腭发育研究的动力源于腭裂的发生率，腭裂是一种出生缺陷，会给患者带来巨大的健康负担，并可能导致持久的畸形。本文展示了一种培养腭突的技术，可用于研究参与腭发育及融合过程中的不同信号通路。
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本文内容
摘要
摘要
唇裂和腭裂是最常见的出生缺陷之一。继发性腭由被上皮覆盖的间充质突起发育而来，这些突起黏附融合形成中线上皮缝（MES）。理论认为，MES细胞经历上皮-间充质转化（EMT）、凋亡和迁移，最终形成融合的腭1。MES的完全解体是腭融合过程的最终关键阶段，使周围间充质细胞得以汇合。我们提供了一种腭器官培养的方法。该建立的体外方案可用于研究融合过程中的生物学和分子事件。该技术具有多种应用，包括评估对外源化学物质的反应、调控因子与生长因子以及特定蛋白质的影响。腭器官培养具有多项优势，例如可在发育的不同阶段进行操作，而这是体内研究无法实现的。
引言
口面裂是发病率最高的颅面出生缺陷。此外，若考虑所有可能的颅面缺陷，这类缺陷在新生儿中是第二常见的出生异常2。在美国（US），每年约每700例出生中就有1例发生腭裂，即每月约有475名儿童出生时患有腭裂，或每天约有15名儿童患有口面裂3。全球每年出生的儿童中，约有1%表现出某种形式的颅面畸形。
唇腭裂需要昂贵且复杂的治疗过程，对患者一生都有影响。每位口腔裂畸形患者的估计治疗费用约为100,000美元4。唇腭裂患者的治疗需要多学科医生团队协作，包括颅面外科医生、耳鼻喉科医生、遗传学家、麻醉师、言语语言病理学家、营养师、正畸医生、修复牙科医生、心理学家、神经外科医生和眼科医生。
在腭形成过程中，次级腭以成对的突起形式出现，这些突起初先垂直生长，并在舌背上方发生腭突上抬。上抬之后，左右腭突向中线方向生长（小鼠为胚胎14.5至15天，人类为第9周）。覆盖在腭突顶端的内侧边缘上皮（MEE）相互黏附，形成中线处的上皮缝。
随后发生上皮-间充质转化和/或细胞凋亡，以促进间充质融合。相对的中鼻突上皮（MEE）之间的黏附是一个关键事件，其异常可导致腭裂。然而，仅有少数研究探讨了腭突最初的黏附过程5。硬腭由间充质细胞分化为成骨细胞而形成。腭的发育异常可导致单纯性腭裂或伴有唇部受累的唇腭裂。
过去30年来，腭器官培养技术已被许多实验室广泛使用6,7。
在本方案中，我们详细描述了一种腭部解剖及静态器官培养的方法。静态器官培养的优势在于其能够使腭突融合。该技术已在我们的实验室成功用于多项融合与信号传导实验8,9。然而，该技术的应用范围广泛，凡需要静态器官培养系统的实验均可采用，包括评估外源性化学物质的反应、不同信号通路中调控性生长因子的作用以及特定蛋白质的功能。
图1. 小鼠腭发生过程。 小鼠腭的发育阶段。(B-F) 次级腭在代表性发育时间点的扫描电子显微照片（SEM）。红色箭头：显示腭黏附和融合的起始部位。黄色箭头：指示初级腭与次级腭之间的间隙，该间隙将在融合后消失（经PLOS one许可转载自Kaufman11）。
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方案
所有所述操作步骤必须遵循脊椎动物使用相关的指南和规定，并须事先获得当地机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 解剖器械和培养基的准备
- 所有用于解剖的器械先用 3% 过氧化氢预洗，然后在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。在生物安全柜中，使用 0.22 µm 孔径滤膜和真空抽滤装置过滤含有抗生素和抗真菌剂的 BGJb 培养基。
2. 培养设备的准备
- 将用于支撑腭器官的聚碳酸酯膜滤器剪成小三角形，用70%酒精喷洒后晾干。取中心井器官培养皿（60×15 mm），在培养皿中放置洁净且已灭菌的等边三角形金属丝网（20 mm），然后向井中加入1 ml BGJb培养基。注意：培养基的量应足以达到金属丝网的水平，但不可淹没腭组织。将膜滤器有光泽的一面朝下，放置在金属丝网上（每张网放置3–4个膜滤器）。根据实验需要，可在培养基中加入处理物（如蛋白质、抗体或抑制剂）
3. 小鼠胚胎的收集与培养前准备
- 为获取野生型小鼠胚胎，使用配孕13.5天的CD-1小鼠作为遗传背景品系。用70%乙醇清洁解剖区域。
