视网膜下注射是一种将基因有效递送至小鼠眼内视网膜色素上皮的外科技术。本文介绍了一种在实验小鼠中对视网膜色素上皮进行病毒载体视网膜下注射的简便且可重复的方法。
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方法文章
经角膜缘入路-小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的视网膜下注射 关键词：角膜缘入路，视网膜下注射，病毒载体，基因治疗，视网膜色素上皮，小鼠
本文内容
摘要
摘要
眼睛是一个体积小且封闭的器官，因此是基因治疗的理想靶器官。近年来，针对视网膜病变的基因治疗已采用多种策略，通过非病毒和病毒载体将基因递送至视网膜及视网膜色素上皮（RPE）。其中，视网膜下注射是将病毒载体直接递送至RPE细胞的最佳途径。在开展基因治疗的临床试验之前，必须在多种视网膜病变的动物模型中验证该疗法的有效性。因此，小鼠的视网膜下注射已成为眼科基因治疗的一项基本技术。在本实验方案中，我们提供了一种简便且可重复的小鼠视网膜下注射病毒载体的技术。该技术由玻璃体内注射法改良而来，后者是眼科临床中广泛应用的技术。对RPE/脉络膜/巩膜复合体铺片的代表性结果进行观察，有助于理解该技术的效果，并可根据基因转导范围调整病毒载体的注射体积和滴度。
引言
在眼科领域，基因治疗已成为单基因遗传性视网膜病变的治疗方式。某些遗传性视网膜病变与视网膜色素上皮（RPE）中的基因相关，包括Leber先天性黑蒙1,2视网膜色素变性3，以及脉络膜缺失症4基因治疗的研究领域正在使用病毒载体（如）的临床前研究和临床试验中不断扩展 腺病毒-相关病毒（AAV）， 慢病毒 （LV）和 腺病毒 (Ad)5不同的病毒载体在视网膜中具有不同的嗜性。为了实现安全有效的基因治疗，应根据靶细胞和靶基因谨慎选择病毒载体。
基因递送途径对于将基因有效递送至靶细胞也至关重要，因此也应谨慎选择。病毒载体眼内递送的两种最常用方法是视网膜下注射和玻璃体内注射6。其中，玻璃体内注射已广泛用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性（AMD）中的脉络膜新生血管以及糖尿病视网膜病变中的黄斑水肿7。玻璃体途径可使病毒载体接触玻璃体和视网膜内层 ，但其向视网膜外层的扩散受限。相比之下，视网膜下途径可将病毒载体直接递送至视网膜与视网膜色素上皮（RPE）之间的潜在间隙，形成局部隆起（bleb）。因此，目前认为视网膜下注射是靶向光感受器细胞和RPE更为高效的递送途径。在手术入路方面，临床上通常选择睫状体平坦部作为玻璃体内注射的安全区域，以避免对人类患者的视网膜造成损伤。通过将此方法稍作修改用于小鼠，我们可通过角膜缘入路实现病毒载体的视网膜下或玻璃体内注射。
在本视频文章中，我们展示了一种将病毒载体注射到小鼠视网膜色素上皮（RPE）下腔的简便且实用的方法。使用30 G 1/2针头在角膜缘后方进行一次穿刺后，将连接有微升注射器的33 G钝头针经由角膜缘穿刺点插入视网膜下腔。将1.5–2 µl体积的病毒载体注入视网膜与RPE之间的潜在间隙，形成视网膜下隆起（subretinal blebs）。该操作可在手术显微镜下直视观察下完成。即使无法直接观察到隆起的形成，经过反复练习也可确保结果的可重复性。该方法有助于研究人员在小鼠RPE中开展准确且节省时间的视网膜下基因递送实验。
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方案
所有动物实验均遵循眼科与视觉研究中动物使用研究协会声明（Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research）的要求，以及首尔国立大学动物照护与使用委员会和首尔国立大学医院生物安全委员会制定的指南与规定。
1. 准备注射工具包和病毒载体
- 准备一支配备33 G钝针头的微升注射器，针头需经环氧乙烷气体灭菌。在微量离心管中用PBS稀释病毒载体至所需滴度。即， 1 × 106 TU/µl用病毒载体反复冲洗注射器数次，以去除注射器内的死腔。
2. 病毒载体的视网膜下注射
- 使用替来他明和唑拉西泮（1:1，2.25 mg/kg 体重）与盐酸赛拉嗪（0.7 mg/kg 体重）的混合物进行腹腔注射，对成年小鼠（即 6 - 8 周龄）实施麻醉，或采用其他合适的麻醉方案。
- 使用含0.5%去氧肾上腺素和0.5%托吡卡胺的眼药水散大瞳孔。
