组织工程通常包括 体外 扩增以创建用于组织再生的自体移植物。本研究介绍了一种组织扩增、再生与重建的方法 体内 旨在尽量减少细胞和生物材料在体外的处理过程。
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摘要
摘要
用于组织工程的自体细胞扩增与移植的传统技术可在配备专用设备的人类细胞培养设施中进行。这些方法包括将细胞分离为单细胞悬液，并在重新移植回患者体内之前完成一系列耗时且 laborious 的操作步骤。先前的研究表明，可将人体自身用作生物反应器以实现细胞扩增和组织再生，从而最大限度地减少 离体 移植前对组织和细胞进行的操作。本研究旨在展示一种组织获取、连续上皮分离、将上皮切割成小片段并将其整合入三层生物材料的方法。该三层生物材料作为递送载体，便于手术操作、促进移植物营养交换，并实现可控降解。该生物材料由两层外层的胶原蛋白和一个机械稳定且缓慢降解的聚合物核心组成。在移植前，将切碎的上皮组织整合至其中一层胶原层中。通过将上皮组织切割成小片段，可使其均匀铺展，从而刺激细胞增殖。在移植物初步存活后，细胞将进行扩增与重组，细胞外基质逐渐成熟，促进毛细血管和神经的长入，并进一步促进细胞外基质的成熟。该技术最大限度地减少了 离体 操作简便，可实现细胞采集、自体移植材料制备及患者移植的一站式单阶段干预。未来，可根据患者的具体需求，在体内利用三维模具启动组织扩张。此外，该技术可在普通手术环境中实施，无需复杂的细胞培养设施。
引言
大多数关于移植至皮肤和泌尿生殖道的组织工程研究，均包括从健康组织中获取自体细胞，以及在配备特殊设备的细胞培养设施中进行细胞扩增1,2。
细胞扩增后，通常需要将细胞储存起来，待患者准备好接受自体移植时再使用。液氮冻存罐可在-150 °C或更低温度下实现细胞的长期保存。细胞冻存过程必须谨慎且受控，以避免细胞损失。细胞死亡的一个风险是在解冻过程中细胞内水分形成冰晶，导致细胞膜破裂。细胞冻存通常采用缓慢且受控的降温方式（每分钟降低1 °C），并使用高浓度的细胞、胎牛血清以及二甲基亚砜。解冻后，细胞在重新移植回患者体内之前，需再次进行处理，包括去除冻存液，并在细胞培养塑料表面或生物材料上重新培养。
上述所有步骤均耗时、费力且成本高昂3此外，所有 体外 用于患者移植的细胞处理受到严格监管，需要经过专业培训并获得认证的人员和实验室来操作4总之，为了获得安全可靠的制造工艺，该技术目前仅能在少数技术先进的中心建立，其在普通外科疾病中的广泛应用前景尚不明确。
为了克服实验室环境中细胞培养的局限性，提出了一种将切碎的组织进行体内移植以实现细胞扩增的概念，即利用机体自身作为生物反应器。为此，自体移植物应优先移植到与目标器官最终重建形状相匹配的三维模具上5-7。
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方案
所有动物实验方案均事先获得斯德哥尔摩县动物伦理委员会批准，所有操作均符合动物使用相关法规以及联邦法律规定。
1. 动物实验操作
- 手术前动物准备
- 在无菌条件下，将手术所需的所有材料和器械准备好并放置于手术台上。手术操作必须在严格的无菌条件下进行，以降低感染风险，并优化存活手术的条件。
- 术前12小时禁食动物，并测量其体重。肌肉注射赛拉嗪（2 mg/kg）作为术前用药。通过肌肉注射盐酸替来他明（2.5 mg/kg）、盐酸唑拉西泮（2.5 mg/kg）、美托咪啶（25 µg/kg）和阿托品（25 µg/kg）对动物实施麻醉。
- 在气管插管前注射苯巴比妥（15 mg/kg），随后以0.8%–2%异氟烷维持全身麻醉。在一侧耳部插入外周静脉导管，并在手术过程中静脉输注葡萄糖（25 mg/ml），以维持动物的良好状态。
- 将监测设备置于耳部或尾部，以检测体温、血压、血氧饱和度和外周脉搏。通过刺激耳部或蹄部评估疼痛反应，以调控麻醉深度。麻醉期间涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 膀胱活检标本的切除
- 使用10-Fr硅胶导管进行膀胱插管，插入窥器以暴露尿道，将导管经尿道插入膀胱，在半无菌条件下排空尿液。用无菌生理盐水将膀胱充盈至20–25 cm H2O压力（约....
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结果
本研究介绍了一种通过胶原蛋白和绞碎组织的塑性压缩来制备用于移植的生物材料的方法。
可采集膀胱黏膜和皮肤，随后通过机械方法将其切碎成小颗粒（图3）。通过塑料压缩法，将切碎的组织颗粒整合到复合支架中，该支架由中心位置的可生物降解聚合物构成，外层为胶原凝胶，具有良好的机械强度（图4）。切碎的组织颗粒可被分离，实现1:6的扩增率。通过压出胶原中的水分，即可完成用于自体重建手术的生物移植材料制备。
生物移植物可用于动物自体移植，以进行体内研究，也可在常规细胞培养环境中培养，用于进一步的体外研究。
复合自体移植物便于抓取和缝合，并能耐受外科操作（图5）。从组织获取到制备含细胞的自体移植物用于重建手术的整个过程大约需要20分钟，旨在作为单阶段手术完成。
在 体外 研究显示，细胞.......
