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方法文章

定制设计的基于激光的加热装置用于在磁共振成像引导下触发热敏脂质体释放顺铂

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DOI：

10.3791/53055

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2015年12月13日

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1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 2Department of Radiation Oncology, University of Toronto, 3Medical Biophysics, University of Toronto, 4Institute of Biomaterials & Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Techna Institute and Radiation Medicine Program, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 6STTARR Innovation Center, University Health Network, 7Ontario Cancer Institute, University Health Network

本文内容

摘要

已开发出一种与磁共振成像兼容的 定制化基于激光的加热装置，用于对皮下肿瘤进行局部加热，从而在肿瘤区域特异性地激活热敏脂质体中药物的释放。

摘要

脂质体已被用作靶向实体瘤的药物递送系统，利用增强的渗透性和滞留效应（EPR效应），显著降低全身毒性。然而，脂质体中包封药物释放不足限制了其临床疗效。为克服肿瘤部位药物生物利用度低的问题，已开发出温度敏感型脂质体，以实现药物的靶向部位特异性释放。本实验室设计并开发了一种热激活型热敏脂质体顺铂（CDDP）制剂，称为HTLC，可在实体瘤部位触发CDDP的释放。热激活递送 体内 在小鼠模型中，使用自行设计的基于激光的加热装置实现了这一目标，该装置在肿瘤部位产生适形加热模式，经磁共振测温（MRT）证实。在整个加热过程中，采用光纤温度监测设备实时测量温度，并通过调节激光功率在线调整热量输出。在磁共振（MR）影像引导下，通过共包载MR对比剂优化药物递送即， 将钆特醇（gadoteridol）与顺铂（CDDP）共同包载于热敏脂质体中，用于验证加热方案并评估药物在肿瘤部位的蓄积情况。加热方案包括在给予热敏脂质体（HTLC）前进行5分钟的预加热，以及注射后持续加热20分钟。该加热方案可有效释放包载药物，在加热的肿瘤组织中观察到相较于未加热肿瘤及肌肉组织最显著的磁共振信号变化。本研究证实了基于激光的加热装置在临床前热敏脂质体研发中的成功应用，并强调了采用磁共振成像指导加热方案验证以优化药物递送的重要性。

引言

实体瘤的病理生理学特性导致纳米级系统具有增强的通透性和滞留效应（EPR）。这一特性促使多种药物递送系统的开发，这些系统利用EPR效应靶向肿瘤组织，同时最大限度地减少全身性副作用1。脂质体递送技术已被广泛用于药物或成像探针的输送2。尽管与传统化疗相比，脂质体显著降低了全身毒性，但在临床疗效方面改善甚微3,4。研究表明，疗效受限的主要原因是药物无法从载体中有效释放4,5。因此，开发能够响应外部刺激而被激活并释放包载药物的脂质体已成为研究热点。多年来，热疗作为一种相对安全的治疗方式已被用于癌症患者6。因此，以热作为外部触发因素的热敏脂质体的研发成为一种合理的策略，在临床转化方面具有巨大潜力。事实上，含溶血磷脂的阿霉素热敏脂质体制剂（LTSL-DOX）目前已进入临床评估阶段7。

近期关于LTSL-DOX的临床数据显示，热疗的实施方案是影响患者治疗效果的关键因素8。在人体中，通常使用射频、微波、激光和超声换能器在肿瘤部位局部施加高温治疗9。在需要对皮下肿瘤进行加热的临床前研究中，最常采用的是加热导管10,11和水浴装置12,13。本文中，我们介绍一种使用定制激光加热装置对皮下肿瘤进行加热的新方法，该方法可实现对肿瘤体积更适形的加热。 该装置采用与磁共振兼容的材料制成，体积小巧，可置于小动物磁共振成像仪的孔腔内，从而在激光加热过程中实时监测组织温度的变化。

