振荡压力灌注装置中大鼠肝脏脱细胞操作步骤

摘要

采用我们专有设备进行大鼠肝脏收获、插管和灌注的技术，可实现复杂的灌注系统，从而改进肝脏脱细胞和再细胞化实验。

摘要

实质器官的脱细胞与再细胞化可能实现在体外生成功能性器官，目前已有多种关于啮齿类动物肝脏脱细胞的实验方案发表。本研究旨在通过构建一种专有的灌注装置，实现经门静脉和/或肝动脉的选择性灌注，从而优化脱细胞过程。此外，我们尝试在振荡的周围压力条件下进行灌注，以提高脱细胞的均一性。迄今为止，灌注脱细胞过程中的均一性一直是一个被低估的因素。在脱细胞过程中，器官中灌注不良的区域可能仍残留细胞，而灌注充分区域的细胞外基质（ECM）则可能已受到碱性去污剂的影响。振荡压力变化可模拟呼吸过程中发生的腹腔内压力变化，从而优化肝脏内部的微灌注。在本研究中，通过组织学染色、DNA含量分析和腐蚀铸型技术对大鼠脱细胞肝脏基质进行了分析。结果显示，经肝动脉灌注所得结果比经门静脉灌注更具均一性。应用振荡压力条件可提高灌注脱细胞的效率。经肝动脉灌注并在振荡压力条件下处理的肝脏表现出最佳效果。本文介绍的肝脏获取、插管及使用本机构专有装置进行灌注的技术，可实现复杂的灌注设置，从而改进大鼠肝脏的脱细胞与再细胞化实验。

引言

脱细胞化与再细胞化可能实现在体外生成具有功能且可移植的器官in vitro ¹。通过去除器官中的细胞及抗原性物质（例如，DNA、α-Gal 表位），可获得非免疫原性或低免疫原性的细胞外基质（ECM）。该基质保留了器官的三维微解剖结构，可作为理想的生物支架，用于接种来源不同、甚至异种来源的细胞 ²。因此，可将人肝细胞接种于脱细胞化的大鼠肝脏基质中。这种人源化微肝可作为研究疾病（例如，先天性代谢性疾病、病毒感染或恶性肿瘤）或进行临床前药物测试的ex vivo模型 ³。

已有多种不同的大鼠肝脏灌流脱细胞方法被发表^4-13。在所有这些方法中，均是通过门静脉插管灌注碱性离子或非离子型去污剂来实现脱细胞。据我们所知，我们是首个报道通过门静脉和/或大鼠肝动脉进行选择性灌注以实现大鼠肝脏脱细胞的团队¹⁴。实现肝脏内不同血管系统的特异性灌注，可能有助于获得更优的脱细胞效果，并且在后续的细胞再接种过程中也可能发挥重要作用。

在本研究中，肝脏在一种定制的专有灌注装置中进行灌注，从而能够在振荡压力条件下实现灌注。这种压力条件模拟了生理状态下呼吸依赖性的肝脏灌注：in situ 时，肝脏悬挂在膈肌穹窿下方，呼吸过程中膈肌的运动直接影响肝脏的灌注。吸气....

方案

动物饲养于德国柏林夏里特实验医学中心（FEM, Charité, Berlin, Germany），所有实验方案均经德国柏林州卫生局及地方事务办公室（LAGeSo, Berlin, Germany；批准编号：O 0365/11）审查并批准。

1. 肝脏采集

1. 术前准备
   1. 使用软木板进行固定。将医用铺巾置于软木板上。用四枚针头将吸入麻醉面罩固定在软木板上，用于术中吸入麻醉。
2. 门静脉插管的预先准备
   1. 将外周静脉导管（G 20）连接至三通旋塞阀。静脉导管应斜切，长度约为 1.5 cm。
   2. 使用装有林格液的 10 ml 注射器排除系统中的空气。必须仔细排尽空气，因为气体栓塞可能对灌注脱细胞过程产生不利影响。
3. 动脉插管的预先准备
   1. 使用蝶形针头，将其剪至 5 mm 长度。将一段 5 cm 长的导管（内径 0.58 mm；外径 0.96 mm）套接在 5 mm 针头上，并用速干胶固定。再将一段 2 cm 长的导管（内径 0.28 mm；外径 0.61 mm）插入较粗的导管中，并用速干胶固定。
   2. 将另一段导管套在该结构外部作为限位装置，并用速干胶固定。使用装有林格液的 5 ml 注射器排除动脉插管中的空气。
4. 麻醉与镇痛 ....