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讨论
本研究介绍了一种在手术台上利用自体组织制备膀胱壁补片的简便方法。该补片由中间的可生物降解聚合物针织材料与外层含或不含 minced 组织的胶原结合，并通过塑性压缩技术成型。塑性压缩是一种先前由其他研究者描述的方法，可定义为从胶原凝胶中快速排出液体的过程。12,13膀胱黏膜或皮肤的绞碎组织被接种于该支架中，并形成 膀胱或皮肤上皮可在6周内进行追踪。免疫组织化学分析显示形成了具有正常组织特征的类似结构。这些结果不仅能够 体外 研究再上皮化和伤口愈合的模型，也可作为自体组织移植的生物材料。对于泌尿科应用而言，最重要的是，自体移植物可用于 在体 组织工程在重建泌尿外科中的应用：利用工程化自体组织补片，无需供体组织 体外 移植前培养11.
在细胞扩增和体外培养技术方面，皮肤上皮与尿路上皮具有共同的特性。本研究中同时介绍适用于这两种上皮组织的塑料压缩与剪切技术，其原因是皮肤上皮的获取及体内研究相比膀胱尿路上皮更为简便。通过这种方法，可首先利用生物材料.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢瑞典医学研究学会、Promobilia 基金会、王储妃洛维萨基金会、共济会儿童福利基金会、瑞典医学会、Solstickan 基金会、卡罗林斯卡学院以及斯德哥尔摩市议会提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10-French 硅胶导管 | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | 塑料压缩，第 4 节 |
| 24 孔板 | Falcon | 08-772-1 | 塑料压缩，第 4 节 |
| 3',3',5-三碘甲腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | IRMM469 | 体外培养；第 5 节 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 70% 乙醇 | Histolab | 免疫细胞化学；第 6 节 | |
| ABC Elite 试剂盒：生物素-链霉亲和素检测试剂盒 | Vector | PK6102 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 无水乙醇 | Histolab | 1399.01 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | A8626 | 体外培养；第 5 节 |
| 阿托品 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, 英国 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 乙酰丙嗪 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, 奥地利 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 生物安全二级罩 | 塑料压缩；第 4 节 | ||
| 封闭液： 使用与二抗相同物种来源的正常血清。 | Vector | 封闭液取决于 一抗的 来源 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 丁丙诺啡 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 卡洛芬 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, 瑞典 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 葡萄糖酸氯己定 | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, 英格兰 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | 体外培养；第 5 节 |
| Coplin 染色缸：用于煮沸的染色缸 | Histolab | 6150 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 不锈钢模具（33 mm x 22 mm x 10 mm），定制 | 塑料压缩；第 4 节 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | 塑料压缩，第 4 节。进行塑料压缩时使用需保持冰上 |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | 体外培养；第 5 节 |
| Ethilon（不可吸收单丝缝合线，用于皮肤缝合） | Ethicon | 手术，第 1 节 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10437-036 | 塑料压缩，第 4 节 |
| 镊子（Adison 带齿） | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| 纱布（Gazin Mullkompresse） | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | 塑料压缩，第 4 节 |
| 苏木精 | Histolab | 1820 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 湿盒 | DALAB | 免疫细胞化学；第 6 节 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | 体外培养；第 5 节 |
| 过氧化氢溶液 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I3536 | 体外培养；第 5 节 |
| 异氟烷 | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 利多卡因 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, 瑞典 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 葡萄糖 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 标记笔（Pap pen） | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| 美托咪啶 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, 瑞典 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 组织切碎装置 | Applied Tissue Technologies LLC | 组织切碎制备，第 2 节 | |
| Monocryl（可吸收单丝缝合线） | Ethicon | 手术，第 1 节 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | 塑料压缩，第 4 节及细胞培养 |
| 尼龙筛网，厚度 110 μM，孔径 0.04 sqmm | 塑料压缩；第 4 节 | ||
| Oculentum simplex APL：眼部保护软膏 | APL | Vnr 336164 | 手术，第 1 节 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | 塑料压缩，第 4 节 |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 塑料压缩，第 4 节 |
| 苯巴比妥 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, 瑞典 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| PCL 编织织物 | 塑料压缩；第 4 节 | ||
| 大鼠尾胶原 | First LINK, Ltd, 英国 | 60-30-810 | 塑料压缩，第 4 节，保持冰上 |
| 手术刀片 - 15 | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| 剃毛剪 | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| 不锈钢筛网，厚度 400 μM，孔径 | 塑料压缩；第 4 节 | ||
| 无菌手套 | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| 无菌手术衣 | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| 无菌铺巾 | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 缝合线 Ethilon | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| TE 溶液（抗原修复液），含 10 mM Tris 和 1 mM EDTA，pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA， 调节 pH 至 9.0 | ||
| 盐酸替来他明 2.5 mg/kg | 手术前动物准备，第 1 节 | ||
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T8158 | 体外培养；第 5 节 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| Vector VIP 试剂盒：酶 过氧化物酶底物试剂盒 | Vector | SK4600 | 免疫细胞化学；第 6 节 |
| Vicryl（可吸收编织缝合线） | Ethicon | 手术，第 1 节 | |
| Tris 缓冲液 pH 7.6（洗涤缓冲液） | TE 溶液：配制 10x（0.5 M Tris, 1.5 M NaCl），方法为：称取 60.6 g Tris（Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol），加入 800 ml 蒸馏水，调节 pH 至 7.6，加入 87.7 g NaCl，加蒸馏水定容至 1,000 ml。使用时用蒸馏水稀释至 1x。 | ||
| X-tra solv（溶剂） | DALAB | 41-5213-810 | 免疫细胞化学；第 6 节。在通风橱中使用 |
| 盐酸唑拉西泮 | Zoletil, Virbac, 法国 | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 脱毛蜡纸 | Veet | 手术前动物准备，第 1 节 | |
| 戊巴比妥钠 | Lundbeck | 终止，第 3 节 |
参考文献
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered uri....
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