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用于测量脑组织中细胞外离子信号的双管微电极与同心微电极

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DOI：

10.3791/53058

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2015年9月5日

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1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Departments of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine

本文内容

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摘要

我们演示了两种用于测量脑组织中离子浓度的离子选择性微电极（双管型和同心型）的制备、校准及其特性。随后在小鼠海马脑片制备中应用这些电极，证明了兴奋性活动会同时改变细胞外钾离子和钠离子浓度。

摘要

大脑中的电活动伴随着跨膜的显著离子流动，导致细胞外环境中所有主要离子浓度发生复杂变化。由于这些离子浓度变化具有重要的功能意义，因此通常需要对其进行定量测定，以理解神经网络在生理和病理生理条件下的功能与功能障碍。在本研究中，我们展示了双管离子选择性微电极的制备与校准方法，此类电极已被证明是脑组织中此类测量的优秀工具。此外，本文还介绍了所谓的“同心式”离子选择性微电极，其由于结构设计不同，能够实现对快速离子变化更优的时间分辨率。随后，我们展示了这些电极在小鼠海马急性脑片标本中的应用。利用双管钾离子选择性微电极，演示了细胞外钾离子浓度（[K+]o）在施加谷氨酸受体激动剂或出现癫痫样活动时的变化。此外，我们还展示了钠离子敏感的双管和同心式电极的响应特性，并比较了它们在浴式或加压给药诱导下对细胞外钠离子浓度（[Na+]o）变化的检测能力。这些测量结果表明，尽管响应幅度相似，但与双管设计相比，同心式钠离子微电极具有更优的信噪比和响应速度。总体而言，所展示的方法可轻松推广至其他离子种类（包括pH或钙离子）的测量，并适用于其他实验标本。

引言

大脑中的电信号依赖于离子跨质膜的流动。主要离子进出细胞外空间的过程不仅通过电压门控离子通道介导，还通过突触后离子型受体以及离子转运体实现。因此，神经元活动伴随着细胞外所有主要离子浓度的复杂变化1。例如，兴奋性活动期间钠离子流入神经元已被证实会导致细胞外钠离子浓度（[Na+]o）下降2。细胞外钙离子浓度同样如此，因为钙离子会快速进入突触前和突触后结构3。与此同时，钾离子则朝相反方向移动，导致细胞外钾离子浓度（[K+]o）升高至低毫摩尔（mM）范围4,5。突触活动还会引起细胞外pH值的变化，部分可通过伴随发生的胶质细胞膜离子流动得到缓解，而这些流动会改变细胞内胶质细胞的pH值6,7。这些与活动相关的细胞外离子浓度变化具有重要的功能影响。例如，即使[ K+]o的轻微升高也会使神经元和胶质细胞去极化，从而改变神经元的兴奋性，且存在多种机制用于清除过量的钾离子8。这些机制若失效，可能导致神经元出现癫痫样放电或如扩散性抑制等现象1。

由于细胞外离子浓度具有至关重要的作用，因此在生理和病理生理条件下，通常需要对其进行定量测定，以理解神经网络的功能与功能障碍。几十年来，双管离子选择性微电极已被证明是用于脑组织中此类测量的优秀工具9。对于许多离子，已有高度特异、对其他离子交叉反应性低的传感器可供使用。除了经典的双管电极外，近年来还引入了所谓的同轴电极。后者具有更优的时间分辨率，但在制备上需要更多的时间和精力10。

接下来，我们将介绍这两种离子选择性微电极的制备与校准方法。随后展示如何在脑片标本中使用这些电极，通过不同刺激范式（包括药物的浴应用和压力施加）诱发兴奋性活动，进而测量细胞外钾离子浓度 [K+]o 或钠离子浓度 [Na+]o 的变化。

方案

本研究严格遵循德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学的机构指南以及欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）。所有实验均已向德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学动物护理与使用机构的动物福利办公室通报并获得批准（机构许可编号：O52/05）。根据德国动物福利法（Tierschutzgesetz，第4条和第7条），死后移取脑组织无需额外的正式审批。

1. 双巴尔离子选择性微电极的制备

  1. 准备两根带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管：一根长度为7.5 cm、外径为1.5 mm，用于离子敏感电极管；另一根长度为6.5 cm、外径为1.0 mm，用于后续的参比电极管。
  2. 将毛细管在丙酮中清洗12小时，然后用无水乙醇反复冲洗数次，并使其自然干燥。电极可存放于干燥器中保存。
  3. 使用双组分胶水或一小条铝箔将长、短毛细管在两端固定在一起。将双管毛细管置于炉中，在60 °C下加热1小时，以加速固化过程。此后将电极存放在干燥器中。
  4. 将双毛细管置于垂直拉制仪中，并使用可旋转卡盘进行居中固定。轻轻加热线圈，直至玻璃软化至可将可旋转卡盘水平旋转180°。在此过程中，需在卡盘下方放置挡块以防止毛细管被拉长。
  5. 冷却后，移除机械断裂部分，并应用第二次加热程序以拉制毛细管，得到两根尖端锋利的双管毛细管（图 1）。其中一根双毛细管的尖端直径应接近1 µm。

