本方案描述了一种利用微流控装置实现小体积（0.15–1.5 ml）颗粒分离的自动化系统架构，并讨论了优化声流控装置性能与操作的方法。
本文内容
摘要
摘要
微流控装置的一个主要优势是能够操控微量样品体积，从而减少试剂浪费并保护珍贵样品。然而，为了实现可靠的样品操控，必须解决微流控装置与宏观环境之间的集成问题。为实现可重复且高灵敏度的颗粒分离，本实验方案提供了一个完整的自动化、集成化微流控平台，能够利用微流控装置对0.15–1.5 ml样品进行精确处理。该系统的几个关键方面包括模块化的装置布局和稳定的固定装置，从而实现可靠且灵活的宏观环境到芯片的连接；以及全自动化的流体处理，可完成闭环样品收集、系统清洗和引液等步骤，以确保操作的可重复性。不同的微流控装置可与此平台架构互换使用。本文中我们整合了一种声流控装置，详细描述了其表征方法、性能优化过程，并展示了其在生物样品尺寸分离中的应用。通过在分离实验过程中使用实时反馈，优化了样品收集过程，以实现样品的节约与富集。尽管该架构需要集成多种设备，但其优势在于能够无需额外系统优化即可处理未知样品、便于装置更换，并实现精确、稳定的样品处理。
引言
样品分离与分馏是微流控技术最具前景的应用领域之一。此类样品处理步骤对于有效的临床诊断、治疗开发、生物监测以及生命科学研究与技术的进步至关重要。已有大量微流控分离策略被用于悬浮于液体中的颗粒物和胶体，以及化学与生物物种的分离；多篇综述已对这些领域的最新进展和发展进行了概述1–9。尽管这些微流控分离技术（下文简称为“核心装置”）中的许多已被充分表征，但极少有研究从系统层面来考虑样品分离问题。核心装置通常是独立的厘米级芯片，通过氟聚合物管路连接，并由位移泵或压力泵驱动流体输送。然而，若要实现微流控技术所承诺的优势——包括更高的自动化程度、更高的可靠性以及样品用量的减少——就必须投入相当的努力，用于设计一个将核心装置集成在内的完整分离系统。
此外，微流控技术在生物检测应用中的一个主要挑战是宏观与微观之间的接口问题。这不仅指微流控装置与宏观组件之间物理上的“世界到芯片”连接，以及典型临床或分析样本体积（约0.1–10 ml）与微流控芯片内部体积（约0.01–10 µl）之间的不匹配，还包括跨越这些尺度时产生的统计采样局限性。这些问题导致人们普遍认为样本预处理和制备是生物检测中的“薄弱环节”10。本研究中描述的平台在解决这些挑战方面迈出了重要一步。
从系统层面出发，本方案详细阐述了在约10分钟内对精确计量的分析级体积（范围为0.15至1.5 ml）进行可靠处理的方法 时间尺度。该操作为“一键式”：将含有样品的源管和用于组分收集的目的管放入系统后，启动“运行”命令即可开始程序，所有步骤均由计算机控制。运行结束后，可将收集管从系统中取出，用于后续对分离组分的分析。
该系统的核心装置是一种声泳芯片，可从样本中分离出哺乳动物细胞尺寸（5–20 µm）的颗粒。此处选择声泳分离技术，主要是因为它具有高通量（高达数百 µl/min）、无需标记且为非接触式，因此在从细胞中分离具有活性的病毒方面，优于大多数其他微流控技术。声学颗粒聚焦的物理原理已有广泛报道11–13，但并非本实验方案的重点；以下将简要概述其基本原理，以帮助理解其在微流控分离中的应用。
充满液体的微通道中谐振的超声驻波会产生压力场，从而产生驱使颗粒向低压节点移动的作用力。该作用力的大小取决于颗粒的体积，以及由颗粒和悬浮液的相对密度与可压缩性导出的声学对比因子14。因此，声学聚焦非常适用于分离细胞尺寸（约7–15 µm）与病毒尺寸（约50–200 nm）的颗粒。较大的颗粒会迁移至压力节点；然而，由于小于2–3 µm的颗粒所受作用力极小，这些微小颗粒或溶解物质几乎不发生移动。我们所采用的声学分离具体实现方式如先前所述15，通过引入薄壁结构将流体通道分隔，并实现可调且非对称的聚焦位置布置。这增强了器件设计的灵活性，其性能优势——包括更高的分离质量和速度——已在其他文献中详尽描述16,17。
然而，本研究中描述的系统级设计方法的一个主要优势在于，它能够适应多种多样的微流控核心器件。例如，大多数其他连续流动分离模式，包括惯性分离、流场分级、确定性侧向位移（DLD）以及各种类型的电动力学器件，均可被直接整合进来，只需根据入口/出口配置、流速和样品体积的变化进行适当调整即可。对于具有多种片上场（如电场、磁场）或梯度（如热梯度、化学梯度）的器件，可能需要增加与芯片的连接或集成额外的硬件，而本平台能够支持此类扩展。
本方案提供了设计微流控分离装置的步骤，并通过深反应离子刻蚀（DRIE，一种在许多微加工设施中可获得的等离子体刻蚀工艺，利用交替的刻蚀和钝化循环，实现具有垂直侧壁的深结构18）来制备硅-玻璃芯片。接着，我们描述了声流控装置的表征方法，以确定分离过程的最佳操作参数，最后详细说明了完全集成的分离系统及处理生物样品的操作流程。随后展示了典型的装置表征结果和样品处理数据并进行讨论，同时强调了该方法的关键优势，包括模块化、稳定性、精确性和自动化。