磁共振（MR）对比剂钆特醇（Gd-HP-DO3A）与顺铂（CDDP）共同包封于一种对热敏感的顺铂脂质体制剂（HTLC）中，形成Gd-HTLC，用于实时MR成像引导下的热激活药物释放监测与评估，并验证加热方案。我们的结果表明，基于激光的加热装置能够有效激活Gd-HTLC制剂中包封药物的释放，同时可通过MR成像进行实时监测。

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方案

1. 脂质体的制备

  1. 将脂质 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（MSPC 或 S-lyso-PC）和 N-(羰基-甲氧基聚乙二醇 2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（mPEG2000-DSPE）溶于氯仿中。例如，制备 10 ml HTLC 时，称取 314.4 mg DPPC、39.4 mg MSPC 和 83.9 mg mPEG2000-DSPE 置于棕色玻璃小瓶中，加入 2 ml 氯仿溶解，然后将小瓶置于 60 °C 水浴中加热 30 秒。
  2. 使用旋转蒸发仪除去氯仿。将所得脂质薄膜置于高真空条件下过夜（O/N）。
  3. 对于 10 ml HTLC 的制备，用 5 ml 0.1N Tris 缓冲液（pH 7.4）水合脂质薄膜 1 小时。同时，称取 162.4 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰甘油（DPPG）脂质和 100 mg CDDP 粉末，用含 30% 乙醇的 5 ml 0.1N Tris 缓冲液（pH 7.4）水合 1 小时。
  4. 对于 Gd-HTLC 制剂，称取相同量的 DPPG 脂质和 10 mg CDDP 粉末，然后用 2.5 ml Gd-HP-DO3A 溶液（279.3 mg/ml）与 2.5 ml 含 30% 乙醇的 0.1N Tris 缓冲液（pH 7.4）混合水合 1 小时。水合过程中，混合物必须始终置于棕色小瓶中，并在 70 °C 加热板上持续搅拌，每 10 分钟涡旋一次。
  5. 将脂质混合物与载药脂质混合物合并，再次水合 1 小时，每 15–20 分钟涡旋一次。
  6. 组装 10 ml 挤出器，配备两组 200 nm 聚碳酸酯滤膜。将挤出器的热控套筒连接至 70 °C 循环水浴，并将挤出器连接至压缩氮气罐。
  7. 水合完成后立即转移混合物至挤出器腔室。打开氮气流（设定压力为 200 psi），使脂质体通过滤膜挤出，收集脂质体至 50 ml 离心管中。在整个挤出过程中，始终保持离心管置于 70 °C 热水浴中。重复此过程 5 次。
  8. 拆卸挤出器，更换为两组 100 nm 聚碳酸酯滤膜，重新组装挤出器并将压力调至 400 psi。重复第 5 步操作，但将脂质体挤出 10 次。将最终挤出的样品收集至 15 ml 离心管中。
  9. 将脂质体冷却至室温（RT），在 1,000 × g 条件下离心 3 分钟，以沉淀不溶性 CDDP。
  10. 在无菌条件下，使用截留分子量为 15,000 的透析袋，将脂质体在 0.9% 生理盐水中透析过夜（O/N）。
  11. 取 10 µl 脂质体稀释于 990 µl 蒸馏水中，采用动态光散射法测定 HTLC 和 Gd-HTLC 的粒径分布。每样本进行 3 次测量，每次测量运行 10 次。
  12. 取 40 µl 脂质体稀释于 3,960 µl 蒸馏水中。配制 5–6 种铂和钆的标准溶液，浓度范围为 0.1 至 20 µg/ml。使用电感耦合等离子体-原子发射光谱仪（ICP-AES）在三个不同波长下测定铂和钆的浓度。每个波长下进行 3 次测量以获得平均结果。
  13. 使用差示扫描量热仪（DSC）测定 HTLC 脂质体制剂的凝胶-液晶相变温度（Tm）。将 5–10 mg HTLC 样品装入 DSC 样品盘，以空盘作为参比。升温速率为 5 °C/min，温度范围从 0 °C 升至 60 °C。
  14. 用铝箔包裹脂质体以避光，并在 4 °C 下保存。