双管和同心微电极示意图；传感器、参比电极标注；显微镜图像。
图 1. 离子选择性微电极的结构。（A）双管微电极的照片。为便于说明和更清晰地显示，参考管内的液体被染色。（B）同心微电极及其相应参比电极的照片。同心微电极的尖端在其左侧被放大显示。在（A）和（B）中，微电极尖端内离子传感器所占空间以着色方式标出。底部示意图展示了两种电极类型的尖端结构排列。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 若无带可旋转卡盘的垂直拉制仪，可使用水平拉制仪和θ玻璃制备双管离子选择性微电极。
    1. 具体操作为：将θ玻璃（外径1.5 mm，长度7.5 cm）拉制成两个电极，每个电极具有两个管腔。标记其中一个管腔作为未来的参比管腔。另一个管腔则参照下述方法进行硅烷化处理，作为未来的离子选择性管腔。
      注意：尽管θ玻璃双管电极的制备远比绞合式双管电极简便，但其两个管腔之间更易发生交叉干扰，因为两者之间最尖端的薄玻璃隔层往往具有多孔性。
      注意：由于传感器混合液（见下文）具有疏水性，后续用于离子敏感的管腔内表面也必须通过称为硅烷化的过程使其具备疏水性。此过程使用六甲基二硅氮烷（HMDS）进行（图 2），具体方法如下一步所述。

硅烷化过程示意图及玻璃处理装置；HMDS反应与实验装置。
图2. 移液管的硅烷化处理。 (A) 六甲基二硅氮烷（HMDS）与玻璃内表面的Si-OH基团发生反应，使其具有疏水性。(B) 左侧照片显示了完整的硅烷化装置。一个广口瓶内装有HMDS，置于设定为40 °C的加热板上。广口瓶上方安装有一个支架（PH），用于承载毛细管（Cap）。右侧照片为移液管支架（PH）及其所承载毛细管（Cap）的放大图。(C) 定制移液管支架（PH）的侧面示意图，适用于双通道（左侧）或同心式（右侧）毛细管（Cap），图中所示为安装在广口瓶上的状态。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在拉制电极前，将约 20 ml HMDS 加入一个广口瓶中。注意：HMDS 仅可在通风橱内使用，其蒸气对健康有害！盖紧瓶盖后将其置于预设为 40 °C 的加热板上。同时将置于通风橱内的炉子预热至 200 °C。
  2. 用蒸馏水将参比毛细管填充至尖端，以防止其在后续步骤中被硅烷化。
  3. 将双通道毛细管尖端朝上放置于特制的定制支架上（图 2B、2C）。钝端开口必须自由穿过支架底部（图 2C，左侧）。随后将该支架置于盛有预热 HMDS 的广口瓶上，持续 70 分钟。
    注意：确保 HMDS 蒸气可自由通过毛细管。一次硅烷化过程中，20 ml HMDS 不会完全蒸发，因此该瓶子可重复使用多次。
  4. 之后，将毛细管转移至金属支架，并放入预热的炉中加热两小时，以干燥两个通道。
  5. 硅烷化完成后，应保持毛细管干燥直至使用。尽管前述过程总共需约 3.5 小时，但电极现可于干燥器中保存数周。
  6. 在实验当天，通过向硅烷化通道的尖端填充 1–2 µl 离子选择性传感器来制备离子选择性电极（图 1A）。对于钾敏感微电极，使用缬氨霉素作为载体；对于钠敏感微电极，则使用 ETH 157 作为载体。
  7. 注意离子选择性传感器较为黏稠，可能导致尖端填充困难。
  8. 用 HEPES 缓冲盐溶液填充参比通道（见下文）。
    注意：虽然也可使用其他更简单的等渗盐溶液，但我们倾向于使用成分与灌流液（ACSF，见 3.6 节）基本相似的盐溶液，因为在实验过程中该溶液可能泄漏并渗入组织。因此，必须确保该盐溶液中待测离子的浓度不高于所用 ACSF 中的浓度。
  9. 用含有高浓度待测离子的盐溶液反向填充传感器。即，对钠敏感微电极使用 100 mM NaCl 盐溶液，对钾敏感微电极使用 100 mM KCl 盐溶液进行反向填充。操作过程中务必避免引入额外的气泡。
  10. 若硅烷化成功且传感器填充良好，应可观察到传感器表面与反向填充液之间形成清晰可见的凹面（图 1A）。否则，传感器可能已从毛细管壁回缩，导致尖端未被填充，此类电极将无法正常工作。
  11. 将氯化银丝插入两个通道中（注意不要触碰传感器），并用牙科蜡密封每个通道（图 1A）。