方案
1. 声泳装置设计与光刻掩模布局
注意：微加工工艺设计和掩模布局的一般性考虑和指导可参见关于微加工的文献以及光掩模设计教程19–21。
- 使用适当的CAD软件绘制掩模1（即流体层，正面）。选择一种能够满足目标应用所需的样品注入和分离要求的几何结构。
- 对于声学聚焦，设置流体通道宽度 w 提供一个共振频率 fn 大于1 MHz，根据该方程 fn = nc/2w，其中 c 是相关流体中的声速 n 为驻波节点的数量（例如，用于900-µm 宽的通道中，双节点共振预期出现在 f2 = 1.65 MHz
注意：在分离通道末端附近占据不同横向位置的颗粒应从不同的出口流出。在本方案中，颗粒按尺寸进行分离，因此出口分别标记为 SPO 和 LPO，代表小颗粒出口和大颗粒出口，如图所示 图1. - 通过设置流体通道长度来控制粒子在特定流速下暴露于分离场的时间。必须在粒子因分离力作用而迁移的较长芯片内滞留时间与所需更大的芯片占用面积之间进行权衡。
注意：在我们的声学聚焦装置中，流体通道在芯片上往返三次以延长停留时间（图2a）。在通常为200的总流速下 µ升/分钟，颗粒流经300 x 200 µ横截面为 m、长度为 117 mm 的分离通道中，粒子在声场中的平均停留时间为 2.1 秒。
- 对于声学聚焦，设置流体通道宽度 w 提供一个共振频率 fn 大于1 MHz，根据该方程 fn = nc/2w，其中 c 是相关流体中的声速 n 为驻波节点的数量（例如，用于900-µm 宽的通道中，双节点共振预期出现在 f2 = 1.65 MHz
- 在掩模版布局中包含流体端口，用于连接排列在标准网格（5 mm间距）上的通用管路。在制造及单个器件切割过程中，为实现掩模版之间的对准，应添加适当的对准标记。
- 放置掩模2（通孔层，背面），该层仅包含流体端口。包含用于与掩模1对齐的基准标记。
图1. 声流控装置。 声泳装置结构的示意图。（a）顶视图，显示整体H型过滤器构型（未按比例绘制）。（b）位于（a）中黑色虚线标记位置的通道横截面示意图，显示压力场（蓝色虚线）以及将颗粒推向波节面的声初级辐射力（PRF）方向（红色箭头）。通道横截面尺寸为900×200 µm，主通道（宽300 µm）与旁路通道之间由约10 µm厚的壁分隔。（c）颗粒分离的三维示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 声泳微流控芯片的洁净室制备
- 使用标准的正性光刻胶光刻技术，通过掩模2在双面抛光、厚度为0.5 mm、直径为100 mm、晶向为<100>的硅片上刻蚀背面流体通孔结构。 采用深反应离子刻蚀（DRIE）将该结构刻蚀至350–400 µm深度。
- 将硅片翻转，使用掩模1通过标准的正性光刻胶光刻技术在硅片另一面定义正面流体通道结构。然后，使用光刻胶将器件硅片粘附到第二片（空白硅）承载硅片上。
- 同样采用DRIE刻蚀通道，深度为200 µm，并在通孔位置完全刻穿硅材料（承载硅片可保护DRIE设备表面）。将器件硅片浸入去胶液中，从空白硅片上剥离下来。
- 使用piranha溶液（浓硫酸与过氧化氢按3:1比例混合）清洗器件硅片和一片无结构的0.5 mm厚硼硅酸盐玻璃片。
- 通过阳极键合将玻璃片与硅片密封以封闭流体通道，键合参数如下：腔体压力为3 mTorr，活塞压力为1,000 N，温度为350 °C，施加750 V电压直至电流降至0.2 mA以下。
- 使用划片机上的金刚石刀片将各个芯片切割分离。
3. 最终装置组装
- 压电换能器安装
注意：超声波由附着在硅片侧的压电陶瓷换能器在微流控芯片内产生。- 从双组分低粘度环氧树脂试剂盒中，按推荐比例称取两种组分并充分混合。
- 使用移液器吸取环氧混合物，并均匀涂布于锆钛酸铅（PZT）压电陶瓷表面，形成一层薄而均匀的涂层（对于尺寸为 37.5 × 10 × 0.5 mm 的压电陶瓷，约需 10 µl 环氧混合物）。
- 使用合适的夹具或固定装置，将压电陶瓷的涂胶面与微流控芯片对齐，在一侧预留出悬空区域以便后续连接导线（见图 2a），然后使两者接触。将组件用台钳夹紧，注意避免任何部件破裂，并按照环氧树脂制造商推荐的温度和时间进行固化。
- 环氧树脂固化后，使用细头电烙铁将细导线焊接到压电陶瓷两侧，焊接时应尽可能缩短与压电陶瓷的接触时间，以避免热致去极化。或者，也可使用导电胶将导线粘接至压电陶瓷上。
图2. 流体万用板、芯片安装及外部系统与芯片接口。 照片显示：（a）声学微流控芯片（外部尺寸为70×9×1 mm），带有连接的压电换能器导线，芯片上分离通道沿长度方向往复三次；（b）定制的流体螺纹接头及机械加工的管路组件，用于实现芯片与外部系统的连接；（c）利用夹具将芯片安装在流体万用板的底面，跨过万用板上的开孔以实现风扇散热；（d）万用板顶部视图，显示已连接的管路和散热风扇；以及（e）螺纹接头的横截面示意图，展示管路与安装好的微流控芯片之间的接口结构。请点击此处查看此图的放大版本。