- 将1.5 - 2 µl病毒载体注入微量注射器中，完成准备。
- 打开眼睑并轻压眼球使其突出，暴露赤道部以便于注射，并在手术显微镜下对焦。注射完成前需保持眼球突出状态，否则可能导致针头移位。为稳固固定眼球，应将手指置于眶缘外侧。
- 在角膜表面滴加一滴眼用粘弹性溶液。
- 将一小片圆形盖玻片置于角膜表面，以利于观察视网膜。
- 使用无菌30 G 1/2针头在角膜缘稍后方穿刺一个小孔，为后续视网膜下注射做准备。右眼穿刺部位宜选择下方，左眼则选择上方，以便操作。
注意：若穿刺点位于颞侧或鼻侧，则注射后难以被眼睑覆盖。初始穿刺点应略位于角膜缘后方，以避开沿角膜缘走行且易于识别的角膜缘血管。穿刺时需小心避免针头触碰晶状体。切勿将针头斜面完全插入，以防刺破晶状体。 - 将装有微量注射器的33 G钝头针经预穿刺孔插入，推进至视网膜下腔，直至感受到轻微阻力。
注意：进行视网膜下注射时，针头最佳进针角度约为与虹膜平面成45度，钝头针应向视乳头周围区域后方推进。图1中虚线方框标示了建议的针头穿过玻璃体腔进入视网膜下腔的路径。
注意：穿透（或通过）视网膜各层时不会感受到明显阻力，因为这些组织非常柔软。因此，首次感受到轻微阻力即表明针头已接触视网膜色素上皮（RPE）层，此时应停止继续插入。需注意避免因用力过大而穿透巩膜组织，因为针头应置于潜在的视网膜下间隙内。若因用力过度导致针头穿破巩膜，则会无阻力地进入眼球外的眶内空间。（此步骤至关重要）
图1. 视网膜下注射示意图。小鼠眼球的H&E染色横截面，显示了视网膜下注射的结构及标记的针头路径（虚线方框）。放大倍数：40X，比例尺：500 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
- 将病毒载体（即 1 x 106 TU/µl）轻柔地注射至视网膜下腔，避免震颤，以防造成不必要的组织损伤，并轻柔地撤出针头。注射过程中须如2.4节所述牢固固定眼球。
- 在手术显微镜下观察注射后视网膜下隆起（bleb）的形成，以确认无视网膜出血。
图 2. 视网膜下隆起形成且无视网膜出血。 在手术显微镜下进行视网膜下注射后，显微观察显示成功形成视网膜下隆起，且未出现视网膜出血。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 轻轻闭合眼睑以覆盖注射部位，使其自行闭合。将小鼠放回饲养笼中，并在评估前保持存活状态。
注意：研究人员熟练掌握操作流程后，可省略这些步骤（2.5、6 和 10），以快速获得可重复的结果
3. 视网膜色素上皮中基因递送效率的评估
- 将小鼠置于 CO2 麻醉室中处死，使用剪刀摘除眼球。
- 将眼球置于 4% 多聚甲醛溶液中，4 °C 下固定至少 1 小时至数天。
- 用精细镊子夹住角膜，用显微剪刀刺穿角膜，沿角膜缘剪除角膜。用镊子取出晶状体。
- 用显微剪刀修剪睫状体，使视网膜脱离。轻柔地将整个视网膜从视网膜色素上皮层/脉络膜/巩膜复合体中拉出。从周边向视神经附近中心方向，将视网膜色素上皮层/脉络膜/巩膜复合体呈放射状剪开数次，形成 4 至 8 个叶片，以便进行平铺封片。
- 将视网膜色素上皮层/脉络膜/巩膜复合体翻转，使视网膜色素上皮层面朝下，修剪巩膜侧所有残留组织，包括肌肉、结膜和视神经。此步骤对于获得平整的视网膜色素上皮层/脉络膜/巩膜复合体至关重要，任何残留组织均会导致复合体不平整。
- 根据特定研究目的，用一抗和二抗孵育复合体（可选步骤，详细方法参见参考文献）。将视网膜色素上皮层/脉络膜/巩膜复合体平铺于载玻片上，并用吸水海绵吸除 PBS 缓冲液。
- 加入 30 µl 封片液，盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察载体递送效率。将样品置于冰箱中保存，以备后续观察。
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结果
为了评估本方案中视网膜下注射对慢病毒载体介导的基因转导效率，我们使用了 commercially available LV 载体，该载体携带 CMV 启动子并同时表达 GFP 和 RFP 作为报告基因。根据研究目的，在适当的时间点摘除眼球。代表性结果中，分别在视网膜下注射后 10 周和 20 周摘除眼球。按照上述方法完全去除视网膜后，对 RPE/脉络膜/巩膜复合体进行平铺，并在荧光显微镜下观察。代表性结果如图 3A（视网膜完全去除的良好示例）和图 3B（视网膜仍完整保留的较差示例）所示。尽管残留的神经视网膜（尤其是感光细胞外节段）存在于 RPE 层上方并不会干扰对 RPE 层基因递送区域的分析，但它会遮挡 GFP/RFP 的荧光信号，阻碍对 RPE 层的直接观察，从而影响后续分析。因此，从 RPE/脉络膜/巩膜复合体中彻底去除神经视网膜可获得更佳的实验结果。
