需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用 TiO2 光催化在水相环境中对蛋白质和细胞进行光图案化

7.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53045

⸱

2015年10月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, 2CREST, Japan Science and Technology Agency, 3School of Fundamental Science and Engineering, Waseda University, 4Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 5Graduate School of Biomedical Engineering, Tohoku University, 6Faculty of Science and Engineering, Waseda University

本文内容

摘要

我们描述了一种在水相环境中改性支架表面细胞亲和力的方案。该方法利用二氧化钛的光催化作用，分解光照区域的有机薄膜。我们证明，该方法可用于在体外（ex situ）和原位（in situ）构建支架蛋白的微区结构。

摘要

吸附在二氧化钛（TiO₂）表面的有机污染物2) 可在紫外光（UV）照射下通过光催化作用分解。本文介绍了一种采用 TiO₂ 的新型实验方案2 利用光催化局部改变基底表面的细胞亲和性。本实验中，使用一层薄的 TiO2 薄膜通过溅射镀膜法涂覆在玻璃盖玻片上，且TiO2 表面随后用源自十八烷基三氯硅烷（OTS）的有机硅烷单层进行修饰，该修饰可抑制细胞黏附。将样品浸入细胞培养基中，并对八角形区域照射聚焦紫外光。当将神经细胞系PC12细胞接种至样品表面时，细胞仅黏附于紫外光照射区域。我们进一步证明，该表面修饰方法也可实现 原位, 即即使细胞正在基质上生长，该方法也能实现适当的表面修饰，但需要在紫外照射时培养基中含有细胞外基质蛋白胶原蛋白。本文介绍的技术有望用于多种细胞类型的图案化，以构建共培养系统，或在培养过程中任意操控细胞。

引言

半导体光刻工艺及其衍生技术——例如光刻1,2、电子束光刻3-6和微接触印刷7-10——现已成为细胞生物学中一种成熟的技术，可用于在特定位置和几何形状下培养活细胞。该图案化方法依赖于微加工基底，其结构为在非允许细胞附着的背景上形成允许细胞附着的微小区域涂层。此类基底可作为细胞图案化的模板。这些技术为我们提供了在单细胞和多细胞水平上调控细胞及其功能的新方法，有助于揭示细胞的内在特性，并提高基于细胞的药物筛选通量11。

如果能够改变模板图案的几何形状，细胞图案化的自由度将大大增加 原位, 即，而细胞则在表面培养。传统的图案形成方法无法直接应用于这种情况，因为这些方法是在大气或真空条件下处理样品的。因此，已提出多种基于不同原理的新型表面改性技术， 例如，关于光反应性化合物12,13 或激光消融5,14，仅举几例而已。Robertus 已对这些提出的方法进行了很好的综述 等15，以及最近由 Choi 等16 以及由 Nakanishi17.

本文中，我们介绍一种新的实验方案 原位 表面修饰，利用二氧化钛（TiO₂）表面有机分子的光催化分解2表面18,19. 在该方法中，使用 TiO2 在玻璃基板与细胞接触的有机薄膜之间插入一层薄膜，并使有机薄膜分解 原位 通过将紫外光（UV）局部照射至目标区域（λ < 388 nm）。我们证明，新方案可用于创建细胞外基质蛋白和活细胞的微米级图案 离体 和 原位. TiO2 具有生物相容性、化学稳定性和光学透明性，这些特性使其易于引入细胞培养实验中。本方案提供了一种基于材料科学的方法，用于在细胞培养环境中对细胞培养支架进行改性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 二氧化钛（TiO2）包被玻璃盖玻片的制备

  1. 使用金刚石刻刀对盖玻片进行编号。这不仅有助于追踪每一片盖玻片，还能确保样本的正确面朝上。先用流动的ddH₂O清洗盖玻片，2O，然后将它们浸入piranha溶液（H2SO4：H2O2 = 4:1）。10 分钟后，用 ddH₂O 将盖玻片彻底冲洗 8 次。2O. 在氮气下干燥盖玻片2 流
  2. 设置 TiO2 射频（RF）溅射系统中的靶材。使用聚酰亚胺胶带将盖玻片固定在溅射设备的样品台上。将样品台放入溅射腔室。抽真空至腔室内压力达到2.0×10⁻⁶ Pa-4 Pa
  3. 向腔室中通入Ar气，并将沉积压力设定为4.0 mTorr。在保持快门关闭的情况下，逐步将射频功率升高至70 W。
  4. 打开快门，溅射15分钟，以获得厚度为120–150 nm的薄膜（图1：步骤A）每台设备均需测定薄膜的生长速率。

2. 使用抗细胞黏附薄膜进行表面包被

  1. 使用 O2 等离子体处理样品，以亲水化 TiO2 表面，具体操作请遵循等离子体反应仪制造商提供的说明。我们采用 200 W 功率处理 5 分钟，O2 流速为 100 sccm。将样品浸入 ddH2O 中，确认表面呈超亲水性。随后在 N2 气流下彻底干燥表面。
  2. 通过将 39.6 μl 正十八烷基三氯硅烷（OTS）加入 100 ml 甲苯中，配制 1 mM OTS 溶液。将样品浸入该溶液中，在室温下反应 1 小时。此步骤需在充满 N2 的手套袋内进行（图 1：步骤 B）。
  3. 为去除物理吸附的分子，依次在甲苯、丙酮、乙醇和 ddH2O 中对样品进行超声处理，每种溶剂各 5 分钟。随后用新鲜 ddH2O 漂洗样品四次，并在 N2 气流下干燥表面。处理后的表面应呈疏水性，接触角为 100–110°。