2. 同心离子选择性微电极的制备

  1. 外管使用带细丝的薄壁玻璃毛细管（外径 2.0 mm），长度为 7.5 cm；内管使用带细丝的薄壁毛细管，外径为 1.2 mm，长度为 10 cm。
  2. 将毛细管在丙酮中清洗 12 小时，然后用无水乙醇反复冲洗数次，并使其自然干燥。电极现在可存放于干燥器中。
  3. 将约 20 ml HMDS 加入广口瓶中。注意！HMDS 仅可在通风橱内使用，其蒸气对健康有害。盖紧瓶盖后置于预设温度为 40 °C 的加热板上。同时将置于通风橱内的炉子预热至 200 °C。
  4. 将 2.0 mm 毛细管插入水平拉制仪中，拉制出具有短锥形末端、尖端直径约为 4 µm 的毛细管（图 1B）。
  5. 将拉制好的 2.0 mm 毛细管尖端朝上插入特制支架（图 2B、图 2C），使其钝端开口对准广口瓶腔体（图 2C，右侧）。随后将该支架置于盛有预热 HMDS 的广口瓶上，处理 70 分钟。确保 HMDS 蒸气能流经所有毛细管。
  6. 处理完毕后，将毛细管转移至金属支架，并放入预热炉中加热两小时。
  7. 硅烷化处理后，毛细管应保持干燥直至使用。前述步骤总共约需 3.5 小时，电极现可于干燥器中保存数周。
  8. 使用前，将少量传感器溶液（0.2 µl）注入硅烷化处理后的毛细管中（图 1B）。
  9. 制备内管时，将小直径毛细管插入拉制仪中拉制，得到两根具有长锥形末端和尖锐尖端的毛细管（图 1B）。分别用 100 mM NaCl（钠离子敏感微电极）或 100 mM KCl（钾离子敏感微电极）生理盐水填充。
  10. 将装有传感器和装有生理盐水的毛细管并排置于由盖玻片制成的自制塞子上。将较细的毛细管轻轻插入较粗的毛细管中一小段距离。
  11. 用 modeling clay 将毛细管固定在另一张盖玻片上，转移至显微镜载物台上，使用 100 倍放大倍率进行观察。借助安装在显微操作器上的玻璃棒，并通过调节显微镜载物台的微调旋钮，缓慢将外管推过内管，直至两管尖端间距约为 5 µm（图 1B）。
  12. 使用牙科蜡将外管的开口端固定在内管上。也可用少量氰基丙烯酸酯胶水（Crazy Glue）代替牙科蜡。
    注意：加入一小滴水可使胶水聚合，从而将电极固定到位。将一根氯化银丝插入内管中，并用牙科蜡密封（图 1B）。
  13. 制备参比电极时，取一根长度为 7.5 cm、带细丝、外径为 1.5 mm 的毛细管，使用垂直拉制仪进行拉制。确保拉出的尖端相对较长但不过于尖锐（尖端直径约 1 µm）。
  14. 弃去上部移液管，打开下部卡盘，将下部移液管向上提升约 5 mm。再次关闭卡盘，并将其提升至下部电极尖端位于加热线圈上方约 5 mm 处。加热线圈后，用镊子将尖端向一侧弯曲约 45°。再将移液管下移约 1–2 mm，再次弯曲约 -45°，使尖端重新与主轴平行（图 1B）。此操作旨在使参比电极尖端能够紧邻同心电极放置。
  15. 用 HEPES 缓冲生理盐水（见下文）填充参比管，插入氯化银丝，并用牙科蜡密封管口（图 1B）。

3. 盐溶液

  1. 制备用于填充钾敏感电极的生理盐水（参见1.15），成分为100 mM KCl。用于填充钠敏感电极的生理盐水成分为100 mM NaCl。
  2. 用于回填参考管的生理盐水（HEPES缓冲盐溶液，见1.16）组成为（单位：mM）：125 NaCl，2.5 KCl，2 CaCl₂2，2 MgSO₄4，1.25 NaH2PO4，以及25 HEPES，用NaOH调节至pH 7.4。
  3. 用于校准钾离子敏感电极的生理盐水由25 mM HEPES和总共150 mM的NaCl与KCl组成，用NMDG-OH（N-甲基-D-葡萄糖胺）调节pH至7.4。本实验中，使用含1、2、4或10 mM KCl的生理盐水进行校准；ACSF含有2.5 mM KCl图5).
  4. 按如下方法配制用于钠离子敏感电极校准的生理盐水（单位：mM）：25 HEPES、3 KCl、NaCl 与 NMDG-Cl 总浓度为 160，用 NMDG-OH 调节 pH 至 7.4。使用含 NaCl 分别为 70、100、130 或 160 mM 的生理盐水进行校准；ACSF 中含 152 mM NaCl图6).
  5. 为测定传感器与其他离子的交叉反应性， 例如pH，配制额外的校准盐溶液，其中离子浓度固定但pH值不同。
    注意：虽然本研究未展示该操作步骤，但请参考先前针对此问题开展的工作（例如 11,12).
  6. 在含有以下成分的生理盐水中制备急性脑组织切片（单位：mM）：125 NaCl，2.5 KCl，0.5 CaCl₂，1.25 NaH₂PO₄，26 NaHCO₃，25 葡萄糖，2 MgCl₂2，6 MgCl2，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3，以及20葡萄糖，用95% O₂充气2 和5% CO2，pH 值为 7.4。
  7. 在人工脑脊液（ACSF）中进行脑片实验，ACSF 的成分为（单位：mM）：125 NaCl，2.5 KCl，2 CaCl2，1 MgCl2，1.25 NaH2PO4，26 NaHCO₃3，以及20葡萄糖，用95% O₂充气2 和5% CO2，使pH值维持在7.4。
  8. 为刺激神经元和胶质细胞，配制含有0.2、0.3、0.4或0.5 mM谷氨酸或10 mM L-天冬氨酸的ACSF溶液。用于压力施加时，将10 mM谷氨酸溶解于HEPES缓冲盐溶液中。
  9. 准备用于压力施加的移液管。将带细丝的薄壁玻璃毛细管（外径 2.0 mm，长度 7.5 cm）插入水平拉制仪中，拉制至尖端直径约为 ~ 1 µM.
  10. 为诱导癫痫样活动，制备无镁人工脑脊液（ACSF） 10 µM 荷包牡丹碱甲碘化物
  11. 为了抑制动作电位的产生，用蒸馏水配制10 mM的河豚毒素（TTX）储备液。实验过程中，将TTX直接加入人工脑脊液（ACSF）中，使其终浓度达到 0.5 µM.
  12. 为防止AMPA受体激活，用二甲基亚砜（DMSO）配制50 mM的氰基硝基喹喔啉二酮（CNQX）储备液。实验过程中，将其直接加入人工脑脊液（ACSF）中，使终浓度达到 100 µM.
  13. 为阻断NMDA受体的激活，将氨基磷酰戊酸（APV）溶于70 mM NaHCO₃中，配制成50 mM的储存液。3在实验过程中，直接加入ACSF中，使其终浓度达到 100 µM.