- 设备安装与外部系统与芯片的连接
- 使用夹具将芯片固定在“流体面包板”（一种带有规则排列螺纹通孔网格的板）上。在面包板上安装散热风扇，以在声学实验期间调节温度（见图2）。
注意：在典型驱动电压下若不使用散热风扇，设备温度将升至70–80 °C。由于流体中声速发生变化，这会显著改变共振频率，并可能对正在处理的任何生物颗粒的活性产生不利影响。 - 安装此前 elsewhere22 所述并如图2所示的芯片与外部连接器。使用标准的¼”-28接头将这些接口管路与入口和出口处的额外管路连接，适用于1/16”管路。
- 使用夹具将芯片固定在“流体面包板”（一种带有规则排列螺纹通孔网格的板）上。在面包板上安装散热风扇，以在声学实验期间调节温度（见图2）。
4. 声学聚焦性能的表征
注意：用于声学聚焦表征的系统组件已在材料列表中集中列出。以下步骤 4.1 和 4.2 适用于与本平台配合使用的任何核心设备，而后续步骤则描述了与本文讨论的声流控设备相关的特定操作。
- 系统配置
- 使用流体面包板上的芯片外部连接方式，按照第3节所述组装微流控芯片。通过管路（例如外径为1/16英寸的氟聚合物管）将芯片连接至流体泵和收集管。将面包板组件安装在配备CCD相机、可进行荧光成像的显微镜载物台上。
- 在芯片后立即连接小内径（ID）管路（推荐使用0.006英寸），参见 图4）作为流阻器，以稳定系统并控制芯片出口之间的分流。其余所有连接使用内径更大的管路，例如 0.01” 或 0.03”。
- 估算流体动力学流动阻力 Rh 每段管子的长度 L 内径 D 使用该方程 Rh = 128 μL/πD4，其中 μ 是流体的动力粘度。压力降 ΔP 由于在给定流速下每段管路的长度 Q 由……给出 ΔP = QRh.
- 根据所采用的分离方法，选择合适的限流通道长度比例，以适当地分配出口间的流体流量。本方案中，声学芯片实现最佳分离效果需要SPO与LPO的流速比约为65:35%。
- 选择出口流阻器的长度，使其流体阻力至少比系统其余部分的总阻力大3–4倍（根据串联或并联情况适当求和）。对于本研究中使用的声泳装置，LPO和SPO的管路长度分别为35 cm和65 cm较为合适。
注意：必须仔细考虑 Rh 任何微流控核心装置。在本研究中，我们的声学聚焦芯片 Rh 由于其通道尺寸相对较大，因此（芯片）阻力较低，导致连接管路的阻力很容易超过它。对于通道尺寸较小的器件，芯片本身的阻力可能在整套系统管路中占主导地位，此时需对芯片上通道的设计与控制进行优化 Rh 在本方案的第1步中，还需考虑其他因素。相关详细的设计原则和指南可参见文献。23,24
- 系统验证
- 检查是否存在泄漏，以确认微流控装置无缺陷且所有管路连接均密封完好。根据需要使用注射器通过入口管路注入水，并监测主通道是否有液体泄漏。
- 通过芯片 dispensing 已知体积的液体，并测量各出口收集到的体积，以确保流体比例符合预期。若体积比例偏离预期值，可能表明某一出口存在堵塞或连接处发生泄漏。
- 为保持系统清洁并防止堵塞，需使用适当的清洗溶液冲洗整个系统（流体管路和芯片）例如、漂白剂、乙醇、水）在进行任何实验前后。
- 若其中一个出口发生堵塞，可堵塞通畅的出口，同时冲洗系统以清除堵塞。如果此方法无效，可在冲洗时反转流体方向，并可选择使用手动注射器施加快速的反向脉冲。若仍无法清除堵塞，则根据需要更换管路或芯片。
- 声学聚焦的频率扫描设置
- 填充旁路通道（参见 图1）使用去离子水、乙醇或磷酸盐缓冲液（PBS）等液体通过注射器手动注入进行冲洗。请注意，该液体不会与正在处理的样品接触。有关使用不同旁路液体调节节点位置的详细信息见其他文献。16,17简而言之，若需使节点更靠近分隔壁，则使用密度较低的旁路流体（如乙醇）；若需使节点更靠近输入样品流，则选择密度较高的流体（如甘油溶液）。
- 制备浓度约为 0.01% (w/v) 的珠溶液，粒径为 5–8 µ将悬浮于含0.05% Tween-20的PBS等缓冲液中的荧光聚合物微球加入样品入口注射器中，并用该微球溶液填充样品入口注射器。用相同的缓冲液填充缓冲液入口注射器（此液体无需与旁路通道中的液体相同）。注意，通常应根据具体应用选择合适的缓冲液（参见步骤5.1）。
- 将流体实验板置于显微镜载物台上，对焦至分离通道和旁路通道均位于视野内、靠近出口处的直通道区域，焦平面约为通道深度的中间位置。为成功进行图像数据的后期处理，可能需要额外的斜入射外部光源以使通道壁可见。
- 自动频率扫描与图像采集
- 使用屏蔽电缆进行电气连接（例如，配备BNC连接器的RG-58电缆）连接至带有射频（RF）放大器的信号发生器，以向压电换能器输送激励信号。可选地，将示波器连接至信号发生器的输出端，用于监测施加到换能器的实际电压。
- 打开冷却风扇，并调节函数发生器，使射频放大器输出至压电换能器的电压峰峰值在12–25伏特（V）范围内pp).
