振荡压力灌注装置中大鼠肝脏脱细胞操作步骤

摘要

采用我们专有设备进行大鼠肝脏收获、插管和灌注的技术，可实现复杂的灌注系统，从而改进肝脏脱细胞和再细胞化实验。

摘要

实质器官的脱细胞与再细胞化可能实现在体外生成功能性器官，目前已有多种关于啮齿类动物肝脏脱细胞的实验方案发表。本研究旨在通过构建一种专有的灌注装置，实现经门静脉和/或肝动脉的选择性灌注，从而优化脱细胞过程。此外，我们尝试在振荡的周围压力条件下进行灌注，以提高脱细胞的均一性。迄今为止，灌注脱细胞过程中的均一性一直是一个被低估的因素。在脱细胞过程中，器官中灌注不良的区域可能仍残留细胞，而灌注充分区域的细胞外基质（ECM）则可能已受到碱性去污剂的影响。振荡压力变化可模拟呼吸过程中发生的腹腔内压力变化，从而优化肝脏内部的微灌注。在本研究中，通过组织学染色、DNA含量分析和腐蚀铸型技术对大鼠脱细胞肝脏基质进行了分析。结果显示，经肝动脉灌注所得结果比经门静脉灌注更具均一性。应用振荡压力条件可提高灌注脱细胞的效率。经肝动脉灌注并在振荡压力条件下处理的肝脏表现出最佳效果。本文介绍的肝脏获取、插管及使用本机构专有装置进行灌注的技术，可实现复杂的灌注设置，从而改进大鼠肝脏的脱细胞与再细胞化实验。

引言

脱细胞化与再细胞化可能实现在体外生成具有功能且可移植的器官in vitro ¹。通过去除器官中的细胞及抗原性物质（例如，DNA、α-Gal 表位），可获得非免疫原性或低免疫原性的细胞外基质（ECM）。该基质保留了器官的三维微解剖结构，可作为理想的生物支架，用于接种来源不同、甚至异种来源的细胞 ²。因此，可将人肝细胞接种于脱细胞化的大鼠肝脏基质中。这种人源化微肝可作为研究疾病（例如，先天性代谢性疾病、病毒感染或恶性肿瘤）或进行临床前药物测试的ex vivo模型 ³。

已有多种不同的大鼠肝脏灌流脱细胞方法被发表^4-13。在所有这些方法中，均是通过门静脉插管灌注碱性离子或非离子型去污剂来实现脱细胞。据我们所知，我们是首个报道通过门静脉和/或大鼠肝动脉进行选择性灌注以实现大鼠肝脏脱细胞的团队¹⁴。实现肝脏内不同血管系统的特异性灌注，可能有助于获得更优的脱细胞效果，并且在后续的细胞再接种过程中也可能发挥重要作用。

在本研究中，肝脏在一种定制的专有灌注装置中进行灌注，从而能够在振荡压力条件下实现灌注。这种压力条件模拟了生理状态下呼吸依赖性的肝脏灌注：in situ 时，肝脏悬挂在膈肌穹窿下方，呼吸过程中膈肌的运动直接影响肝脏的灌注。吸气时膈肌下降并挤压肝脏，从而优化肝静脉的流出；而呼气时肝脏上升，腹腔内压力降低，有利于门静脉的流入¹⁵。

我们的目标是通过模拟腹腔内条件，评估振荡压力环境是否会影响大鼠肝脏灌注脱细胞过程的均匀性 离体脱细胞过程的均一性在灌注脱细胞中可能是一个被低估的因素。所有已知用于肝脏脱细胞的试剂均会引起细胞外基质（ECM）的改变。灌注不良区域的细胞会残留在ECM中，而其他区域则已完全脱细胞。为了溶解残留细胞，必须延长灌注时间或提高压力，但这会导致灌注良好区域的ECM发生更显著的改变。因此，脱细胞所用的去垢剂应在器官内均匀分布。

方案

动物饲养于德国柏林夏里特实验医学中心（FEM, Charité, Berlin, Germany），所有实验方案均经德国柏林州卫生局及地方事务办公室（LAGeSo, Berlin, Germany；批准文号：O 0365/11）审查并批准。