4. 离子选择性微电极的校准

  1. 每次实验前后直接校准离子选择性微电极。
  2. 将电极连接至显微操作器，并插入灌流人工脑脊液（ACSF）的实验槽中，置于体视显微镜下（图3，4）。将参比电极置于前置槽内（图4A，B）。开启浴槽灌流，确保流速约为 2 ml/min。

用于电生理数据分析的压力装置显微镜系统，带法拉第笼。
图 3. 实验工作空间。 记录装置包括一个防震台，台上放置了带有实验浴槽、显微操作器和配备高质量光学系统的体视显微镜的x/y平移载物台。体视显微镜还配有CCD相机，用于记录图像。此外，使用一个压力施加装置进行局部药物应用。记录电极通过前置放大器连接至差分放大器。数字化数据（A/D转换器）由计算机采集。浴槽灌流由一个蠕动微泵（未显示）实现。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 打开模数转换器、差分放大器和计算机，启动记录软件（图3，图4）。由于离子敏感微电极管的电阻非常高（10–20 GΩ；见下文），应使用具有高输入阻抗（Rin = 10 TΩ）和小偏置电流（Ibias = 50 fA – 1 pA）的专用电位计放大器。

用于测量离子敏感通道的电子装置与实验阶段示意图。
图 4. 实验装置的电子与空间设计。（A）记录装置的示意图。双巴雷尔微电极（蓝色）和同心微电极（红色）的尖端置于盛有生理盐水的实验浴槽中。图中示意性地显示了浴槽参考电极。离子选择性巴雷尔检测到的电位（V1）由电场电位（Vref）和离子电位（Vion）组成，而参考巴雷尔（V2）仅检测到 Vref。为了分离出 Vion，通过差分放大器（D.A.）从 V1 中减去 Vref。（B）放置同心微电极后的实验台拓扑结构。实验台中心为容纳脑片样本的实验浴槽。为使浴槽接地，参考电极浸入前置腔室中，该腔室同时也容纳灌流入口。实验台本身通过独立的接地连接器接地。同心微电极及其参考电极由独立的移液器支架固定，支架由显微操作器驱动。微电极和参考电极在电学上连接至放大器的前置放大头段。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将氯化银导线连接至差分放大器探头端相应的输入端（图 4）。测定电极电阻，确保参比毛细管的电阻在 30–100 MΩ 之间，离子敏感毛细管的电阻在 10–20 GΩ 之间。
  2. 将电压信号调零并开始记录。
  3. 注意，离子选择性毛细管检测到的电位（V1）由电场电位（Vref）和离子电位（Vion）组成，而参比毛细管（V2）仅检测到 Vref。为了分离出 Vion，通过差分放大器（D.A.）从 V1 中减去 Vref（图 4A）。
  4. 获得稳定的基线后，切换至含有待测离子已知浓度的标准盐溶液进行校准。
    注意：图 5A 显示了一个双通道钾离子敏感微电极的校准结果。图 6A 显示了双通道和同心型钠离子（Na+）敏感微电极的校准结果。尽管本文未描述具体操作步骤，但需注意在使用特定离子载体前，必须测试其他离子可能产生的干扰（另见 3.4 节）。

Double-barreled ion concentration graph and voltage plot; data analysis of potassium (K+) response.
图5. 双管钾选择性微电极的校准。 (A参考电极管电压的变化（V）参考文献) 和 K+-电位（V）K⁺) 以响应浴液中 K 的变化+ 浓度（[K+]b）如所示。B) 半对数图表示的[K+]b 与 V 对照K⁺数据的线性图显示斜率约为 56 mV。为便于说明，曲线经Sawitzky-Golay滤波器平滑处理（宽度为20）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 测定离子选择性微电极尖端对已知离子浓度变化的电压响应。将数据绘制在单对数坐标图中（图 5B、图 6B），并确定其斜率。理想传感器的响应符合能斯特方程所描述的关系（见例如 13）：

电化学电位 V 的能斯特方程，以含对数的公式形式表示。
V：测得的电极电位；
V0：标准电极电位，例如在 298.15 K 温度和 101.325 kPa（绝对）压力下的 AgCl 电极
R：气体常数（8.314 焦耳/开尔文·摩尔）
T：绝对温度（单位为开尔文）
z：离子电荷（钾和钠为 +1）
F：法拉第常数（96.500 库仑）
c’：细胞外离子浓度
c’’：细胞内离子浓度