- 将两个注射泵的流速均设定为50至200之间的相同值 µ升/分钟。建议使用单个注射泵通过同一电机驱动两个注射器，以尽量减少对流体流动的扰动。
- 使用实验室自动化工具包（如 National Instruments LabVIEW），通过设定起始频率和终止频率、频率步长以及压电驱动电压，执行频率扫描程序。
- 在每个频率步长下，施加电压15秒以使系统达到平衡，随后采集芯片中微珠流动的10幅图像用于后续分析（建议曝光时间为10至100毫秒）。
- 在每个施加的频率步长之间，关闭电压约20秒，以使微珠在通道内均匀重新分布，并消除先前频率步长所造成的聚焦偏倚。
- 图像分析以确定共振频率和聚焦位置
- 运行图像分析脚本（例如本实验方案提供的 AF_freqScanPlotter.m MATLAB 脚本），并在提示中输入所需信息：选择第 4.4 步生成的图像文件列表，输入扫描起始频率、终止频率和步长，全通道宽度，管壁位置，最后选择待分析的图像区域，包括分离通道和旁路通道。
- 观察分析脚本对在每个频率步长下采集的图像集进行平均，并沿流动方向对强度值进行平均。这将得到荧光强度的横截面线扫描结果。
注意：强度最高的频率被定义为共振频率（图3，中间行），通道中强度最高的位置即为聚焦位置（图3，底行）。
图3. 典型的频率扫描结果。 压电元件与芯片耦合良好（A）和耦合不良（B）情况下的频率扫描数据示例。第一行：微珠的荧光强度（红色表示高强度，蓝色表示低强度）。第二行：每个频率下的最大强度。 第三行：最大强度的位置，其中红色虚线表示预测的聚焦位置，红色菱形表示由最大强度确定的共振频率。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 自动化分离
注意：由于在微流控芯片中施加了与尺寸相关的声学聚焦力，自动化分离实验用于将大颗粒与小颗粒分离开。所需系统组件已汇总于材料列表中。
- 系统配置与样品准备
- 将微流控芯片连接至注射泵、计算机控制的多通道选择阀、与计算机连接的流量计以及管路，如图4所示。该配置可实现样品在微流控分离芯片中的自动化处理，并在实验之间自动执行清洗步骤，以消除交叉污染和样品残留。
- 使用适合待分离细胞或颗粒的样品缓冲液，或根据分离后所用分析检测方法的要求选择缓冲液。与步骤4.3.2相同，回收缓冲液（但旁路流体不一定）必须与样品流体相匹配。
注意：通常用于生物样品的任何水性缓冲液（例如，PBS）其声学性质与水相似，不会显著影响声泳装置的性能。可以使用密度和黏度与水显著不同的样品流体，但仅建议由具备丰富声泳操作经验的人员使用。
图4. 用于自动分离实验的声学系统配置。 蓝色线条表示系统中的主要流路。所有绿色和黑色线条为内径（ID）0.03”的管路，所有蓝色和灰色线条为内径0.01”的管路，其中储存线圈为内径0.03”，流阻器为内径0.006”，属于例外情况。注射器中充满缓冲液，储存线圈具有足够的容积（550 µl），可防止任何样品或清洗试剂进入注射器。请点击此处查看该图的放大版本。
- 分离步骤
- 预运行状态。在开始分离之前，确保清洗试剂储液槽（次氯酸钠、乙醇、缓冲液）中有足够的液体，废液储液槽未满，且流路已预充满（即，管路中已充满溶液）。如果不确定后者是否满足，或系统在闲置后首次运行（例如，当天第一次使用），请执行一次自动清洗程序（见下文第5.3步）。初始时将芯片出口处的阀3和阀4设置为流向废液储液槽。
- 打开冷却风扇，并将函数发生器设置为步骤4.5中确定的声学芯片的共振频率。调节函数发生器上的电压设定值，使射频放大器输出12至25 Vpp之间的电压，具体数值应根据所需的分离效果进行调整。
- 将样品输入管、缓冲液输入管以及相应的收集管连接至系统。在将样品输入管连接到取样管路之前，短暂涡旋混匀，以重新悬浮可能已沉降的颗粒。随后立即连接样品管并启动分离程序。
警告：若待处理样品含有潜在感染性物质，应使用螺口管以维持封闭系统，防止样品气溶胶化。此外，在处理生物危害材料时，操作所有管路和管件时应穿戴必要的个人防护装备，并遵循适用于该材料的生物风险等级和生物安全级别的相应危害控制措施和操作规程。如有任何疑问，请查阅机构的相关政策和标准操作程序。 - 使用实验室自动化工具包中的程序控制阀门、流量传感器和泵，以执行全自动分离程序。
注：该程序会切换阀门，驱动注射泵进行抽吸和注入，并监控流量传感器数据，以准确控制输出样品组分的收集时机。主要步骤在下文5.2.4.1至5.2.4.3中总结，假设为手动操作。- 预充满取样管路。从样品输入管中抽取约15 µl液体，以完全填满连接至阀1的管路。同时，预充满连接缓冲液输入管至阀2的管路。类似地，预充满阀1的空气入口，确保其中无液体残留。最后，切换阀1和阀2，将进入加载线圈的多余液体或空气排入废液。
- 加载样品线圈，如图5a所示。处理250 µl样品的典型加载序列为：以50 µl/min速度抽取25 µl空气，然后以200 µl/min速度抽取250 µl样品，接着以200 µl/min速度抽取35 µl前导缓冲液，最后再以50 µl/min速度抽取25 µl空气。
