通过采用多个角度切割小鼠仔鼠脑组织，我们改进了先前描述的一种急性脑切片方法，该方法能够捕获大多数主要听觉中脑与前脑结构之间的连接。
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本文内容
摘要
摘要
大脑处理感觉信息的能力依赖于上行和下行投射通路。直到最近，研究这两类系统及其相互作用的唯一方法是使用体内（in vivo）实验模型。在包含体感、视觉和听觉系统丘脑-皮层及皮层-丘脑通路的急性脑片制备方面，已取得重要进展。通过对我们近期建立的听觉丘脑-皮层脑片模型的关键优化1，我们能够更可靠地捕获大多数主要听觉中脑与前脑结构之间的投射连接：下丘（IC）、内侧膝状体（MGB）、丘脑网状核（TRN）以及听觉皮层（AC）。由于保留了这些连接的大部分组成部分，我们能够回答一些与体内（in vivo）实验互补的精细科学问题。利用黄素蛋白自体荧光成像技术，可快速评估任意脑片中的连接性，并指导后续实验设计。将该脑片模型与电生理记录和成像技术结合使用，使我们能更深入地理解信息在听觉前脑各节点中随上行通路向皮层传递时的信息处理机制，以及皮层下行调控的影响。采用3D打印技术制造脑片记录室组件，可实现双侧灌流，广泛接触脑片内的神经网络，并维持大范围的神经连接，这对于充分挖掘该脑片模型的应用潜力至关重要。
引言
在听觉系统中，尽管感觉外周与下丘之间已存在大量的信息处理，但在信号到达听觉皮层之前，仍存在显著的进一步加工过程。目前我们对这种加工机制知之甚少，因此也难以理解这种信息转换如何使大脑解读传入的感觉信号。除嗅觉外，其余各种感觉系统均具有非常相似的组织结构：外周信号最初以高保真度传递，随着信号向皮层上传，保真度逐渐下降。随后，皮层发出投射至较低级结构，以进一步调节传入的信息。这一复杂系统已通过多种方法被广泛研究 体内 以及在多种 体外 制备。在前者中，所有连接均保持完整，使研究者能够在控制感觉输入的同时，探测任意一组连接，并在任何特定区域测量输出。然而，这种方法难以控制大量其他输入信号，包括其他感觉输入、觉醒状态和注意力，从而导致输出信号极为复杂。 体外脑切片已被切割以获取单组投射或两个相互连接的脑区，从而使研究人员能够刺激并评估不同的传入通路或脑区。这些切片通常是丘脑皮层或上丘-丘脑切片，其中保留了传入丘脑的输入通路，或同时保留了丘脑及其向皮层的输出通路2-5这些制备方法可用于多种药理学、电生理及光遗传学操控。然而，由于仅包含两个脑区，它们主要评估信息的传递过程，而无法有效评估信息在通过丘脑时所发生的信息转换。此外，网状核-丘脑投射可能在注意调控中发挥作用6-9 存在于该切片中。在此，我们展示了对先前制备方法的改进1，使研究者能够控制丘脑的多种输入，从而独特地观察丘脑如何对信息进行门控和过滤。我们将这种新型脑片制备方法与黄素蛋白自发荧光成像相结合，用于评估脑片的连接性及大规模激活分析；同时结合丘脑内的钙成像以进行神经元群体分析，以及单细胞记录以在单细胞水平上测量各种输入的影响。
为了帮助维持这些广泛的连接，我们还对用于固定脑片的常规切片锚（又称“harp”）以及用于抬高脑片以增强灌流的桥状结构进行了多项改进。该harp采用改良的马蹄形设计，可环绕脑片，并允许对harp弦的固定点进行个性化设置。三根弦的布置方式如下：i）一根沿脑片内侧边缘水平放置；ii）一根从下丘（IC）的尾侧边缘延伸至听觉皮层（AC）的尾侧边缘；iii）一根从脑片的内侧边缘斜向延伸至AC前方区域（见图1A）。框架上设有用于粘接（使用氰基丙烯酸酯胶水）harp弦的小凹槽，可减少对脑片的压力，有助于保持脑片的完整性（见图1B）。通过使用三维打印技术，我们能够根据特定需求定制设计harp和桥状结构，从而实现人工脑脊液（aCSF）在组织上下方的理想流动。同时，该设计也为光线穿透组织以进行膜片钳电生理记录保留了充足的空间。