1. 肝脏采集

1. 术前准备
   1. 使用软木板进行固定。将医用手术巾铺在软木板上。用四枚针将一个吸入式麻醉面罩固定在软木板上，用于术中吸入麻醉。
2. 门静脉插管的预先准备
   1. 将一个外周静脉导管（G 20）连接至三通阀。静脉导管应斜切，长度约为 1.5 cm。
   2. 使用装有林格液的 10 ml 注射器排空系统中的空气。必须仔细排气，因为气体栓塞可能对灌注脱细胞过程产生不利影响。
3. 动脉插管的预先准备
   1. 使用蝶形针头，将其截短至 5 mm 长度。将一段 5 cm 长的导管（内径 0.58 mm；外径 0.96 mm）套接在 5 mm 针头上，并用速干胶固定。再将一段 2 cm 长的导管（内径 0.28 mm；外径 0.61 mm）插入较粗的导管中，并用速干胶固定。
   2. 将另一段导管套在该结构外部作为支点，并用速干胶固定。使用装有林格液的 5 ml 注射器对动脉插管进行排气。
4. 麻醉与镇痛
   1. 在麻醉诱导舱中以 1.5 L/min 的流速通入含 3.5% 异氟烷的氧气，诱导大鼠麻醉。
   2. 为确保术中充分镇痛，经腹腔注射安乃近（100 mg/kg 体重）和低剂量氯胺酮/美托咪啶（每 kg 体重 10 mg / 0.1 mg）。
   3. 通过吸入面罩以 1 L/min 的流速供给含 1.5% 异氟烷的氧气，以维持手术麻醉状态。
5. 术前布置
   1. 使用电动剃毛器广泛剃除腹部毛发。用 70% 乙醇润湿腹部切口区域以进行消毒。
   2. 将动物仰卧位放置于准备好的软木板上，头部插入吸入面罩，四肢用医用胶带和针固定。用纱布块擦除多余的乙醇和毛发。
6. 麻醉状态评估
   1. 通过观察呼吸频率评估麻醉深度。当麻醉深度足够时（40–60 次/分钟），使用手术镊夹捏双后肢脚趾间的皮肤，尝试诱发足趾夹捏反射，以检查镇痛是否充分。
7. 腹部入路
   1. 在膀胱上方的尾侧腹壁做正中切口，从此点向两侧肋弓呈 V 形切开。注意不要切到膈肌。将切开的腹壁翻向胸部。
   2. 用奥弗霍尔特钳固定剑突，并将其向头侧牵拉，用橡皮筋固定。使用湿润棉签将肠管移开，并用湿纱布包裹肠管。此外，用湿敷料覆盖所有腹腔边缘。
8. 肝脏准备
   1. 解剖镰状韧带。使用湿纱布将肝脏内侧叶和左叶向上牵拉至膈顶下方，暴露肝十二指肠韧带和上大网膜肝叶。
   2. 使用两把显微镊和弹簧剪仔细解剖附着于上大网膜肝叶的韧带，直至该肝叶可自由移动。使用湿棉签在纱布垫下方移动肝叶，同时保持内侧叶和左叶位置固定。
   3. 上大网膜肝叶游离后，将胃向左侧移动。用钳子固定胃，并使用显微镊和弹簧剪解剖小网膜。
   4. 游离下大网膜肝叶直至其可自由移动，随后将其复位至原腔隙。使用巴考斯钳固定十二指肠。将十二指肠向左牵拉，以拉伸并暴露肝十二指肠韧带。在拉伸的肝十二指肠韧带中环形游离胆总管。
   5. 从周围脂肪和胰腺组织中解剖胆总管。在距胆管分叉处 1.5 cm 处切断胆总管。从周围脂肪组织中解剖门静脉。暴露胃十二指肠静脉。
   6. 用 6-0 丝线对胃十二指肠静脉进行双重结扎，并在两结扎线之间切断该静脉。从周围组织中解剖腹腔干和肝总动脉，直至所有动脉分支均暴露。
   7. 从周围组织中游离胃十二指肠动脉。用 6-0 丝线进行双重结扎，两结扎线之间保持一定距离。在两结扎线之间解剖该动脉。
   8. 从周围组织中游离脾动脉。用 6-0 丝线进行双重结扎，两结扎线之间保持一定距离。在两结扎线之间解剖该动脉。
   9. 从周围组织中游离左胃动脉。用 6-0 丝线进行双重结扎，两结扎线之间保持一定距离。在两结扎线之间解剖该动脉。
   10. 在右肾与右外侧肝叶之间环形游离下腔静脉。从腹膜后间隙中解剖该静脉。沿腹腔干方向暴露腹主动脉。
   11. 解剖腹膜后脂肪组织。向下腔静脉注入 1,000 I.E. 肝素溶于 1 ml 生理盐水中。拔出针头，并用棉垫压迫切口。等待 1–2 分钟，使肝素发挥全身作用。
   12. 用镊子环形游离腹主动脉。解剖腹主动脉并放血处死大鼠。此外，从肾脏远端解剖下腔静脉。
9. 门静脉插管（使用第 1.2 节中制备的插管）
   1. 在远端门静脉做鱼口状切口。用镊子撑开切口，插入门静脉插管。用 20 ml 林格液冲洗肝脏，直至肝脏褪色，并用结扎线（6-0 丝线）固定插管。
10. 动脉插管（使用第 1.3 节中制备的插管）
    1. 解剖腹腔干上方的腹主动脉。从腹膜后间隙中游离该段腹主动脉。纵向切开该段腹主动脉形成主动脉补片。将自制插管插入静态固定装置中。
    2. 使用两把镊子将主动脉补片套过插管。在插管上方用 6-0 丝线结扎肝动脉，并将补片固定在支点处。
11. 肝脏摘除
    1. 切开膈肌，做环形切口，将肝脏从周围结构中游离。
12. 保存
    1. 将肝脏保存于无菌 500 ml 容器中，容器内盛有 350 ml 林格液，直至使用。