注：所有体积和流速均可由用户设定。请注意，此加载顺序与液体塞在分离装置中流动的顺序相反。 - 开始样品注入。将注射泵设置为以所需速率（通常为100 µl/min）注入已加载的液体塞。通过流量传感器监测SPO和LPO处的流速，确保流速稳定且符合步骤4.1中确定的比例，并确认未发生堵塞。
- 收集分离后的组分。当流量传感器检测到流速突增，表明第一个气隙通过时，将相应的输出阀从废液（初始状态为步骤5.2.1中设置）切换至样品收集管。
- 当样品通过芯片后，观察流量传感器检测到第二个气隙。此时，将输出阀切换回废液。待步骤5.2.4.2中加载的全部体积排出后，停止注射泵注入，并在流速降至零时终止自动化程序。
- 分离实验完成后，断开SPO和LPO的样品收集管，并妥善保存以供后续分析。
- 自动清洗与去污
注：在处理每个样品前，使用以下自动程序冲洗并去污整个流体系统。- 将SPO和LPO收集管以及样品取样管固定在空管中，用于收集冲洗过程中排出的多余清洗液。
- 启动自动系统清洗程序。与第5.2步中的自动分离程序类似，程序应控制阀门和注射泵，依次将清洗试剂加载至 Holding 线圈，并将其冲洗通过系统。
- 执行以下清洗程序：依次用10%次氯酸钠、70%乙醇冲洗，最后用水或适当的生理缓冲液（例如，1x PBS或用于样品处理的缓冲液）结束。冲洗体积如下：次氯酸钠和乙醇各450 µl，水/缓冲液1,000 µl。
- 在冲洗过程中，当LPO出口阀处于封闭端口时，将每种试剂冲洗进入SPO；然后反向操作，以清除出口限流器中可能存在的堵塞。保持300–500 µl/min的抽吸和注入流速，以在SPO或LPO被封闭时尽量减少管路中气泡的产生和背压积聚。
- 按照处理生物或化学废物的适当程序，丢弃多余的冲洗液及其收集管。
结果
声学微流控装置设计的关键特征如图1所示，其他地方已有详细描述。15 简而言之，两股流体在分离通道中并排流动，通过一层薄硅壁与相邻的旁路通道隔开。由于一次辐射力的大小与颗粒体积成正比，较大的颗粒会从混合样品进样流中迁移至相邻回收流体流中的声压节点处，而较小的颗粒则保留在原始流道中（图1B、C）。这种双通道分段结构可提高颗粒分离效果17，并通过使用不同的旁路通道流体调节节点位置16。流体母板及固定装置为芯片连接提供了稳定的平台，模块化设计可实现不同微流控芯片之间的快速更换（图2）。该配置同样支持可逆的流体连接，可在高达1,000 psi的压力下实现快速、可靠的密封（图2B、E）。
芯片的共振频率 fres 可通过简单的 1D 解析计算进行估算（参见步骤 1.1.1）。根据对器件截面建立的更完整的 2D 有限元模型16，2 节点共振的预期聚焦位置为距通道壁 225 µm 处，预期频率为 1.68 MHz。然而，实际器件的 fres 可能因工作温度以及纵向与横向共振的耦合情况而产生 ±100 kHz 的偏差。因此，在器件组装完成后，必须在相关的流速和压电驱动电压条件下，通过实验验证 fres，具体方法如方案中步骤 4 所述。图 3 展示了在主通道和旁路通道中通入水、流速为 200 µl/min、向压电元件施加 20 Vpp 电压时测得的典型频率扫描结果。当压电元件与微流控器件之间的耦合良好时，颗粒会在共振频率下实现紧密聚焦，从而在荧光强度上形成明显的峰值，并迁移至预期的聚焦位置（图 3A）。相反，若耦合效果较差，颗粒聚焦效果不佳，频率扫描结果将类似于 图 3B。对于此类器件，若使用了可逆性粘合剂，可能需要重新安装压电换能器；否则，当应用对高质量聚焦或高流速有严格要求时，该器件将不适用。图 3 中的数据可用于确定后续实验的操作频率，以及实现高效颗粒分离时可用的电压和流速范围。
图5. 自动化样品处理。（A）样品加载至样品环中的示意图。（B）一次成功分离实验的典型流路曲线。（C）在约220秒时SPO出口发生堵塞的分离运行流路曲线。请点击此处查看该图的放大版本。
在确定有效的分离芯片后，将其整合到如图4所示的系统中。主流动路径（蓝色线条）采用内径为0.01英寸的管路，以最小化整个系统的扫过体积。图5A展示了通过该系统注入的典型样品塞的组成。样品前方需加入少量“前导缓冲液”（约35 µl），以消除样品流经分离芯片时的流动波动。图5B显示了一次成功的自动声学分离实验所获得的流动数据。成功运行的关键特征包括：（1）随着压力上升且流体开始流经系统，LPO和SPO中的流速均出现短暂上升；（2）出现一个明显的尖峰，表示气泡通过（插图显示单个气泡的扩展轮廓），由于两个出口的流量不均，气泡应先到达SPO，后到达LPO；（3）在两个气泡之间，当样品流经系统时，两个出口的流动保持稳定；（4）在全部样品体积输送至系统后，两个出口的流速均逐渐下降。异常运行可通过类似于图5C的流动曲线立即识别，该图显示SPO在约220秒后发生堵塞。此时，应执行与步骤5.3中所述类似的清洗程序，以清除通道堵塞。
