时间为药理学试剂 2–4 分钟，病毒为 2–10 分钟。在输注结束后保持微注射器插入状态，可防止注射液沿套管回流而非扩散至组织中。将堵头放置在盛有乙醇的称量舟一侧，使其乙醇充分沥干后再重新插入套管。

3. 注射后清理

  1. 准备一个小瓶的无菌水、70%乙醇和丙酮。
  2. 清洗显微注射器和显微注射用玻璃注射器：
    1. 从泵的注射器架上取下玻璃注射器，并将显微注射管路从玻璃注射器上拆下。
    2. 将显微注射管路从玻璃注射器上断开，然后通过一个26 G针头（棕色针座）将装有无菌水的1 ml注射器连接到显微注射管路上。推动1 ml注射器的推杆，排出约0.3 ml液体。接着，将显微注射器的尖端轻触实验室擦拭纸，并通过显微注射器回抽空气。
      注意：若判断合理，显微注射器和管路可在类似实验中重复使用。
    3. 将玻璃注射器针头插入无菌水中，完全回拉推杆吸取液体，然后完全推入推杆进行冲洗。将玻璃注射器尖端轻触实验室擦拭纸，确保无残留液体。
    4. 按以下顺序依次使用无菌水、空气、70%乙醇和丙酮重复步骤3.2.3：无菌水、无菌水、空气、空气、70%乙醇、70%乙醇、空气、空气、丙酮、丙酮、空气、空气。完成所有这些清洗步骤有助于延长显微注射玻璃注射器的使用寿命。
    5. 将显微注射器放入包装中，并将推杆回拉至0.05 μl。
      注意：此步骤非常重要，因为这样可以在储存后若因盐分沉积导致推杆卡住时，通过推动或拉动推杆将其松动。

4. 动机行为实验的程序设计

  1. 使用管理员凭据登录 Graphic State。
  2. 选择或创建相关数据库。
  3. 创建渐进比率强化程序
    1. 选择列表 > 数据库级别列表 > 事件转换参数列表
    2. 选择“添加”。输入适当的列表编号（L#）和描述。
    3. 选择“添加事件”。
    4. 输入第一个强化程序值，然后选择“添加”。重复此步骤。
      注意：可通过使用公式确定数值，其中递增比率程序 = 5e (j*(获得的强化物+1))-5.7 为了使该方程能够适当地检验假设，必须通过实验确定或从文献中获取参数 j 的值。
    5. 在“选择顺序”框中选择“按顺序”。
    6. 在“结束时”框中选择“保持值 = 至：____”。在文本框中输入一个远超预期反应次数的强化程序值。当列表中的项目耗尽后，所有后续条目所需的 effort 均为此值。
  4. 创建实验方案：
    注意：图形状态（Graphic State）根据时间或表现标准，使受试者经历一系列状态转换。将下文标记为“$”的所有离散和情境线索及参数设置为适当值，以检验所研究的假设。
    1. 选择文件 > 创建实验方案
    2. 在相应的文本框中输入所需的方案编号和描述。
    3. 选择“状态创建”。
    4. 设置“RDY – 准备状态”和“FIN – 完成状态”的所有刺激参数。
    5. 选择“新建状态”，并将其命名为“S2 – PR 响应”。
    6. 选择“新建状态”，并将其命名为“S3 – PR强化剂与提示”。
    7. 选择“新建状态”并将其命名为“S4 – 超时”。
    8. 选中“S1”并将其命名为“S1 – 习惯化”。
      1. 选择添加“时间跳转”。
      2. 输入合适的时间 ($) 及单位 ($) 例如，分钟，并从“TO S”下拉框中选择“S2”。时间单位“units”是在数据库最初创建时确定的。
        注意：创建的时间转换应类似于 [After $ minutes GO P = 100%, TO S2] 图1 是此事件创建后的示例。

包含“AFTER”、“$”、“Minutes”、“GO”、“TO S2”的流程图；表示流程步骤的顺序。
图1. 典型编程示例#1。 此处展示了一个以时间限定的状态，其中用户定义的值$（以分钟为单位）表示当前状态何时应跳转至状态2（S2）。