出于实际应用目的，自然对数被转换为能斯特斜率 s，该斜率适用于特定离子和温度：

静态平衡方程 V=V₀+s×log(c'/c'')，数学公式。
注意：对于钾离子和钠离子电极，传感器的理想电压响应在室温下应表现出约 -58 mV 的线性斜率。该值存在一定偏差是可以接受的（图 5B、图 6B）。然而，关键要求是在实验前后，同一电极的响应特性不得发生显著变化（变化不超过10%，见下文）。

Electrophysiology graph; Sodium ion concentration vs. voltage; Ion exchange; Double-barreled electrode.
图6. 钠离子选择性微电极的校准及双管电极与同心电极的比较 (A上图：参考桶电极电压的变化（V）参考文献双巴雷尔电极（黑色虚线）与同心电极（灰色实线）在浴液钠离子浓度变化时的反应+ 浓度（[Na+]b）如图所示。注意两个电极的电压响应几乎完全相同。底部图迹：Na电压的变化+-电位（V）Na+双电极（黑色迹线）与同心电极（灰色迹线）在响应[Na浓度变化时的记录+]b. (B) 半对数图表示的[Na+]b 与V相比Na+ 两个电极的数据线性拟合图均显示出约48 mV的斜率。 (C) V的反应Na+ 双巴雷尔电极（黑色迹线）与同心电极（灰色迹线）对钠离子浓度快速变化的响应+]b 从 152 mM 降至 70 mM。请注意，同心电极的响应时间明显更快。为便于说明，图中曲线经Savitzky-Golay滤波器平滑处理（宽度为20）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 确定电极的响应时间，该时间取决于电极尖端的直径、尖端的形状以及电极尖端传感器相的厚度。
    注意：在本实验设置中，通过快速切换不同灌注盐溶液（在电极尖端处交换在500毫秒内完成），当钠浓度从152 mM变为70 mM时，双管钠敏感微电极在9.7 ± 4.5秒内达到稳定电位+]（n=6）。在同一条件下，同心钠敏感微电极在仅0.8 ± 0.3秒内（n=6）即达到稳定电位（图 6C这凸显了同心微电极相较于双管微电极具有更优的时间分辨率。

5. 组织解剖

  1. 制备急性脑片时，使用 CO2 对出生后16至20天的小鼠进行麻醉，并迅速断头处死（遵循欧洲委员会发布的建议：实验动物安乐死，卢森堡：欧洲共同体官方出版局，1997年；ISBN 92–827-9694-9）。
  2. 按照标准操作流程制备海马组织切片（厚度为250 µm）（参见例如14）。

6. 实验步骤

  1. 将脑片转移至实验记录槽中，并用网格固定。
  2. 将校准后的离子选择性微电极缓慢下降至脑片表面，并将其插入CA1区stratum radiatum约50 µm深度。
    注意：微电极接触脑片表面时，离子敏感电极的信号会出现特征性波动。此外，穿刺过程中若损伤细胞，也会引起信号波动。需等待基线稳定后再进行后续操作。
  3. 进行递质激动剂压力施加时，用移液器吸入待施加的化合物（例如0.5 mM谷氨酸），将移液器固定于显微操作仪上，并连接至压力施加装置。
  4. 将施加移液器缓慢插入组织，小心地将其置于离子选择性微电极尖端附近（约20–40 µm）。启动压力施加（例如10秒，40 mbar），并记录离子选择性微电极监测到的电压变化。
  5. 进行药物浴槽施加时，通过切换不同灌流人工脑脊液，在规定时间内完成药物暴露。
  6. 实验结束时，小心地将离子选择性微电极从组织中撤出，并记录在长时间记录过程中可能发生的相对于初始零点的电位漂移。
  7. 将脑片标本从记录槽中取出，并对离子选择性微电极进行第二次校准。
    注意：由于电极尖端在穿过组织时可能发生堵塞，因此必须重新校准以确认电极对离子浓度变化仍具有正常响应。若电极对十倍离子浓度变化的响应下降超过10%，则应舍弃该次实验数据。性能良好的电极原则上可重复用于多次实验，尤其是同心圆结构电极，甚至可使用数天。但每次实验前后均必须重复校准程序，以确保电极功能正常。

7. 数据分析

  1. 为了将离子选择性电极的电压响应转换为细胞外离子浓度的变化，首先将公式2转换为如下形式以确定电位变化ΔVion（mV）（此处以K+-敏感电极为例，Na+-敏感电极采用类似方法）：

静息平衡方程，ΔVK+=s×log([K+]B+[ΔK+]o/[K+]B)，科学公式。

VK+：缬氨霉素通道电位的变化（mV）

s：能斯特斜率

K+]B：钾的基础浓度（本实验中为 2.5 mM K+）

K+]o：实验期间 [K+]o 的变化

  1. 根据实验前后校准曲线的单对数图得出的斜率，计算其算术平均值（参见图5B、6B；见第4.8步），以获得“s”。
  2. 为计算[K+]o的变化量（Δ[K+]o，单位为mM），将公式3重排为：

钾离子浓度变化 Δ[K+] 的方程式，化学公式分析。

结果

为了监测[K+]o 并响应兴奋性活动的变化，将一根双管钾选择性微电极插入 辐射层 CA1 区域。刺入几分钟后，电极的选择性离子桶部达到稳定基线（图7A），对应于 [K+]o 约为 2.8 mM，该值接近 [K+]（所用人工脑脊液中的浓度为2.5 mM）。浴施加0.5 mM谷氨酸持续10秒可诱导[K+]o 约4 mM，随后出现低于基线的下冲，幅度约为0.7 mM（图7A）。将谷氨酸浓度降低至 0.4、0.3 和 0.2 mM 时，瞬时升高幅度及[K+]o (图7A).