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讨论
在本视频文章中，我们详细描述了经角膜缘入路的视网膜下注射技术，并展示了代表性结果，包括视网膜色素上皮层（RPE）/脉络膜/巩膜的平铺标本。该技术是一种对RPE进行病毒载体视网膜下注射的简便且实用的方法。注射过程中可直接观察到隆起（bleb）的形成，这对于初学者实现精确给药至关重要。《视觉化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments）已介绍过多种视网膜下注射技术8-10。视网膜下腔是视网膜与RPE之间的潜在间隙，因此存在两种可能的入路方式：一种是经玻璃体和视网膜的内侧入路，另一种是经RPE和巩膜的外侧入路。本研究所述的角膜缘入路视网膜下注射技术属于前者，即通过玻璃体腔和视网膜进入。与后者相比，该技术的优势在于能够形成更靠后极的隆起，因为外侧入路需经周边视网膜处的巩膜隧道或切口从周边部进入，而后者操作范围位于周边视网膜之上。此外，单纯的角膜缘穿刺比不穿透视网膜的巩膜隧道术更为简便。然而，对于新生小鼠而言，采用外侧入路9可能更为合适，因为新生小鼠的眼球极小且晶状体占据大部分空间，角膜缘入路容易导致意外的白内障形成，甚至眼球萎缩（phthisis bulbi）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由首尔国立大学研究基金（800-20140542）、国家研究基金会/科技部先锋研究计划（2012-0009544）、国家研究基金会/科技部生物信号分析技术创新计划（2009-0090895） 以及 国家研究基金会/科技部基金（2015M3A9E6028949）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子 DUMONT #5 11厘米 DUMOSTAR 0.1 × 0.06 毫米尖端 | WPI | 500233 | |
| VANNAS 剪刀 不锈钢，105 毫米 | WPI | 555583S | |
| 33G 钝头针头 | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil 注射器，10 微升 | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | 便于单手注射 |
| 30G × 1/2 (0.3 mm × 13 mm) BD PrecisionGlideTM 针头 | BD | 305107 | 用于视网膜下注射的初始穿刺 |
| 显微镜盖玻片（1号，直径3毫米） | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica 手术显微镜 | Leica | LM M80 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | Eclipse 80i | |
| 慢病毒 | Thermo Scientific | TMO.LV-Ctr | 用于稀释载体 |
| PBS | Gibco | 10010-015 | 用于稀释载体 |
| 托吡卡胺（去氧肾上腺素 0.5% - 托吡卡胺 0.5%） | Hanmi | 用于散瞳 | |
| 盐酸丙帕卡因滴眼液 USP，0.5%（无菌） | Bausch&Lomb | 用于表面麻醉 | |
| Healon GV 眼用粘弹剂 | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50（盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮） | Virbac | 用于全身麻醉 | |
| 隆朋注射液（盐酸赛拉嗪） | Bayer | 用于全身麻醉 |
参考文献
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