  1. 高亮选择“S2 – PR 响应”。
    1. 选择添加“事件转到”。
    2. 在第一个文本框中输入第 4.3 步创建的递增比率计划所在的列表名称，格式为 L$（例如，L1）；从第一个下拉框中选择相应的操作装置（例如，压杆或鼻触装置）；在“TO S”下拉框中选择“S3”。
      注意：所创建的事件可能显示为类似 [IF L$1 – Active GO P = 100%, TO S3] 的形式。标识符“1 – Active”是在数据库创建过程中指定的。此处，“1 – Active”指插入开关一的操作装置。
    3. 选择添加“时间转到”。
    4. 勾选“R”框，输入适当的时间和单位（$），并在“TO S”下拉框中选择“FIN”。
      注意：所创建的时间事件可能显示为类似 [ R (已勾选) IF $ 分钟 GO P = 100%, TO FIN] 的形式。这将确保当该操作装置在设定阈值时间内无活动时，会结束实验会话；即，当动物在设定时间内未对与强化物关联的操作装置作出响应时，会话将超时终止。
    5. 选择添加“事件转到”。
    6. 勾选“R”框，在第一个文本框中输入 1，从第一个下拉框中选择相应操作装置的释放动作，并在“TO S”下拉框中选择“S2”。
      注意：所创建的事件可能显示为类似 [ R (已勾选) After $ [1] Active GO P = 100%, TO S2] 的形式。此步骤确保在操作装置释放时（如上方括号所示），状态将重新进入，从而重置会话超时阈值（步骤 4.4.9.4）。此时，当列表中包含的递增比率完成（步骤 4.4.9.2）或会话超时（步骤 4.4.9.4）时，状态将退出。因此，每次激活操作装置都会计入递增比率；而每次操作装置失活时——例如，释放压杆或退出鼻触装置——会话超时阈值（步骤 4.4.9.4）将被重置。图 2 展示了为“S2 – PR 响应”编程的所有状态转换。

流程图，包含用于过程自动化的条件逻辑；包括 IF 语句和操作步骤。
图 2. 典型编程示例 #2。 此处，当满足两个条件中的任意一个时，状态即退出。L$ 是在步骤 4.3 中创建的渐进比率程序。当程序完成后，状态将跳转至状态 3（S3）。请注意，此条件没有 R，这意味着程序在每次重新进入该状态时不会重新开始，而是继续推进。该状态也可以在 ‘$’ 分钟后跳转至 FIN 状态。这是预设的超时阈值，若在此时间窗口内无任何反应，则实验会话将终止。这一点将在讨论部分进一步说明。最后，每次操作装置释放时，会话超时阈值都会被重置。因此，‘[1]’ 表示操作装置 ‘1’ 的释放。

  1. 选中“S3 – 奖励强化与提示”。
    1. 选择“添加时间跳转”
    2. 输入适当的时间和单位以发放奖励（$），并在“跳转至状态”下拉框中选择“S4”。
      注：创建的时间事件可能显示为类似 [After $ seconds GO P = 100%, TO S4] 的格式。
  2. 选中“S4 – 间歇期”。
    1. 选择“添加时间跳转”
    2. 输入适当的时间和单位，使系统在发放奖励后保持非活动状态（$），并在“跳转至状态”下拉框中选择“S2”。
      注：创建的时间事件可能显示为类似 [After $ seconds GO P = 100%, TO S2] 的格式。状态“S4 – 间歇期”并非所有实验设计都必需。
  3. 选择解析状态。
    注：该方案现已准备就绪，可执行运行。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以下是使用上述方法可获得结果的示例。首先展示的是病毒载体转染的典型区域（图3）。通常情况下，在纹状体组织中可获得约 1 mm3 的转染体积。可通过系列切片使用卡瓦列里法（Cavalieri’s method）对转染区域的体积进行定量分析32。重要的是，转染体积受多种因素影响，包括被转染组织的类型、病毒血清型、启动子类型、注射速率和注射体积、注入的病毒颗粒数量、注射液的 pH 值，以及是否使用了高渗试剂（如甘露醇）33,34。通常情况下，我们以每分钟每侧 1 µl 的速度注射浓度为 1012 病毒颗粒/ml 的溶液，持续 10 分钟，并在撤出堵头前额外留置 7 分钟。此外，注射液的 pH 值通常约为 8。接下来，我们展示了通过转基因表达（图4）或药理学试剂微量注射（图5）均可调控动机行为。

在图4中，我们表达了仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）。DREADD受体编码区后接内部核糖体进入位点和mCitrine表达盒。mCitrine可方便地可视化转染细胞。该DREADD与异源三聚体G蛋白Gαq偶联。激活Gαq偶联的DREADD可刺激星形胶质细胞28,35，而DREADD本身可通过腹腔注射给予氯氮平-N-氧化物（CNO，3 mg/kg，i.p.）来激活14,22,36。大鼠被训练通过按压杠杆获得乙醇强化，在连续60天的每日1小时实验中，每按压3次杠杆可获得一次饮酒机会。随后，使大鼠进入强制戒断状态，并在伏隔核核心区的星形胶质细胞中表达Gαq偶联的DREADDs。经过3周戒断后，通过断点值测量大鼠重新自我给予乙醇的动机21,27-30。通过系统性给予CNO激活伏隔核核心区星形胶质细胞后，与对照组相比，大鼠在戒断后恢复乙醇自我给药的动机显著降低。重要的是，在另一组经过同等训练但表达绿色荧光蛋白（GFP）而非DREADD的大鼠中，CNO未产生任何效应。