神经元离子电流图；K+ 动力学、电生理学、动作电位、APV、CNQX、TTX 阻断。
图 7. 兴奋性活动引发的细胞外钾离子瞬变。 （A）[K+]o 瞬变，表现为先升高随后低于基线的下冲，由浴施加不同浓度谷氨酸持续 10 秒诱导，如图所示。（B）灌注谷氨酸受体阻断剂（CNQX，100 µM；APV，100 µM）和河豚毒素（TTX；0.5 µM）对浴施加 0.5 mM 谷氨酸 10 秒所诱导的 [K+]o 瞬变的影响。（C）在 0Mg2+/BIC 条件下的自发性 [K+]o 瞬变。A-C 中所示实验使用双管电极进行。为便于展示，曲线经 Savitzky-Golay 滤波器平滑处理（宽度为 20）。请点击此处查看该图的放大版本。

早期实验表明，此类谷氨酸诱导的细胞外[K+]o信号在应用TTX期间未发生显著改变，因此在很大程度上不依赖于电压门控钠通道的开放及神经元动作电位的产生15,16。为了研究谷氨酸引起[K+]o变化的潜在机制，我们在存在TTX（0.5 µM）的情况下施加了谷氨酸受体阻断剂，即CNQX（100 µM；AMPA受体阻断剂）和APV（100 µM；NMDA受体阻断剂）。当通过灌流施加这些阻断剂后，谷氨酸诱导的[K+]o变化几乎完全被消除，证实了其依赖于离子型谷氨酸受体通道的开放，这与先前报道的结果一致（例如 17；图7B）。

为进一步证明谷氨酸能兴奋性活动在细胞外[K⁺]升高过程中的相关性+] 信号，切片用无镁人工脑脊液灌注2+不含盐水 10 µM 荷包牡丹碱甲碘化物（0Mg）2+/BIC)。这可解除电压依赖性的Mg2+阻断NMDA受体并通过阻断GABA减弱抑制作用A 受体，导致网络中出现自发性反复癫痫样活动（例如 18,19）。正如预期的那样 20，自发性，复发性 [K+]o 瞬变信号，约为 1.5 mM，在 0Mg 条件下被检测到2+/BIC 生理盐水（图7C）。在这些反应之间，较小的 [K+]o 瞬变信号的平均振幅约为 0.2 mM图7C).

在另一组实验中，我们使用对[Na+]敏感的微电极来测定谷氨酸激动剂引起的细胞外[Na+]o变化。在此，我们还比较了双管微电极和同心微电极在两种不同给药模式下的响应特性。将[Na+]敏感微电极置于stratum radiatum，深度约为50 µM。在获得稳定的基线后，通过浴槽灌流方式给予谷氨酸激动剂L-天冬氨酸（10 mM，120秒，灌流速度为2.5 ml/min）。如先前研究所示21，天冬氨酸的施加导致[Na+]o缓慢下降约15 mM，该效应持续约5分钟，随后开始恢复至基线水平（图8A）。值得注意的是，在这些条件下，两种电极测得的[Na+]o信号的峰值幅度和动力学特征几乎完全相同，但同心电极表现出更稳定的基线和更低的噪声水平（图8A）。

为了在更快速的应用模式下测试不同电极的响应特性，我们通过一根精细的玻璃移液管施加谷氨酸，该移液管置于距离离子选择性微电极尖端 20–40 µm 的 stratum radiatum 区域。正如预期21，施加谷氨酸（10 mM）持续 200 毫秒引起了细胞外钠离子浓度 [Na+]o 的下降（图 8B）。两种类型电极测得的 [Na+]o 下降峰值幅度范围相似（双管电极：4.5 – 13.5 mM，n=14；同心电极：2.0 – 19.1 mM，n=15）。然而，与缓慢浴灌注所得结果（见上文）不同的是，不仅信噪比存在差异，而且两种电极检测到的 [Na+]o 信号的时间进程也显著不同。双管微电极的平均达峰时间为 3.5 秒，而同心微电极仅为 1.3 秒。

因此，这些结果展示并证实了同心式钠电极相较于双管钠电极具有更快的响应动力学+选择性微电极，（参见 图6C和8B），这一点在Ca中也有同样观察结果2+ 以及pH选择性对应物 10与之前的研究不同，之前的研究采用短脉冲突触刺激以诱发快速的突触诱导离子瞬变，而在本研究的应用范式下，同心电极与双管电极在平均峰值幅度上仅表现出一种趋势，但无显著差异。这可能是由于给药移液管与离子选择性微电极尖端之间的距离变化达两倍（20–40 µm因此，不同实验中靶向区域的谷氨酸最大浓度并不相同，这阻碍了峰幅之间任何现有差异的显现。

（A）上图：双巴雷尔电极（黑色虚线）和同心电极（灰色实线）的参考巴雷尔电压（Vref）在浴液Na+浓度（[Na+]b）变化时的响应，如图所示。注意，两种电极的电压响应几乎完全相同。下图：双巴雷尔电极（黑色实线）和同心电极（灰色实线）的Na+电位电压（VNa+）在[Na+]b变化时的响应。（B）两种电极的[Na+]b与VNa+关系的半对数图。数据的线性拟合显示，两种电极的斜率均约为48 mV。（C）双巴雷尔电极（黑色实线）和同心电极（灰色实线）的VNa+在[Na+]b从152 mM快速降至70 mM时的响应。注意，同心电极的响应时间明显更快。为便于展示，图中曲线经Sawitzky-Golay滤波器平滑处理（宽度为20）。