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方案
所有实验程序均经伊利诺伊大学机构动物护理和使用委员会批准。所有动物均饲养在美国实验动物护理认证协会认证的动物护理设施中。在研究的各个阶段，均尽可能减少动物使用数量并减轻其痛苦。
1. 用于切片的小鼠脑组织的准备与取出
- 准备灌注和脑片孵育。
- 在切片前约30分钟，配制高蔗糖切割液以及用于记录或成像前孵育脑片的低钙人工脑脊液（aCSF）。
- 准备好灌注和切片所需的所有工具（大号钝头剪刀、小弹簧剪刀、解剖镊、大剪刀或断头台、虹膜剪、珠宝匠镊、10 ml 注射器配27G × 1/2英寸针头、一小块1 cm × 2 cm的滤纸，以及一个尖端折断的巴斯德移液管用于转移脑片），并准备好灌注托盘。
- 将孵育 chamber 置于32 oC水浴中，内含通氧的人工脑脊液（aCSF），同时准备一个装有切割液的培养皿。
- 准备切片阶段。
- 切取一小块约1 cm3的3%琼脂作为脑组织的挡板，并另切一块1.5 cm × 1.5 mm × 3 mm的琼脂凸起，用于支撑下丘（IC）。
- 使用氰基丙烯酸盐胶水将挡板固定在切片台上，并将凸起粘附在挡板右侧，使其与挡板形成80o夹角。
- 取出脑组织。
- 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）对p12-p20（理想为p14-18）的小鼠进行深度麻醉（或采用经伦理委员会批准的类似方案）。
注意：通过脚趾夹捏无反应确认麻醉充分。由于动物处于短暂麻醉状态，无需使用眼药膏。 - 使用钝头剪刀从剑突至颈部暴露胸腔。
- 找到剑突，做一条约1.5 cm的横向切口。
- 从上述横向切口两端各做一条长约1.5 cm的纵向切口，延伸至肩部。
- 剪开膈肌和肋软骨连接处，暴露心脏。
- 使用小弹簧剪刀在右心房处做一个2-5 mm的小切口，从心脏腹侧至背侧方向剪开。
- 使用配有27G × 1/2英寸针头的10 ml 注射器，插入左心室并迅速灌注高蔗糖切割液。
- 当血液变得清澈后，使用大剪刀切除头部。
注意：我们未系统评估过灌注的必要性。然而根据经验，对如此年幼的小鼠进行经心灌注几乎可达到近100%的成功率，且其优势在于可清除红细胞，避免红细胞自发荧光对成像造成干扰。 - 沿中线剪开皮肤以暴露颅骨。
- 使用弯头虹膜剪在双眼之间剪开颅骨，然后从该切口开始，沿中线缝合线小心地从前向后剪开，注意不要损伤下方脑组织。
注意：硬脑膜通常会随颅骨一起被移除。如有必要，在小心取出脑组织前先去除硬脑膜。 - 使用珠宝匠镊轻轻撬开颅骨，小心取出脑组织，并立即放入切割液中。注意避免损伤皮层。
- 使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）对p12-p20（理想为p14-18）的小鼠进行深度麻醉（或采用经伦理委员会批准的类似方案）。
2. 准备用于切片的脑组织
- 准备将脑组织安装到振动切片机载物台上。
- 使用一张标有两条相互垂直的直线（90o）以及一条从左上至右下、与水平线成17o夹角的斜线的载玻片，在斜线与垂直线交点处，将脑组织背侧朝上放置；使用刀片切除前端2–4 mm的脑组织，形成一个平坦的切面。
- 将脑组织尾端朝上放置在新形成的平坦切面上，使脑的背侧表面与水平线对齐，脑中线与垂直线对齐。