转染脑区的荧光显微镜图像，显示前连合，比例尺为100 μm。
图3. 微注射病毒转染的腹侧纹状体代表性区域。该图像展示了按照上述方法转染的伏隔核星形胶质细胞所在区域。数据经版权持有者许可，重印自Bull等13。更多细节请参见该出版物及其附带的补充材料。请点击此处查看此图的放大版本。

乙醇断点图；DREADD 与 GFP 对比；柱状图；CNO 实验结果；统计分析
图 4. 激活在伏隔核核心星形胶质细胞中过表达的转基因可降低大鼠自给乙醇的动机。 病毒经微量注射后，给予一周表达时间，随后通过断点测试评估动机。所表达的转基因为仅由设计药物激活的设计受体（DREADDs）。单因素方差分析（F(2,30)=3.29，p=0.04）后接Scheffé事后检验显示，与对照组相比，在戒断后，通过腹腔注射给予氯氮平-N-氧化物（CNO，3 mg/kg，ip）系统性激活DREADD，显著降低了大鼠自给乙醇的动机；而在另一训练程度相当、但表达绿色荧光蛋白（GFP）而非DREADD的大鼠群体中，CNO未产生任何效应。数据经版权持有人许可转载自Bull等13。详细信息可参见该出版物及其附带的补充材料。

乙醇断点图；美氟喹剂量效应；柱状图；显示统计学显著性
图 5. 在戒断后，向大鼠伏隔核核心区微量注射缝隙连接阻断剂可增强其自我给予乙醇的动机。 本研究评估了两种缝隙连接阻断剂——美氟喹（mefloquine）和 18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhetinic acid, 18-α）——对大鼠自我给予乙醇动机（通过断点测量）的影响。双因素方差分析显示，将缝隙连接阻断剂微量注射至伏隔核核心可显著提高戒断后大鼠自我给予乙醇的动机（F(3,40)=5.56，p=0.003）。数据经版权持有人许可转载自 Bull 等人13。更多细节请参见该出版物及其配套的补充材料。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍的方法是一种高效制备显微注射套管和显微注射器的手段，有助于阐明驱动行为的分子基础。该方法具有多项优势：首先，通过自行制备植入物和显微注射器，可快速优化新的实验参数； 即， 无需等待定制组件到货。其次，由于套管直径较小，可同时植入更多套管。这缩短了所需的手术时间，有助于提高存活率，同时也允许每只动物接受多个植入物。第三，用于控制操作箱的软件可轻松支持渐进比率程序，只需应用包含目标强化程序的事件转换参数列表，即可快速将固定比率范式转换为渐进比率范式。

为了具有广泛的适用性，本文介绍了一种通用的微量注射方法，该方法几乎可适用于当前所有可用试剂的微量注射。因此，我们预计该技术在未来经过少量修改后仍将持续具有高度实用性。通过仅改变少数几个变量，该方法即可适用于多种不同试剂。最常调整的参数包括微量注射针从套管针端口伸出的长度、注射体积以及注射速率。例如，研究者可能希望注射针从套管针尖端伸出更长的距离，以避免慢性植入物周围通常形成的胶质瘢痕。此外，研究者也可能需要注射更大的体积。对于纹状体病毒微量注射，通常使用 1 μL 的注射体积，且该体积通常在较长时间内完成注射（通常为 7–10 分钟，另加 3–10 分钟的扩散时间），相比之下，药理学试剂的注射时间较短（通常为 0.3–0.5 μL，注射时间 2–3 分钟，另加 1–3 分钟扩散时间）。使用者应查阅相关文献和/或通过实验确定最适合自身需求的参数。无论如何，该操作的成功关键取决于四个变量：1）套管针长度；2）微量注射针长度；3）微量注射针喷雾模式的质量；4）注射前系统的完整性。由于微量注射的位置取决于注射针从套管针中伸出的深度，因此必须精确知晓并确保所有实验对象所用的套管针（步骤 1.2.8）和微量注射针长度（弯曲后，步骤 2.2.1）保持一致。这一点可通过在最终重新测量时直接剔除任何不符合长度要求的器械来轻松控制。此外，只有当注射发生在导向套管正下方时，注射位置才可被准确预测。因此，任何在测试时（步骤 2.4.6）未能喷出细长连续液流的微量注射针均应被剔除。高质量的注射还与注射前系统的完整性密切相关。若在将注射器内所有水分排出后（试剂填充前），在实验室擦拭纸上观察到多个液滴，则表明系统存在泄漏，需进行修复（参见步骤 2.4.8 的注释）。此外，若在用试剂填充微量注射器后，PE20 管路中分隔药物与水的气泡并非单一完整气泡（步骤 2.4.9），则表明注射器存在部分堵塞。这种堵塞可能阻止或偏转注射液流。此问题也可通过简单方法解决（参见步骤 2.4.8 的注释）。