2. 体外 脂质体释放

  1. 准备离心柱。
    1. 将50 g凝胶过滤珠在室温下用400 ml 0.9%生理盐水孵育3–4小时。取一团玻璃棉，用0.9%生理盐水润湿后卷成筒状，放入1 ml注射器的尖端。压紧玻璃棉，使其占据注射器约0.05–0.1 ml的体积。使用玻璃移液管缓慢加入约1 ml凝胶过滤介质至注射器中。
    2. 将注射器放入15 ml离心管中，以1,000 × g离心3分钟。取出离心柱，放入另一支15 ml离心管中。
  2. 将400 µl HTLC或Gd-HTLC样品分装至8个1-dram玻璃小瓶中，置于温度控制的水浴中，在37 °C或42 °C下孵育。在每个时间点取出一个玻璃小瓶（即， 5、15、30 和 60 分钟）后立即置于冰上。
  3. 向已准备好的离心柱中加入 100 µl 0.9% 生理盐水，然后在孵育前（对照）或水浴孵育后，向离心柱中加入 100 µl HTLC 或 Gd-HTLC。在 1,000 × g 条件下离心 3 分钟。将注射器从收集管中移除，并将管中溶液稀释后用于 ICP-AES 分析。

3. 宫颈肿瘤皮下异种移植的植入

  1. 所有动物实验均按照大学健康网络（University Health Network, UHN）动物护理委员会批准的动物使用方案进行。
  2. 所有动物实验均应在生物安全柜（BSC）中进行。任何手术前均需对所有手术器械进行高压灭菌。每次手术后，先用70%乙醇擦拭手术器械，再使用热珠灭菌器进行二次灭菌。
  3. 实施安乐死时，将动物置于隔热的CO2舱内，随后进行颈椎脱位。
  4. 使用100%氧气进行全身麻醉时，诱导麻醉采用5%异氟烷，维持麻醉采用2%异氟烷。为确保麻醉深度，可用镊子按压足垫掌面以观察动物反应。麻醉期间应使用眼用润滑剂防止角膜干燥。
  5. 对接受过手术的动物，应将其单独置于清洁笼具中，避免与其他动物同笼。需持续监测，直至其意识充分恢复。
  6. 在补充有10%胎牛血清（FBS）和抗生素的α-最低必需培养基（α-MEM）中培养ME-180细胞。
  7. 收集细胞，并在接种前将其保存于完全培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  8. 将ME-180细胞（人宫颈癌细胞）接种至每只供体小鼠，使其在肌肉内（i.m.）形成肿瘤。
    注：选择肌肉内接种位点是为了确保肿瘤具有良好的血管化。从小型自繁设施购买雌性SCID小鼠（6-8周龄，体重约20 g）。
    1. 对雌性SCID小鼠进行麻醉，使用27 G针头将1 × 106个ME-180细胞注射至后肢腓肠肌内。
    2. 使用游标卡尺测量肿瘤大小，直至肿瘤最长径达到9-12 mm。若肿瘤超过12 mm，或肿瘤体积影响动物正常行为、行走能力、摄食及饮水，则终止实验。
  9. 将供体小鼠的肿瘤组织块移植至受体小鼠。
    1. 使用5%异氟烷麻醉供体小鼠，在麻醉状态下实施颈椎脱位安乐死。取出供体小鼠的肿瘤组织，并将其切割为2-3 mm3的立方体碎片。
    2. 使用5%异氟烷麻醉受体小鼠。术前皮下注射100 μl浓度为0.5 mg/ml的美洛昔康。依次使用碘伏外科擦洗液、70%乙醇和碘溶液对剃毛区域皮肤进行消毒。剃除受体小鼠左后肢的毛发，在皮肤层面做切口，通过切口将一块供体肿瘤组织皮下植入，然后使用1-2个伤口夹闭合切口。
    3. 在移植后3-5天拆除伤口夹。皮下肿瘤模型是使用基于激光加热装置的前提要求。
    4. 在实施加热治疗前，让肿瘤生长2-3周。