注意：也可使用其他小鼠品系。我们倾向于使用CD-1小鼠，因其产仔数较多。 - 采用经批准的实验方案，以5%异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死E13.5 dpc（交配后天数）的怀孕小鼠，确保动物死亡。
- 用70%乙醇喷洒腹部腹侧表面，防止腹部毛发粘附于器械上。然后使用尖头-钝头手术剪和显微解剖镊从腹侧打开腹腔，暴露子宫。用镊子提起整个子宫，并用轻便手术剪在子宫体及子宫角尖端处剪断，将其从体内分离。
- 将子宫置于冰上铺有洁净纸巾的表面（依据实验动物护理与使用规程指南）。再用另一张洁净纸巾覆盖子宫，以防污染。在继续操作前，使用70%乙醇喷雾对器械进行灭菌。子宫及胚胎可置于冰上运送至实验室。
- 在开放式的层流罩内，使用尖头-钝头手术剪和显微解剖镊小心地在卵黄囊上剪开一个小口。逐渐扩大切口，然后轻轻推动以使胚胎从卵黄囊中完全露出。
- 立即将胚胎转移至含有冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）的培养皿中。为确认发育阶段是否正确，需在解剖显微镜下观察胚胎的躯体、头部大小及肢体形态。
注意：发育阶段不符合要求的胚胎不得用于实验。
图2. 肢芽形态学。 前肢和后肢需检查趾间蹼状结构凹陷的程度。在E13.5时，所有趾的间充质凝聚区均已明显可见，趾间的蹼状结构及远端凹陷非常清晰。后肢的发育比前肢滞后约半天。12 上排：前肢；下排：后肢。
4. 腭部解剖
- 每次将一个胚胎置于含有 PBS 的培养皿中，在解剖显微镜下操作。使用小型解剖剪和镊子将胚胎的头部与身体分离。
- 用镊子小心夹住小鼠颅骨眼平面上方部位（避免接触上颌突），在唇线两侧各做一切口。随后去除下颌骨和舌。在眼平面处进行切割，分离出上颌突区域，并移除脑组织、眼睛、鼻中隔及邻近组织。
图3.从13.5天胚胎中获取的腭组织，此时腭板已抬升但尚未接触。 将腭板置于滤膜上的器官培养系统中，在气液交界面进行静态模型培养，持续72小时。(A) E13.5胚胎的解剖层面。(B) 蓝色星号标示在解剖过程中用镊子夹持组织的区域。(C) 解剖后的腭板放置于梯形滤膜上的视图。(D) 放置解剖所得腭组织并加入培养基后，培养皿的侧面视图。
- 将腭部口腔面朝上放置，去除鼻中隔及其周围组织，保留初级腭以帮助确定从前往后的方向。使用勺形刮匙，小心地将腭突（鼻面朝下）转移至培养皿网格上已准备好的滤膜上。注意：调整培养基体积，以确保形成适当的气-液界面。
- 在体视显微镜下分离初级腭，并用镊子将腭突彼此靠近放置。若腭突未接触，则不会发生融合。在滤膜的三角形区域切割，该区域对应腭部的前部。梯形形状有助于定位腭的前段部分。
- 使用 BGJb 培养基，将腭突单独培养，或每皿两至三个共同培养于同一器官培养皿中。
5. 小鼠腭架的培养
- 将组织置于37 °C、加湿的气体环境（5% CO2 和95%空气）中孵育72小时，每24小时更换一次培养基。
6. 用于组织学分析的腭部处理
- 在培养 72 小时后，用 4% 多聚甲醛/磷酸盐缓冲液在 4°C 过夜固定腭板 4° C. 然后用移液管轻轻吸取PBS洗涤培养皿中的组织。将腭片用一片实验室擦拭纸包裹后放入包埋盒中。
注意：将腭片用实验室擦拭纸包裹，可防止其在脱水过程中丢失。 - 依次使用70%、80%和100%乙醇脱水，每次1小时，随后进行常规石蜡包埋。包埋时，将腭部前段朝向包埋盒方向放置。
- 连续切片 6 µm 从前往后取冠状面切片。完整的腭部切片可获得350–450张切片。使用苏木精和伊红（H&E)。10 每20分评分一次th 使用先前所述的平均融合评分（Mean Fusion Score, MFS）量表（表1）进行评分。 8
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结果
该技术可应用于多种类型的实验。以下研究旨在检测尼古丁的致畸效应 体外 关于腭融合。本实验使用了两种小鼠品系，CD1 和 C57。腭组织用 0.06 和 6 mM 浓度的烟碱半硫酸盐处理。观察发现，两种不同品系小鼠的腭融合模式和时间存在差异。在 CD1 小鼠中，对照组的腭突随时间推移持续发生融合。然而，在处理组中，尼古丁延迟了融合过程，尤其是在 6 mM 尼古丁浓度下尤为明显（图 4A）。CD1小鼠腭部的组织学切片显示，对照组标本在培养72小时后完全融合。在较低浓度尼古丁处理下，腭板虽能黏附，但上皮细胞在培养3天后仍持续存在。而在高浓度尼古丁中孵育的腭板，经72小时孵育后仍未发生接触。