2. 去垢剂溶液

1. 10% Triton X-100 储存液
   1. 取一个 1,000 ml 的瓶子，加入 900 ml 去离子水，再加入 100 ml Triton X-100（99.9%）。使用搅拌器使 Triton X-100 完全溶解，然后用去离子水定容至 1,000 ml。
2. 1% Triton X-100
   1. 取 100 ml 上述储存液（10%）加入 1,000 ml 的瓶子中，再加入 900 ml 去离子水，轻轻摇动瓶子两次。将 1% Triton X-100 溶液通过无菌滤膜过滤。
3. 10% SDS 储存液
   1. 取一个 1,000 ml 的瓶子，加入 900 ml 去离子水，再加入 66.99 g SDS（99.9%，密度 0.67）。使用搅拌器使 SDS 完全溶解，然后用去离子水定容至 1,000 ml。
4. 1% SDS
   1. 取 100 ml 上述储存液（10%）加入 1,000 ml 的瓶子中，再加入 900 ml 去离子水，轻轻摇动瓶子两次。将 1% SDS 溶液通过无菌滤膜过滤。

3. 脱细胞化

1. 灌流装置的设置

图1：在振荡压力条件下对四只大鼠肝脏进行选择性动脉和门静脉灌注的灌注装置示意图。（改编自 Struecker et al. ¹⁴）

1. 将排水管连接至三通旋塞和海德尔贝格延伸管，以调节液位，并用 500 ml 0.9% NaCl 填充反应器。
   

图2：灌注装置示意图。 通过门静脉通路（2）或动脉通路（3），将灌注室（1,400 cm³）（1）连接至除泡阱（5）的远端（4）。除泡阱（5）应在远端配备封闭装置（4），并设有排气口（6）。将除泡阱（5）连接至海德堡延长管（7）。将海德堡延长管连接至泵管段（8）。此外，将泵管段（8）连接至另一根海德堡延长管（9）。将最后一根海德堡延长管（9）插入洗涤剂溶液瓶（10）中。将呼吸机（11）连接至灌注室（或在进行多路灌注时连接至压力分配器）。为排出反应器内的液体，需将流出管路连接至废液瓶（12）。

1. 将泵管段插入泵中。启动泵，用 PBS 填充循环系统，关闭气泡捕集器的远端并打开排气口。当气泡底部被 PBS 完全覆盖（2–3 cm）后，关闭排气口并打开气泡捕集器的远端。
2. 肝脏安装
   1. 将门静脉插管的三通旋塞连接至相应的反应器接口。将动脉插管连接至动脉接口。注意确保无空气进入系统。
3. 施加振荡压力条件
   1. 使用呼吸机，频率设为 15 次/分钟，振幅为 26 mbar（最小 4 mbar，最大 30 mbar）。将呼吸机连接至压力分配室，并将压力分配室连接至反应器。开始施加压力。
4. 脱细胞化方案
   1. 以 5 ml/min 的流速进行灌注操作。首先用 1% Triton X-100 对肝脏灌注 90 分钟，启动脱细胞化过程。通过灌注装置的流出端排出废液，以维持灌注室内液面恒定并始终高于灌注中的肝脏。90 分钟后，更换去垢剂为 1% SDS。
      