4. 一种共形激光递送照明器的设计、组装与校准 在体 内 加热

  1. 使用763 nm半导体激光器，通过光纤将其与贴合式照明器连接，实现组织加热。
    1. 照明器可为异种移植肿瘤提供均匀的浅表激光照射。它由一块尺寸为30 × 20 × 17 mm的高反射材料构成，内部包含三个相连的光积分腔球体，中间一个腔体（直径16 mm），两侧各有一个小腔体（长度16 mm，直径5 mm）。图1).
    2. 为了使光线从一个腔室进入另一个腔室，在两个较小的外侧腔室与较大的中间腔室之间开设了两个直径为5 mm的小孔。激光通过一根400 µm的截断光纤导入外侧腔室，该光纤连接激光器，并经由一个直径为600 µm的孔进入腔室。
    3. 由于光与腔壁的相互作用特性，进入其中一个小型腔室的光在空间上被均质化后，通过内部通路进入较大的腔室，并在其中进一步实现空间均质化。随后，光从中间腔室直径为10 mm的通口射出。
  2. 使用经NIST校准的50 mm积分球测量输出功率，以相对于激光功率设置校准照明光源的光输出。
    1. 使用基于肿瘤简化几何结构的蒙特卡罗模拟计算肿瘤内的光分布。采用商业计算软件包编写自定义算法生成蒙特卡罗代码，并以Jacques开发的多层组织中光传输蒙特卡罗建模标准代码为基础。 等14.
    2. 将肿瘤建模为位于平坦皮肤表面的一个半球体，其直径与皮肤表面处的平均肿瘤尺寸一致，为7 mm，高度为5 mm。通过在整个暴露的半球面上随机发射光子并指向球心，模拟对表面的均匀照射。
    3. 利用包括吸收在内的光学特性，µa = 0.025 mm-1，散射，µs = 10 mm-1，各向异性因子 g = 0.9，折射率 n = 1.4。计算中使用一百万个光子。
    4. 在进行任何操作之前完成这些测量 体内 加热实验，初始校准后不再进行任何修改。

5. 使用定制设计的激光腔装置对肿瘤进行保形加热

  1. 将激光光纤的一端连接至激光设备，另一端连接至照明器。
  2. 使用 5% 异氟烷对动物进行麻醉。将 27 G 注射导管插入小鼠尾侧静脉，将 22 G 导管插入肿瘤中心。将光纤温度探针置入中空导管内，以监测温度变化。
  3. 用照明器完全覆盖整个肿瘤（图 2）。首先将功率设定为 0.8–1 W。开启激光并等待温度上升，通过手动调节激光功率（0.1–0.8 W 范围内）使肿瘤温度维持在 42 °C。

6. 通过磁共振测温（MRT）评估温度分布

  1. 利用基于激光的加热装置，结合7特斯拉临床前磁共振成像系统15上的质子共振频率偏移（PRF-shift）磁共振测温法（MRT），并结合光纤温度探针测量，测定加热肿瘤区域的温度分布。
  2. 使用二维快速低角度激发（2D-FLASH）脉冲序列（回波时间4.5毫秒；重复时间156.25毫秒），在光纤温度探针所在层面的单一切片上，以平面内分辨率312 × 312 µm、层厚2 mm，每10秒采集一次测温图像。

7. 试剂释放的磁共振监测

  1. 在注射 Gd-HTLC 前及注射后 20 分钟，进行 T1-加权成像。
  2. 采用第 3 节所述方法，在一只雌性 SCID 小鼠的双侧后肢各植入一个肿瘤。在注射 Gd-HTLC 前，对左侧后肢肿瘤进行 5 分钟 42 °C 预加热，Gd-HTLC 注射剂量为 66.3 mg/kg Gd-HP-DO3A 和 1.4 mg/kg CDDP，注射后继续加热 20 分钟。在加热过程中完成注射。右侧后肢肿瘤作为未加热对照。
  3. 采集动态 MR 图像（视野 36 × 20 mm，面内分辨率 200 × 200 µm，层厚 2 mm；MR 序列参数），从注射前 30 秒开始，以每 12 秒一次的频率，持续监测注射 Gd-HTLC 后 20 分钟内 Gd-HP-DO3A 的释放情况。
  4. 勾画肿瘤（加热组与未加热组）及肌肉区域的体积，计算每个勾画体积内所有体素的平均 MR 信号强度。