3. Ex-Situ 表面图案化

  1. 在超净工作台中，使用金刚石刻划笔在表面划出几道划痕。这些划痕有助于标记已处理区域，并辅助显微镜聚焦。对OTS修饰的TiO₂进行灭菌2 用70%乙醇浸泡样品5分钟进行消毒，然后用无菌ddH₂O将样品冲洗两次2O.
  2. 将样品置于35 mm培养皿中，加入2 ml PC12生长培养基（见步骤4.2）。在CO₂培养箱中孵育超过3小时。2 培养箱（37 °C）。该步骤旨在使血清白蛋白吸附至表面。吸附的白蛋白可抑制其他蛋白质和细胞的进一步吸附（图1步骤 C）。
  3. 等待期间，设置倒置荧光显微镜。
    1. 打开弧光灯，插入紫外滤光片组，将物镜调至20倍。
    2. 测量光强度 I （W cm-2使用紫外强度计测量，并计算照射时间 t （单位：秒）对应某一剂量的 d （每平方厘米焦耳，J/cm²）-2作为： t = d/I.
      例如，以 200 J cm 的剂量进行照射-2 使用600 mW cm的光源-2，需要照射333秒。
    3. 使用载物台测微尺并关闭视场光阑，以设定待照射区域的大小。 例如, 200 μm.
  4. 孵育3小时后，向培养基中补充 200 μl 3.0 mg/ml-1 IV型胶原蛋白（Col-IV；终浓度 300 μg ml-1).
  5. 将35 mm培养皿转移至显微镜载物台。找到划痕标记，调节显微镜聚焦至样品表面，并以200 J/cm²的剂量照射紫外光。-2 (图1：步骤 D）。可通过调节视场光阑的开口大小，或用任意几何形状的金属掩膜替换视场光阑，来改变紫外光照射区域。
  6. 更换为新鲜的生长培养基（不含Col-IV），并将样品放回培养箱中。

4. 细胞培养

  1. PC12 细胞的常规培养在胶原蛋白包被的塑料培养皿中进行。
    1. 用 ddH₂O 润湿 60-mm 组织培养皿表面后，加入 Col-IV 进行包被2O，并吸除所有ddH₂O2O.
    2. 准备 300 μg ml-1 通过将原始溶液（3 mg/ml）稀释来制备 Col-IV-1) 用ddH₂O稀释10倍2O.
    3. 添加 200 μl 的 300 μg ml-1 每60 mm培养皿使用Col-IV。让溶液充分覆盖表面。
    4. 在超净工作台中干燥培养皿约1小时。
    5. 用 4 ml 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗表面两次。若不立即使用包被的培养皿，请用 4 ml 的去离子水（ddH₂O）冲洗一次。2O. 吸去 ddH₂O 后2将培养皿存放在培养箱中。请尽量不要存放超过两周。
  2. PC12 细胞在以下培养基中培养：DMEM（低糖型） + 10% 胎牛血清 + 5% 马血清 + 1% 青霉素-链霉素溶液。将细胞置于含 5% CO₂ 的培养箱中，在 37°C 下孵育。2 培养箱（37 °C，5% CO₂2），每隔一天更换一半培养基。细胞在达到汇合前进行传代。
    1. 吸除培养基，加入 2 ml PBS+ (D-PBS + 10 mg/ml 胰岛素)-1 牛血清白蛋白（BSA）+ 10 mM EDTA）预热至 37 °C孵育5分钟于 37 °C轻轻敲击培养皿，使所有细胞脱落。
    2. 收集细胞至15 ml锥形管中。用3 ml预热至室温的新鲜D-PBS冲洗培养皿， 37 °C.
    3. 将试管在150 × g条件下离心4分钟。
    4. 吸除上清液，加入1 ml培养基。
    5. 常规培养时，以1:3至1:5的比例传代细胞。
  3. 将细胞接种至经紫外光修饰的OTS/TiO表面2 样品，计数细胞密度并加入 3.0×105 35 mm 培养皿中的细胞（图1：步骤 E）。将培养皿置于湿润的培养箱中孵育（37 °C，5% CO₂2）1-2 天。可用于图案化实验的细胞包括未分化的和经神经生长因子（NGF）分化的 PC12 细胞。对于 NGF 分化，使用 100 ng/ml-1 在将细胞接种到样品上之前数天，向生长培养基中添加7S-NGF。NGF诱导的分化似乎可增强PC12细胞的黏附性，使操作更为简便，尤其是在 原位 图案化实验。