图6. 装置可调性：颗粒尺寸与电压的影响。在LPO中提取的聚苯乙烯微球百分比取决于颗粒尺寸以及施加到压电陶瓷上的电压。每条曲线对应一个不同的工作电压，该电压在共振频率下确定，具体方法如步骤4所述。装置的总流速为200 µl/min，施加的驱动频率范围为1.62至1.64 MHz。误差条表示至少三次独立实验的标准偏差。经英国皇家化学学会许可转载并修改，原文来源：http://pubs.rsc.org /en/Content/ArticleLanding/ 2014/AN/c4an00034j。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6展示了使用不同粒径的聚苯乙烯微粒和压电驱动电压所获得的综合分离结果，表明了实现高效分离所需的运行参数。通常，如预期一样，分离较小的微粒需要更高的电压（即更强的声学力）。然而，由于热耗散增加以及声流效应逐渐显著，驱动电压不能无限提高。13 该图可作为微粒分离的一般性参考——在特定驱动电压下回收率显著不同的微粒（例如，8.8 Vpp时10 µm和2 µm的微粒）能够实现良好分离。一般来说，尺寸差异较大的颗粒群体，例如病毒（~100 nm）与细胞（~10 µm），或不同尺寸的细胞（例如，6–8 µm的盘状红细胞和8–15 µm的白细胞），均可快速且高效地分离。针对其他类型细胞的操作条件需通过实验确定，因为除细胞尺寸外，细胞形态、密度和可压缩性也会影响其声学对比度。为此，步骤4中的操作程序不仅可用于评估特定声泳装置的性能质量，还可用于确定任何新型细胞或微粒的可用分离条件。
图7. 细胞-病毒加标样品的分离效率。 分离结果来自（A）添加登革病毒（DENV）的Raji细胞，以及（B）添加金门病毒（Golden Gate Virus, GGV）的Raji细胞和蟒蛇肾细胞。回收百分比定义为从特定出口流出的病毒或细胞数量占芯片总流出量的比例。其中（A）的误差棒表示3次重复实验的标准差，而（B）中的样品由于可获取量较少，仅处理了一次。所有实验均使用1× PBS作为样品缓冲液和回收液，旁路通道中使用水。芯片工作频率范围为1.60至1.64 MHz，驱动电压为16至20 Vpp。请点击此处查看该图的放大版本。
为了验证该平台在生物颗粒分离中的实用性，我们首先使用其处理了特征明确的生物样本：将登革病毒（DENV，105 pfu/ml，直径约50 nm26）添加至人Raji细胞（105 个细胞/ml，平均直径8–10 µm25）中。图7A展示了Raji细胞和DENV在SPO和LPO出口中的回收百分比（定义为从每个出口收集的每种颗粒类型数量占从芯片收集的该颗粒总量的比例）。实验重复三次，Raji细胞使用库尔特计数器进行定量，而DENV则通过反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行定量。
接下来，在更接近临床样本处理的场景中测试了该系统的性能，其中颗粒的确切物理特性可能未知，且可用的样本量较少。在此部分，我们评估了新近发现的金门病毒（golden gate virus, GGV）的分离效果，GGV是一种感染球蟒肾脏细胞的蛇类病原体27。GGV病毒颗粒的大小尚未被直接测量，但由于GGV属于Arenaviridae科，其大小可能与该科病毒相似，约为100至150 nm28。我们处理的样本中，将GGV（104 pfu/ml）添加至Raji人源细胞（非该病毒的感染靶细胞）以及球蟒肾脏细胞（GGV的感染靶细胞，直径约10 µm27）中，两种细胞的浓度均为104 个细胞/ml。由于这些样本的可用量较少，本研究仅报告了一次实验运行的分离结果。图7B展示了从SPO和LPO通道中收集到的Raji细胞、球蟒细胞和GGV的比例。在这些实验中，细胞通过血细胞计数板进行计数，病毒则通过RT-qPCR进行定量。
讨论
本方案介绍了微流控装置与宏观设备在系统层面的集成，以实现生物样本的自动化处理。该平台的模块化设计使其能够适配任意连续流装置；作为示例，本方案重点介绍声流控颗粒分离装置性能的表征与优化。本方案突出了三大优势：（i）模块化设计与芯片-外部设备接口，（ii）对装置性能的稳健表征，以及（iii）对精确计量样本体积进行颗粒分离的自动化处理。
i. 模块化与芯片-外部环境接口
如图2所示，微流控芯片安装在定制的实验板上，可轻松固定于显微镜载物台上以进行直接观察。该实验板具有#6-40 UNF螺纹孔，按5 mm间距的网格排列，便于固定芯片并实现流体连接。流体连接采用两端精密加工的PEEK管，通过橡胶面密封垫圈和不锈钢卡套与流体芯片密封。这种接口设计便于快速更换芯片和设备的快速重新设计，只要芯片的布局符合网格格式，其他系统组件通常无需或仅需极少改动。例如，我们已将此平台用于连续流动电泳、热裂解细胞29、化学合成中试剂的快速混合，以及单细胞捕获与分析的微流控芯片。
ii. 器件性能的稳健表征
为了优化任何微流控分离装置的性能，必须首先对其运行状态进行充分表征。本文所述系统支持开发快速且自动化的表征方案。以声学聚焦装置为例，需对每个独立装置测量其聚焦质量、工作频率以及微流控通道中颗粒聚焦的位置。这些测量需要在一系列压电陶瓷驱动频率、电压和流速范围内进行扫描，以确定实现高质量分离的最佳参数组合。本方案所述方法可自动调节这些可调参数并采集相关数据——即，通道中流动颗粒的荧光图像，经后期处理以获得颗粒聚焦质量、频率和位置所需的测量结果图3).