在C57小鼠中，对照组的腭突以时间依赖性方式持续融合。然而，当标本在尼古丁浓度为6 mM条件下孵育48小时时，C57小鼠的腭突评分高于在0.6 mM浓度下孵育相同时间的标本（图4B）。C57小鼠腭部的组织学切片显示，在处理组中，中线处持续存在连续的上皮缝。融合仅在72小时的对照组中被观察到。
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讨论
本文所述方案提供了一种在胚胎发育第13.5天（embryonic day 13.5）从小鼠胚胎中分离腭突的方法。从小鼠胚胎中获取的腭突被置于无血清培养基中，在37 °C、95% O2 和5% CO2的气体环境中进行培养。成功的腭突分离操作在多个步骤中均受到多种因素的关键影响，从处死孕鼠时的胚胎发育时间到培养完成均需严格控制。其中，影响腭突融合的最重要因素之一是开始器官培养所需的时间；胚胎必须处于胚胎发育第13.5天，此时次级腭突呈水平方向，但尚未开始融合（图 1）。
操作过程中的另一个关键步骤是从卵黄囊中取出胚胎。此步骤需格外小心，以避免对面部结构造成损伤。一旦将胚胎从卵黄囊中取出，需将头部与身体分离，并置于培养皿中，使用具有双侧光纤照明的体视显微镜进行观察。随后移除下颌和舌头，以暴露腭部。在与眼睛齐平的位置去除脑组织及残余组织。此时需特别注意腭突周围的上皮层。必须非常小心地操作组织，以保持这些细胞的完整性。上皮细胞负责黏附作用以及中缝上皮结构（MES）的形成。
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披露
作者不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者没有需要致谢的内容。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BGJb | Invitrogen | ||
| 青霉素/链霉素 | Lonza 公司 | 17-602E | 100X |
| 培养皿 | VWR | 25384-088 | 100 × 15 mm |
| 中心井式器官培养皿 | Falcon | #353037 | 60 × 15 mm |
| 金属丝三角网格 | 定制，采用不锈钢丝网制成，适配器官培养皿。 | ||
| 聚碳酸酯滤膜 | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | 黑色，孔径 0.4 微米，直径 47 mm |
| 体视显微镜 | ZEISS Stemi SR | ||
| 超净工作台 | NUAIRE 层流罩 | ||
| 显微解剖镊 | Dumont Medical | #5 | |
| 显微解剖剪 | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas 剪，直头，长 8 cm，尖端 0.1 mm，刀刃 5 mm，德国制造 |
| 显微解剖剪 | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas 剪，直头，长 8.5 cm，尖端 0.025 mm × 0.015 mm，刀刃 7 mm |
| 显微解剖剪 | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | 弹簧式弯头剪，双弯，长 10.5 cm，刀刃 8 mm，德国制造 |
| 外科刮匙（勺形刮刀） | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| 防护型实验操作罩 | Labconco | ||
| 培养箱 | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 水套式 | |||
| CO2 培养箱 | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| 光纤光源 | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| 包埋盒 | Statlab | EC301 | |
| 吸水纸（Kim Wipes） | VWR | 470173-504 |
参考文献
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重印与许可