5. 原位 表面图案化

  1. 培养1-2天后 原位之外 修饰表面后，确认细胞仅在紫外光照射区域贴附和生长。按照步骤3.4所述设置显微镜。
  2. 将样品转移至含有培养基和100 ng/ml-1 NGF（若使用NGF诱导分化的细胞）以及 100 μg 毫升-1 Col-IV
  3. 将培养皿置于显微镜载物台上，找到合适位置，以200 J/cm²的剂量照射紫外光。-2 (图1：步骤 F、G）。新创建的许可区域用星号标示在 图1步骤 G。
  4. 尽量在30分钟内完成单个样本的处理。照射后，将样本转移回不含Col-IV的培养基中。
  5. 在转移培养细胞的培养皿以及将样品从一个培养皿转移到另一个培养皿时，需格外小心，以防止图案化细胞脱落。

紫外光诱导蛋白质结合示意图；TiO2玻璃、OTS自组装单分子层、白蛋白、胶原蛋白、PC12细胞过程。
图1. 整体过程的示意图。 详见正文。 请点击此处查看此图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图2A展示了溅射沉积的TiO2薄膜的横截面扫描电子显微镜（SEM）图像。根据观察，该薄膜的厚度约为150 nm。值得注意的是所沉积TiO2薄膜的平整性。进一步通过原子力显微镜（AFM）分析表明，表面的均方根（rms）粗糙度为0.2 nm（图2B）。

当TiO2表面经OTS修饰后浸入含血清的培养基中时，血清白蛋白会吸附到OTS表面，从而抑制后续的蛋白质吸附和细胞黏附18,20。随后，当对表面照射聚焦紫外光时，TiO2表面会产生活性氧（ROS）21，这些活性氧会分解TiO2表面的OTS自组装单分子层（SAM），并将其连同吸附的白蛋白一起从表面去除。这一过程使受照射区域变为亲水性，并允许蛋白质吸附。ROS可能同时直接作用于白蛋白，但由于OTS SAM位于白蛋白与TiO2之间，因此OTS的分解应为主要反应。在本实验方案中，照射过程中在培养基中添加了细...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在本实验方案中，TiO2 薄膜通过射频磁控溅射法形成。我们倾向于使用这种沉积方法，因为它能够重复性地制备出表面粗糙度在亚纳米级别的光催化 TiO2 薄膜。尽管溅射沉积技术在材料科学家和电子工程师中较为常见，但对生物学家而言可能较难获得。在此情况下，旋涂法制备的 TiO2 薄膜可作为替代方案23。该方法利用离心力将溶解于溶剂中的 TiO2 纳米颗粒均匀铺展在基底表面。所需特殊设备为旋涂仪，其成本远低于溅射系统。我们曾自行使用旋涂法制备的 TiO2 纳米颗粒薄膜，并已证实该薄膜同样可用于开展类似实验（数据未显示）。旋涂法制备的 TiO2 薄膜表面相对粗糙，均方根粗糙度达数十纳米，且在需要多次旋涂以获得较厚薄膜时，要实现基底上均匀且可重复的涂层需一定操作经验。然而，该方法可能是生物学家的首选方案。

迄今为止，我们已将该方法用于不仅对PC12细胞进行图案化，还对人胰腺癌细胞系AsPC-1以及从胚胎大鼠海马组织中分离的原代神经元进行图案化<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢大久保幸太郎先生在扫描电镜成像方面提供的帮助。本工作得到了日本科学促进会基础研究（B）项目（20310069）、研究活动启动项目（25880021）以及久保纪念日立科学技术振兴财团和日本板硝子材料科学与工程财团研究基金的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玻璃盖玻片Warner InstrumentsCS-15R15直径 15 mm，#1.5 厚度
金刚石刻划笔Ogura Jewel IndustryD-Point Pen
射频溅射系统ANELVASPC350
TiO2 溅射靶材Kojundo Chemical LabTitanium (IV) oxide, target纯度 99.9%
等离子体反应器YamatoPR301
正十八烷基三氯硅烷（OTS）Aldrich104817
甲苯Wako204-01866
组织培养皿（35 mm）Greiner627160
组织培养皿（60 mm）BD Falcon353002
IV型胶原蛋白Nitta GelatinCellmatrix Type IV
D-PBSGibco14190-144
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11885-084
胎牛血清Gibco12483-020使用前需热灭活并通过 0.22 μm 滤膜过滤
马血清Gibco26050-088使用前通过 0.22 μm 滤膜过滤
青霉素-链霉素（100倍浓缩液）Nacalai tesque26253-84
7S 神经生长因子（NGF）Alomone LabsN-130
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA2153
EDTADojindoN0010.5 M 储存液
TiO2 纳米颗粒TaycaTKD-701

参考文献

  1. Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).
  2. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
  3. Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
  4. Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01(2011).
  5. Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
  6. Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
  7. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).
  8. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164(2011).
  9. Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
  10. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
  11. Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514(2010).
  12. Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
  13. Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
  14. Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012(2014).
  15. Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
  16. Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
  17. Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
  18. Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021(2014).
  19. Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
  20. Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
  21. Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
  22. Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
  23. Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
  24. Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

PC12
使用 TiO2 光催化在水相环境中对蛋白质和细胞进行光图案化
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。