      

 图3：所有实验组的灌注方案。

结果

通过宏观观察、组织学分析以及对脱细胞肝脏基质中残留DNA含量的分析，评估了不同脱细胞化方案的均一性及其效果。此外，还进行了腐蚀铸型以直观显示脱细胞后肝脏的完整微细解剖结构。

大体观察

在脱细胞过程中，肝脏变得透明，表明细胞成分已被去除。通过门静脉灌注的肝脏显示出不均匀的透明化（即脱细胞化），在脱细胞过程中及之后肉眼可见残留的细胞（白色箭头）。通过肝动脉灌注的肝脏则表现出更均匀的脱细胞过程，且无可见的残留细胞。若在施加振荡压力条件的情况下进行肝脏灌注，则无论灌注路径如何，均无可见的残留细胞。

图 4：无振荡压力条件下大鼠肝脏脱细胞的宏观结果。左：通过肝动脉进行脱细胞的大鼠...

讨论

尽管大鼠肝脏收获与脱细胞技术易于重复，但仍需注意某些关键步骤：

在准备肝脏摘取时，重要的是避免严重出血，因为出血会激活血液凝固，可能导致肝脏内形成血栓。我们认为，在门静脉插管前直接切开腹主动脉是有利的，可避免经门静脉灌注时血液通过肝动脉流入肝脏。一旦肝脏完成插管并得到明确灌注，血栓形成便不再成为问题。

在肝脏获取并转运至灌注装置后，将肝脏连接至灌注装置是一个尤为关键的步骤，必须避免气体气泡进入灌注回路，以防止发生气体栓塞。在将连接肝脏套管的三通阀接入灌注系统之前，使用注射器和细套管向该三通阀内预先充满磷酸盐缓冲液（PBS），此操作十分必要。

建立灌注后，应重新检查所有管路连接头、三通阀和管路是否均连接完好。如果肝脏需要长时间灌注（例如，过夜），即使连接处存在微小误差，也可能导致空气被虹吸进入灌注系统，从而引发致命的灌注后果。

目前的数据存在局限性，因为尚不明确产生最佳脱细胞效果所需的振荡压力变化的最...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自制动脉插管
Portex 非无菌聚乙烯导管	SIMS Portex	货号 800/110/100	内径 0.28 mm，外径 0.61 mm
Portex 非无菌聚乙烯导管	SIMS Portex	货号 800/110/200	内径 0.58 mm，外径 0.96 mm
Venodrop Safe 蝶形静脉留置针	Fresenius Kabi	3275851	21 G
门静脉插管
外周静脉导管	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
三通旋塞阀	smiths medical	888-101RE
手术用品
棉签	Hecht-Assistent	4302
棉垫	绍兴正德外科敷料	13H118-03
纱布绷带	湖北海格 医疗器械	14388
林格氏液	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml 注射器	Braun	4606108V	10 ml / Luer Solo
5 ml 注射器	Braun	4606061V	5 ml / Luer Solo
缝合线（丝线 6/0）	Resorba	H1F	批号 105001.81
医用铺巾	绍兴正德外科敷料	D0613011
手术器械
持针器	Geuder	17570
显微镊	Inox-Electronic	91150-20
显微剪	Martin	11-740-11
显微镊	S&T	112314
止血钳	Aesculap	BH111R
剪刀	F S T	14501-14
外科镊	Aesculap	BD 557
脱细胞处理
呼吸机	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
灌注装置	Charite 医疗工程实验室	定制设备	脱细胞装置
peristaltic pump ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4 通道
Heidelberger 延长管 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA 泵管段	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
CA 2-密封塞管	Pharmed	BPT NSF-51
气泡捕集器		定制物品
Luer Lock 软管接头	Neolab	货号 02-1887
去垢剂
SDS 颗粒	Carl Roth	CN30.4	2.5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
染色
伊红 1%	Morphisto	10177
Mayer 苏木精	AppliChem	A4840
戈莫里染色液	Morphisto	11104
阿利新蓝-PAS 染色液	Morphisto	11388
直接红 80	Sigma Aldrich	365548