全面表征声学器件性能需要在不同实验条件下重复步骤 4.4 和 4.5。例如，通过在相对较低的流速和较高的电压下进行频率扫描，可确定芯片的绝对聚焦位置，以确保颗粒完全迁移至波节位置。此外，此类频率扫描可用于评估器件组装质量（使用已知尺寸的聚苯乙烯微球进行测试），或确定先前未知类型的颗粒在系统中的行为（在使用微球完成芯片表征后）。若芯片中压电陶瓷与微流控通道之间的能量传递良好，则在高流速（>1 ml/min）和低电压（12–15 Vpp）下仍可实现紧密聚焦；而能量传递较差的芯片即使在低流速（<100 µl/min）和高电压（>20 Vpp）下也无法实现聚焦。我们发现，微流控芯片与压电陶瓷之间的紧密接触对于实现高效的能量传递至关重要。进一步研究微流控芯片与压电陶瓷之间的最佳键合方法，将有助于可靠地生产高性能器件。
最后，通过将第4步（以及图3）中基于图像的频率扫描测量结果与第5步所述微球分离实验中从SPO和LPO获取的颗粒计数数据相结合，这些数据作为相关操作参数的函数，即可全面了解声泳装置的运行情况。如图6所示，这一系列自动化实验可快速表征单个装置的性能与可调性，帮助用户确定用于颗粒分离的最佳参数空间。
iii. 用于颗粒分离的小样本自动化处理
为了成功且准确地进行基于微流控芯片的样品处理，必须在流体通过时可靠且精确地计量、加载、输送和收集流体体积。当样品体积较小时（约 0.1–1 ml），这种精度尤为重要，这在临床或科研实验室环境中十分常见。30 在传统的微流控实验中，样品处理具有挑战性，通常需要手动将样品吸入注射器，并注入装置中，但无法实时反馈样品何时已被分离以及何时应进行收集。本方案采用自动化的样品环加载与分配，并结合流量传感器的实时反馈，从而实现对微量样品体积的可重复分离。
图5展示了从一次典型分离实验中在SPO和LPO测得的流速分布。首先，需加载至少35 µl的前导缓冲液，以确保样品到达声学芯片前系统内流速稳定。不建议使用小于100 µl的样品体积，因为前导缓冲液会导致样品过度稀释。在进样开始时，前导缓冲液之前使用一段空气塞，以将样品塞与后续流体分隔开，防止样品混合和稀释，并作为流速传感器的指示信号。当流体开始流经系统时，经历一段初始瞬态过程，随后两个出口处均出现明显的尖峰信号，表明第一个气泡通过。此后，随着样品流经系统，进入一段长时间的稳定流速阶段；接着，第二个气泡通过时再次出现尖峰信号；最后，在注射泵停止后，流速逐渐下降至零。
气塞通过流量传感器的过程用作触发点，以切换阀门来启动和停止样品采集，从而最大限度地减少因非样品液体体积导致的样品损失和稀释。对处理后的样品体积进行闭环计量，消除了每次更换输入样品前需重新编程这些参数的必要性。当样品体积有限时，该功能尤为重要，例如在许多临床样品的情况下。实时流量监测还有助于故障排查；若运行不佳（例如，某一出口发生堵塞），从相应的流量曲线中可立即察觉，如图5b所示。
为展示采用所述系统架构的声流控分离技术的灵活性和有效性，将纯化的DENV和GGV病毒液加入细胞悬液中，并通过微流控芯片进行处理以实现分离。 图7a 显示Raji细胞与病毒实现了良好分离，因为从芯片流出的Raji细胞中有97%被收集于LPO中，从而使DENV在SPO中高度富集。相比之下，DENV的分离效率较低，从芯片流出的DENV中仅有70%被收集于SPO中。这可能归因于分离通道转弯处引起的微弱对流混合，但更可能的原因是一部分DENV颗粒随Raji细胞迁移进入LPO。即使在低雷诺数条件下，细胞横向跨越流线迁移时也会带动部分周围液体随之移动。通过这一机制以及非特异性表面吸附作用，部分病毒颗粒被带入LPO。尽管如此，SPO中获得的DENV高度富集样本仍具有重要意义，例如在 从头合成 测序用于检测和鉴定病毒。
图7b 显示，在一次实验中，从芯片流出的Boa细胞仅有约70%被收集到LPO中，而Raji细胞的分离效率接近100%。两种细胞分离性能的差异可能归因于Boa细胞的平均尺寸较小或密度较低，相较于Raji细胞，导致其所受声学力更小。为验证或排除这些推测，必须准确测量悬浮状态下的Boa细胞（通常为贴壁生长）的尺寸、密度和形态，这有待进一步研究。在相同实验中，与DENV实验类似，大部分回收的GGV从SPO流出，表明病毒组分得到了富集。
本文展示的数据凸显了构建适用于多种生物样本处理的通用平台所面临的固有挑战。重要的是，生物相互作用可能开始与物理和机械效应发挥同等重要的作用。然而，这些初步实验也展示了利用该系统架构在临床和科研应用中进行样本处理的强大能力与广阔前景。作为一个结构稳健且经过充分表征的工程化系统，该平台具备探索和回答新科学问题的能力。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作在美国能源部合同 DE-AC52-07NA27344 项下由劳伦斯利弗莫尔国家实验室（Lawrence Livermore National Laboratory）主持开展，并部分得到劳伦斯利弗莫尔国家实验室实验室定向研究与发展（LDRD）计划项目 14-LW-077 的资助。作者感谢加利福尼亚大学旧金山分校（University of California, San Francisco）的 Michael Wilson、Mark Stenglein 和 Joe DeRisi 慷慨提供 GGV 和 Boa 细胞样本。EJF 感谢劳伦斯利弗莫尔国家实验室研究生学者计划（LLNL Lawrence Scholar Graduate Program）提供的支持。MS 感谢加利福尼亚大学校长办公室实验室费用研究计划（UC Office of the President Lab Fees Research Program）提供的支持。LLNL-JRNL-665235
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 步骤 1-3 所需材料：设备设计、制造与组装 | |||
| 双面抛光硅片 | Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA | 100 mm <100> 原始晶圆 | 1-20 欧姆·厘米，495 ± 25 µm 双面抛光 |
| 玻璃晶圆 | Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA | 100 mm × 0.5 mm 硼硅酸盐玻璃 | |
| 光刻胶 AZ 1518 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 1518 | 用于将晶圆粘附至空白晶圆以进行 DRIE 刻蚀的光刻胶 |
| 光刻胶 AZ 4620 | MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany | AZ 4620 | 用于定义流体通道和通孔掩模图案的光刻胶 |
| DRIE 等离子体刻蚀机 | STPS, Newport, NP, United Kingdom | Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP 系统 | |