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结果

HTLC 脂质体采用常规方法制备，包括脂质膜形成、水化、挤出和透析。在涉及 CDDP 的操作步骤中，应特别注意避免 CDDP 接触任何铝材质，否则会因形成黑色沉淀而导致 CDDP 失活。HTLC 的示意图见图3。HTLC 的理化性质已在近期发表于《控制释放杂志》（Journal of Controlled Release）的一篇论文中进行了总结16。Gd-HTLC 制剂中钆和铂的浓度分别为 1.87±0.28 mg/ml 和 0.10±0.02 mg/ml。

基于激光加热装置的照明系统采用三个小型相连腔室，可在直径为10 mm的出口处提供均匀的光照分布（±15%）。根据激光的功率设置，使用经校准的积分球测量得到的功率范围为0.5至1.7 W/cm2。结果以肿瘤横截面图形式显示在图4中。假设总功率为1 W，则肿瘤内任意位置的最大辐照度为70 mW/cm2。与肿瘤表面下方的峰值辐照度相比，皮肤表面处的激光功率下降至原来的二分之一。

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讨论

脂质体最早于20世纪60年代被开发作为药物递送载体，可将其内部水相容积中携带亲水性药物，同时将疏水性药物包载于其脂质双分子层中2。除了用于治疗用途外，当脂质体标记放射性核素或装载成像对比剂时，也已被探索用于诊断应用17。近年来，诊疗一体化（theranostics）及治疗-诊断配对策略受到关注，为影像引导下的患者分层和药物递送提供了新机遇17,18。本研究基于影像引导药物递送的概念，利用自行设计的基于激光的加热装置，在磁共振（MR）引导下评估热敏脂质体的触发式药物释放效果。

如上所述，通常使用水浴或加热导管来加热皮下肿瘤。水浴法需要将整个肢体浸入热水中，导致药物不仅在肿瘤部位释放，还会在整个肢体中非特异性释放。使用加热导管则需将一根18 G导管置入肿瘤中心，且研究表明，为达到热稳态，需要相对较长时间的加热（15分钟）11。

在本研究中，新设计的基于激光的加热装置能够以共形方式向肿瘤区域传递热量，这一点已通过基于磁共振的温度分布图评估得到证实...

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致谢

本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）向 C.A. 和 D.A.J. 提供的运营资助支持。作者感谢加拿大创新基金会和玛格丽特公主癌症基金会为资助STTARR研究设施所做的贡献，该设施支持了本研究中的成像与治疗研究部分。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
旋转蒸发仪Heidolph Instruments GmbH & Co.KGLaborota 4000
高压挤出器Northern Lipids Inc.T.00110 ml 热压筒
加热循环器VWR International LLC.11305连接至挤出器
聚碳酸酯膜滤器Whatman110605;110606
差示扫描量热仪 (DSC)TA InstrumentsQ100
电感耦合等离子体原子发射光谱仪 (ICP-AES)PerkinElmerOptima 7300DV
Zetasizer 粒度电位仪Malvern Instruments Ltd.Nano-ZS
细胞培养箱NuAire Inc.NU-5800
自动夹伤口夹施加器Becton Dickinson427630
自动夹伤口夹移除器Becton Dickinson427637
伤口夹Becton Dickinson4276319 mm
763 nm 激光设备BiolitecCeralas CD 403 激光器
激光探头Thorlabs Inc.FT400EMT带 SMA 和平切连接器
光谱漫反射标准板（照明器）Labsphere Inc.FAST-SL-5CMX5CM
CSTM-SL-5CMX5CM
7 特斯拉临床前磁共振 (MR) 成像系统Bruker CorporationBiospec 70/30
光纤温度传感器LumaSense Technologies Inc.Luxtron FOT Lab Kit
积分球Newport Corporation819C
光功率计Newport Corporation1830-R

参考文献

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