如果希望在动物处于立体定位仪框架内时进行微量注射，则有三种选择。第一种，可增加微量注射器套管的长度，使其能够被立体定位仪操作臂牢固夹持，同时足够长以连接PE20管。第二种，可暂时植入套管，并使用本文所述的标准微量注射器。第三种，可使用拉制并抛光的玻璃微量移液管。16,17

本方案的一个重要局限性在于，其最佳实施对象是经过良好训练且熟悉操作流程的大鼠。结果部分所描述数据所用的大鼠无需特殊处理程序，因为同一名研究人员已连续两个多月每天对这些大鼠进行操作，其中包括至少两周的每日观察及对植入装置的日常操作。然而，大鼠可通过多种技术快速实现适应性训练，这些技术常用于前脉冲抑制实验前的准备，而该实验结果可能受到应激的影响。此前已有文献详细描述了这些特殊的适应性训练方法43。除上述操作外，建议使大鼠适应微注射操作流程，可在“假注射”过程中使用缩短型微注射针头。在假注射期间，为避免组织损伤，必须确保微注射针头不深入组织内部。换言之，微注射针头的弯曲长度不应超过14 mm。因此，该技术为实现最佳效果所需进行的充分适应性训练可被视为一项局限性。

尽管存在多种用于测量动机的行为范式，但渐进比率法常被用来量化受试者为获得强化物所愿意付出的努力。渐进比率范式产生一个称为“断点”的测量指标，通常被定义为在最后完成的比例中动物按压杠杆的最大次数。 即最大反应强度，即产生强化物的反应。21 渐进比率测试对强化物的剂量敏感。例如，较高的可卡因（或蔗糖）剂量会产生更高的断点，而较低的可卡因（或蔗糖）剂量则导致较低的断点。21,22 因此，断点（breakpoint）是衡量动机和/或强化效应的常规替代指标。21,23-26 由于断点的目的是确定动物停止反应的时间，因此递增比率范式的一个重要参数是实验会话时长。有限的会话时长可能人为地限制断点值，而这一问题可能因某些预处理导致的自我给药速率异常降低或强化后暂停时间延长而进一步加剧。这一混淆因素可通过多种方法加以克服； 例如., 在动物未发生反应的时间达到平均输注间隔的若干倍时终止的实验阶段。44 该方法的一个更常用变体是：当反应被抑制达到某个通过经验确定且在所有受试者中保持恒定的数值时，即终止实验会话。我们已在步骤 4.4.9.11 中提供了实施此方法的具体操作。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者均无竞争性或冲突性利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSB 得到了酒精饮料医学研究基金会、转化研究卓越中心奖（UL1 TR000058）、美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（P50 AA022537）以及弗吉尼亚州高等教育设备信托基金和弗吉尼亚联邦大学医学院提供的启动资金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
套管管路Amazon Supply/ Small PartsHTXX-26T-6026 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
针芯Amazon Supply/ Small PartsGWXX-0080-30-0533 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
微量注射针丝MicroGroup33RW 30433 gauge
超级胶水Loctite3924AC液体，非凝胶型，可高压灭菌
微量注射塑料管路Becton Dickson427406PE20
中等重量止血钳World Precision Instruments501241-G
尺子Fisher09-016150 mm
#7 镊子Stoelting52100-77Dumont, Dumostar
旋转工具Dremmel285双速
切割片McMaster Carr360215/16" x 0.025"
微量注射泵Harvard ApparatusPhD 2000
1 µl 玻璃注射器Hamilton7001KH针头型号：25s/2.75"/3
棉签Fisher23-400-101
实验室擦拭纸Kimwipes34133
操作行为学软件CoulbournGraphic State
操作行为学实验箱CoulborunHabitest

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
  2. Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
  3. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
  4. Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
  5. Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
  6. Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
  7. Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
  8. Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
  9. Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306(2014).
  10. Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
  11. McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
  12. Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
  13. Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
  14. Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
  15. Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
  16. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
  17. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
  18. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528(2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
  21. Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
  22. Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
  23. Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
  24. Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
  25. Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
  26. Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
  27. Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
  28. Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
  29. Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
  30. Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
  31. Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
  32. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
  33. Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
  34. Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
  35. Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
  36. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  37. Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
  38. Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
  39. Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
  40. Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
  41. Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7(2001).
  42. Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章