| 晶圆键合机 | Electronic Visions Group, St.Florian am Inn, Austria | EVG 501 | |
| 划片机 | Kulicke & Soffa Industries, Singapore | K&S 982 | |
| 环氧树脂套件 | Epoxy Technology, Billerica, MA, USA | EPO-TEK 301 | 用于耦合压电元件与微流控芯片的环氧树脂 |
| PZT 压电陶瓷 | Piezo Systems, Woburn, MA, USA | PSI-5A4E | 37.5 × 10 × 0.5 mm |
| 28 AWG Kynar 绝缘实心导线 | Squires Electronics, Cornelius, OR, USA | UL1422 | |
| 双组分银环氧树脂 | MG Chemicals, Surrey, BC, Canada | 8331 | 用于将导线引线连接至 PZT 的导电粘合剂 |
| L-edit | Tanner EDA, Monrovia, CA, USA | Ledit v15.1 64 位版本 | 用于掩模布局的 CAD 软件 |
| 步骤 4 所需材料：声学聚焦性能表征 | |||
| 双泵系统 | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | PHD ULTRA 系列，703007 | |
| 5 ml 注射器 | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 309646 | |
| 鲁尔接头转螺纹端口适配器 | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-659 | 连接注射器与管路 |
| 接头 | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-623 | 连接外部系统与芯片接口至氟聚合物管路。 也可使用带网状结构的接头 |
| 卡套 1/4-28 平底 | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-200 | 与螺母配合使用，用于连接管路与注射器、流量传感器以及外部系统与芯片的硬件 |
| 螺母 1/4-28 平底 | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | P-202 | 与卡套配合使用，用于连接管路与注射器、流量传感器以及外部系统与芯片的硬件 |
| 外径 1/16" 氟聚合物管路 | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1912L | 用于连接注射泵与外部系统至芯片的接口。 在校准步骤中管路尺寸不关键（通常使用内径 0.01–0.03"，其他适用型号：1907L、1902L）。 |
| 小内径氟聚合物管路 | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1476-20 | 用作流量限制器：内径 0.006"，外径 1/16" FEP |
| PEEK 管路 | 连接芯片与氟聚合物管路。 | ||
| 冷却风扇 | Multicomp, Leeds, England | MC19663 | |
| 函数发生器 | Agilent, Santa Clara, CA, USA | 33220A | |
| 射频放大器 | ENI, Rochester, NY | 325 LA | 必须能够将 1–2 MHz 频率范围内小于 <1 V 的信号放大至 25 Vpp 以驱动压电元件。 |
| CCD 相机 | Photometrics, Tucscon, AZ, USA | CoolSnap HQ | |
| 倒置显微镜 | Zeiss, Oberkochen, Germany | Axiovert S100 | |
| FITC 滤光片组 | Chroma Tech, VT, USA | SP101 | |
| 物镜，10X | Zeiss, Oberkochen, Germany | ACHROPLAN | |
| 示波器 | Tektronix, Beaverton, OR, USA | TDS3014B | 用于监测射频放大器的电压输出 |
| MatLab | Mathworks, Natick, MA, USA | R2014a | |
| 用于集成 Photometrics 相机与 LabVIEW 的驱动接口软件 | R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA | SITK | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA | P9416 | |
| Dragon Green 荧光微球，5.76 或 7.32 µm | Bangs Laboratory, IN, USA | FS06F | |
| 步骤 5 所需附加材料：自动化分离 | |||
| 多通道阀门 | VICI, Houston, TX, USA | C25Z-3180EUHA | 当前配置需要 4 个阀门 |
| 流量传感器 | Sensirion, Westlake Village, CA, USA | SLI-1000 | |
| 氟聚合物管路，内径 0.01 和 0.03" | IDEX, Oak Harbor, WA, USA | 1902L 和 1912L | 推荐使用高纯度 PFA 材料 |
| 螺母 | VICI, Houston, TX, USA | ZN1PK-10 | 与卡套配合使用，用于连接管路与阀门。替代型号：MZN1PK-10、LZN1PK-10 |
| 卡套 | VICI, Houston, TX, USA | ZGF1PK-10 | 与螺母配合使用，用于连接管路与阀门。 |
| LabVIEW | National Instruments, Austin, TX, USA | LabVIEW 专业开发系统 | 实验室自动化软件 |
| PBS | Teknova, Hollister, CA, USA | P0200 | |
| Raji 细胞 | ATTC, Manassas, VA, USA | CCL86 | |
| Boa 细胞 | 由加州大学旧金山分校（UCSF）DeRisi 实验室惠赠 | ||
| GGV | 由加州大学旧金山分校（UCSF）DeRisi 实验室惠赠 | ||
| DENV | 由 LLNL 的 Jose Pena 惠赠 | ||
| Coulter 计数器 Z2 | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Z2 | |
| 血细胞计数板 | Fisher Scientific, Waltman, MA, USA | 0267151B |
参考文献
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重印与许可