结果

通过宏观观察、组织学分析以及对脱细胞肝脏基质中残留DNA含量的分析，评估了不同脱细胞化方案的均一性及其效果。此外，还进行了腐蚀铸型以直观显示脱细胞后肝脏的完整微细解剖结构。

大体观察

在脱细胞过程中，肝脏变得透明，表明细胞成分已被去除。通过门静脉灌注的肝脏显示出不均匀的透明化（即脱细胞化），在脱细胞过程中及完成后肉眼可见残留的细胞（白色箭头）。通过肝动脉灌注的肝脏则表现出更均匀的脱细胞过程，且无可见的残留细胞。若在施加振荡压力条件的情况下进行肝脏灌注，则无论灌注路径如何，均无可见的残留细胞。

图 4：无振荡压力条件下大鼠肝脏脱细胞的宏观结果。左侧：通过肝动脉进行脱细胞的.......

讨论

尽管大鼠肝脏收获与脱细胞技术易于重复，但仍需注意某些关键步骤：

在准备肝脏摘取时，重要的是避免严重出血，因为出血会激活血液凝固，可能导致肝脏内形成血栓。我们认为，在门静脉插管前直接切开腹主动脉是有利的，可避免经门静脉灌注时血液通过肝动脉流入肝脏。一旦肝脏完成插管并得到明确灌注，血栓形成便不再成为问题。

在肝脏获取并转运至灌注装置后，将肝脏连接至灌注装置是一个尤为关键的步骤，必须避免气体气泡进入灌注回路，以防止发生气体栓塞。在将连接肝脏套管的三通阀接入灌注系统之前，使用注射器和细套管向该三通阀内预先充满磷酸盐缓冲液（PBS），此操作十分必要。

建立灌注后，应重新检查所有管路连接头、三通阀和管路是否均连接完好。如果肝脏需要长时间灌注（例如，过夜），即使连接处存在微小误差，也可能导致空气被虹吸进入灌注系统，从而引发致命的灌注后果。

目前的数据存在局限性，因为尚不明确产生最佳脱细胞效果所需的振荡压力变化的最.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自制动脉插管
Portex 非无菌聚乙烯导管	SIMS Portex	货号 800/110/100	内径 0.28 mm，外径 0.61 mm
Portex 非无菌聚乙烯导管	SIMS Portex	货号 800/110/200	内径 0.58 mm，外径 0.96 mm
Venodrop Safe 蝶形静脉留置针	Fresenius Kabi	3275851	21 G
门静脉插管
外周静脉导管	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
三通旋塞阀	smiths medical	888-101RE
手术用品
棉签	Hecht-Assistent	4302
棉垫	绍兴正德外科敷料	13H118-03
纱布绷带	湖北海格 医疗器械	14388
林格氏液	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml 注射器	Braun	4606108V	10 ml / Luer Solo
5 ml 注射器	Braun	4606061V	5 ml / Luer Solo
缝合线（丝线 6/0）	Resorba	H1F	批号 105001.81
医用铺巾	绍兴正德外科敷料	D0613011
手术器械
持针器	Geuder	17570
显微镊	Inox-Electronic	91150-20
显微剪	Martin	11-740-11
显微镊	S&T	112314
止血钳	Aesculap	BH111R
剪刀	F S T	14501-14
外科镊	Aesculap	BD 557
脱细胞处理
呼吸机	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
灌注装置	Charite 医疗工程实验室	定制设备	脱细胞装置
peristaltic pump ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4 通道
Heidelberger 延长管 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA 泵管段	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
CA 2-密封塞管	Pharmed	BPT NSF-51
气泡捕集器		定制物品
Luer Lock 软管接头	Neolab	货号 02-1887
去垢剂
SDS 颗粒	Carl Roth	CN30.4	2.5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
染色
伊红 1%	Morphisto	10177
Mayer 苏木精	AppliChem	A4840
戈莫里染色液	Morphisto	11104
阿利新蓝-PAS 染色液	Morphisto	11388
直接红 80	Sigma Aldrich	365548