显示电压和钠离子浓度变化的电生理学图谱，使用双管和同心电极检测。
图 8：通过双管电极和同心电极检测到的细胞外钠瞬变。
（A）用 10 mM 天冬氨酸灌注浴液 120 秒（如条形所示）诱导的 Vref 和 [Na+]o 瞬时变化。上部曲线为使用双管电极记录的结果，下部曲线为使用同心电极记录的结果。（B）通过局部加压施加 10 mM 谷氨酸 0.2 秒（如箭头所示）诱导的 Vref 和 [Na+]o 瞬时变化。上部曲线为使用双管电极记录的结果，下部曲线为使用同心电极记录的结果。红色虚线表示从信号起始到其峰值期间的线性拟合。请注意，在此条件下，同心电极的响应时间显著更快。为便于说明，曲线经Sawitzky-Golay滤波器平滑处理（宽度为20）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

基于液态载体的离子选择性电极已成功应用数十年，并且针对多种离子已有高特异性传感器可供使用22-26。然而，在脊椎动物脑组织的细胞外间隙（ECS）中应用时必须注意，该技术具有较强的侵入性：尽管细胞外间隙的宽度仅为约20–50 nm，离子选择性微电极的直径却约为1 µm（双管电极）或更大（同心电极）。因此，离子选择性微电极的尖端在穿入组织时不仅会损伤组织，还会扩大细胞外间隙，导致对离子瞬变的低估。尽管存在这些局限性，不同实验室所记录到的神经元活动引发的细胞外离子瞬变结果却表现出高度一致性7,8，证明了该方法的可靠性。

离子选择性电极的性能和适用性取决于其灵敏度和选择性，而这些特性由所使用的传感器混合物（“液态膜离子载体”）决定。传感器混合物包含一种特殊的载体分子， 例如 缬氨霉素用于 K+-对钾具有高选择性的微电极 27然而，可能会与其他离子发生交叉反应，必须进行测试。缬氨霉素对铵根离子具有显著的交叉反应性，在解读结果时需予以考虑（例如 11,12）。此外，由于离子载体的电压响应遵循能斯特行为（参见公式1），其信噪比和检测阈值取决于待测离子的浓度。因此，当[K+]o 瞬变过程在低基线[K+]o，小量 [Na+]o 瞬变信号在高基线[Na+]o （参见 图5和图6).

离子选择性电极的性能还取决于其时间分辨率，而时间分辨率主要由电极的电时间常数决定。电时间常数主要取决于传感器的轴向电阻以及移液管长度方向上内部溶液与外部液体之间的分布电容。在双通道配置中，由于回填离子传感器形成长液柱，电阻较高。对于给定的绝缘介质（本例中为硼硅酸盐玻璃），电容由介质厚度决定。在双通道电极中，介质宽度即为移液管的玻璃管壁厚度。当玻璃在尖端附近变薄时，介质宽度减小，电容随之增加。这些因素共同作用，使得电极的响应时间随参数变化而介于数百毫秒到数秒之间。

同心设计的一个主要优点是轴向电阻和相对于浴液的电容都大大降低。同心移液管分流了大部分后填充离子交换剂的电阻，仅在尖端前几微米处残留少量电阻。此外，同心移液管内的填充液在物理上与浴液相隔较远，中间隔着两层玻璃壁的厚度，从而显著降低了电容。如先前所示10，电阻和电容降低的综合效应使时间分辨率提高了两个数量级。对于同心Ca2+和pH微电极而言，90%响应时间可低至10–20毫秒10。同心设计的另一个相关优势是噪声水平较低（参见图8）。由于电阻显著降低，来自任何环境噪声的电压瞬变被最小化。此外，由于时间常数较短，此类瞬变的恢复速度很快。因此，这类伪影幅度小、持续时间短，对生理记录的干扰更小（参见图8）。

同心电极技术也存在一些缺点。首先，其组装过程更为复杂且耗时。第二个缺点是需要放置一个独立的参比微电极，并将其尖端定位，这要求使用单独的显微操作器或专用的双通道操作器。最后，双管微电极可进一步扩展为三管设计，从而能够同时检测两种不同的离子种类28，而同心电极则无法实现这一功能。

最常见的陷阱

硅烷化效率低下。

制造任何基于液体传感器的离子选择性微电极过程中，最重要的步骤及主要障碍均为硅烷化处理。当电极无法响应特定离子浓度的变化，或响应呈现亚能斯特响应（sub-Nernstian response）时，即，远低于每十倍浓度差58 mV），通常是由硅烷化效果不佳所致。根据我们的经验，当环境湿度过高或过低时（分别类似于夏季或冬季的典型条件），便可能发生这种情况。如果能够对室内湿度进行一定程度的控制，则可克服此类问题。

电极电阻过高。

如有需要，可通过打磨降低离子敏感电极管的电阻。为此，将其尖端暴露于水中悬浮的研磨剂强射流中数秒钟。这将导致其最顶端断裂，从而使电阻降至所需值。

盐桥。

离子管与参考管之间的盐桥会导致电极响应不良或无响应，因此也会严重干扰电极在标定过程中的性能。如上所述（见第1.6点），这一问题主要出现在选用双管型theta玻璃时，而采用本方法所述的偏移式扭绞管技术时则较为罕见。

考虑到制备的简便性，Lux29最初的双管设计通常可有效利用。该方法首先将离子管和参比管预先填充盐溶液，然后通过尖端吸入并推出硅烷溶液进行快速处理，随后同样通过尖端引入离子交换剂（见30,31）。此类电极的制备大约需要10分钟，但其尖端尺寸通常为4 µm或更大，且在实验过程中更容易失效。相比之下，采用硅烷蒸气暴露并加热的硅烷化方法可制备出尖端更小、使用寿命可达数天甚至数周的电极。

综上所述，目前已有多种制备离子选择性微电极的方案和方法。本文中，我们描述了两种在本实验室中效果良好且可靠的微电极制备主要步骤，分别为绞合式双管微电极和同心式双管微电极，其总体成功率接近100%。重要的是，这些技术可推广应用于其他离子种类的检测，包括pH或钙离子，也可用于除脑组织以外的其他样本，如充满液体的腔隙或一般体液。最后但同样重要的是，离子选择性微电极可用于测定细胞内离子浓度。由于其尖端尺寸相对较大（约1 µm），该技术仅适用于胞体较大的细胞，例如无脊椎动物标本中常见的细胞28,32。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者谨此感谢 C. Roderigo 提供的专业技术协助。感谢 S. Köhler（德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学先进成像中心）在视频制作方面的帮助。作者实验室的研究工作得到了德国研究基金会（DFG：Ro 2327/8-1，资助 CRR）、德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学（资助 NH）以及美国国立卫生研究院基金 R01NS032123（资助 MC）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
研磨剂  MicroPolish Buehler有限公司溶解于 A.dest 中
硼硅酸盐玻璃毛细管1405059Hilgenberg移液管；75 mm × 2 mm，壁厚 0.3 mm
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管GC 150 F-15 Clark 电生理仪器公司，哈佛仪器公司双巴雷尔微电极传感器 
带纤维的硼硅酸盐玻璃毛细管GC100-F-15Clark Electromedical Instruments，Harvard Apparatus双巴雷尔微电极的参考 
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管GB-200TF-15 科学产品同心外通道。外径 2.0 mm  
带玻璃丝的硼硅酸盐玻璃毛细管GB-120TF-10科学产品同心内管，外径 1.2 mm
Digidata1322AAxon Instruments
带前置放大器的静电计放大器定制Rin = 10 TΩ 以及 Ibias = 50 fA–1 pA（商业可购得）  替代方案： 例如 Dagan IX2-700，配备前置放大器（10 GΩ 反馈电阻）或 EPMS-07，NPI，Tamm，德国
实验腔室定制可从商业渠道获得 例如   Warner Instruments，美国  英国 Scientifica 公司
熔炉Heraeus必须保持恒定在200 °C
硬质粘性蜡 / 牙科蜡 Deiberit 502 Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
加热板定制必须始终保持在40 °C
由有机玻璃制成的微电极夹持器定制双联管：O.D.  毛细管 1.5 mm，同心：外径  毛细血管 2 mm
显微操作仪Leitz
显微操作仪MD4RLeica
体视显微镜M205CLeica
目标计划 0.8xLWDLeica
移液管拉制仪Model PP-830Narishige同心微电极 
拉管仪Model P-97Sutter Instruments 同心微电极传感器 
气动药物喷射系统Picospritzter II型General Valve TM 公司
平移燕尾台DT 25/MThorlabs
双组分胶水 Araldite亨茨曼先进材料有限公司也可使用一小条铝箔将毛细管粘在一起 
银线99.9% Wieland Edelmetalle
切片机 / 振动切片机Microm HM 650 V赛默飞世尔科技
软件AxoScope 8.1 Axon Instruments
垂直拉制仪 PE-2型Narishige科学仪器公司配备可旋转卡盘的  双管微电极
x/y 平移台定制
1(S),9(R)-(−-荷包牡丹碱甲碘化物Sigma-Aldrich14343GABAA受体的竞争性拮抗剂（光敏感）；注意：有毒
CNQXSigma-AldrichC-127AMPA/红藻氨酸受体拮抗剂；注意 有毒性
二甲基亚砜（DMSO）Sigma aldrichD5879
DL-AP5Alfa AesarJ64210NMDA受体拮抗剂；注意 有毒
六甲基二硅氮烷（HMDS）Sigma-Aldrich440191警告：易燃，经口、经皮和吸入急性毒性，对金属和皮肤具有腐蚀性
L-天冬氨酸Sigma-AldrichA9256激活NMDA、非NMDA受体及EAATs
L-谷氨酸单钠盐水合物Sigma-AldrichG1626激活NMDA受体、AMPA受体、QA受体和KA受体，  mGluRs 和 EAATs
钾离子载体 I - 混合液 BFluka 60403基于缬氨霉素；注意：有毒
钠离子载体 II - 混合液 AFluka  71178基于 ETH 157
TTXAscent ScientificAsc-055电压门控Na+通道抑制剂；注意：有毒
超纯水Sigma-AldrichW3500 

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勘误


Formal Correction: Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 5/10/2016. Citeable Link.

An author's middle initial was omitted from the publication, Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. The author's name has been updated to:

Christine R. Rose

from:

Christine Rose

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