- 将刀片与17o斜线对齐，将刀片倾斜至30o角，进行双重斜切，切除右侧皮层约3 mm的组织（即与水平面成17o，与冠状面成60o）。
- 将脑组织安装至振动切片机载物台上。
- 在脑组织腹侧放置一小块滤纸（1 cm × 2 cm），使其长边方向与脑中线垂直。
- 小心地在挡块前方区域（以及凸起左侧）涂抹少量氰基丙烯酸酯胶水。
- 将经过双重斜切的脑组织切面朝下贴合于胶水上，使脑的尾端和后脑部分支撑在凸起上，脑的右侧紧贴挡块。
- 轻柔地向下按压脑组织，确保整个表面与切片腔充分接触。
3. 获取上丘-丘脑皮层切片
- 迅速取下切片台并放入振动切片机中，向切片台内加入切片液。
- 将刀片与脑组织顶部（腹侧）对齐。
- 从脑组织顶部切除 1–1.5 mm，随后切下 300–500 µm 的脑片，并在切除后评估切片深度。
注意：当丘脑中央核（IC）、内侧膝状体（MGB）和外侧膝状体核（LGN）均可见，且齿状回呈“C”形时，切取 1 至 2 片 600 µm 厚的脑片。参见 图 3A。 - 将脑片放入预热至 32 oC 的孵育室中。
4. 脑片成像
- 黄素蛋白自发荧光成像的准备工作。
- 配制用于在标准电生理记录浴槽中灌流脑片的 aCSF，并用 95% O2/5% CO2 混合气体饱和 aCSF。
- 拉制玻璃电极用于刺激。请注意，多种不同类型的刺激电极和配置（玻璃电极、钨电极、碳纤维电极、单极、双极）均可与黄素蛋白自发荧光成像良好配合使用。
- 打开计算机、相机、显微操作器、光源、刺激软件和图像采集软件。
- 用充氧的 aCSF 灌流记录浴槽，并放置定制的支撑桥（设计详见补充材料），以抬高脑片位置。
注意：灌流速率可根据具体实验装置调整；此处使用 5–15 ml/min。 - 将脑片放入浴槽中，降低液面高度，防止在将特制的网格（harp）覆盖于脑片上时脑片漂起，操作时注意避免网格金属丝覆盖感兴趣的通路（见图1A）。随后升高液面至脑片上方约 1–2 mm，以维持脑片上下均有 aCSF 流动。
注意：如需重新定位，可使用折断的巴斯德移液管末端，或略微升高 aCSF 液面后极其小心地使用镊子操作。 - 将氯化银电极插入盛有 aCSF 的玻璃电极中，将玻璃电极装入显微操作器并连接至刺激隔离器，小心地将玻璃电极置于通向丘脑的内囊/白质区域（见图1A）。
- 黄素蛋白自发荧光图像采集。
- 在蓝光（470–490 nm）照射组织并采集波长高于 515 nm 的荧光信号的同时，以 4 Hz 的频率（使用无限远校正的 2X 宏观物镜（NA 0.13）和相机）连续采集图像 105 秒 ，同时进行电刺激（每次刺激包括在 0.05 Hz 频率下重复 5 次，每次持续 1 秒 的 40 Hz、2 毫秒脉冲）。确保图像既不过暗也不过曝，可参考图3左列图像。
注意：采集时间、采集频率和刺激频率可根据实验需求调整，补充材料中提供的自定义程序可相应修改。 - 将图像导出至 Matlab，并使用补充材料中提供的自定义程序分析图像在 0.05 Hz 频率下的频谱功率。所得图像将显示连接的神经通路。
注意：该自定义程序通过对时间序列中像素值进行快速傅里叶变换生成图像。
- 在蓝光（470–490 nm）照射组织并采集波长高于 515 nm 的荧光信号的同时，以 4 Hz 的频率（使用无限远校正的 2X 宏观物镜（NA 0.13）和相机）连续采集图像 105 秒 ，同时进行电刺激（每次刺激包括在 0.05 Hz 频率下重复 5 次，每次持续 1 秒 的 40 Hz、2 毫秒脉冲）。确保图像既不过暗也不过曝，可参考图3左列图像。
- 钙成像的准备工作。
- 使用直径 3 cm 的培养皿和抬高的培养膜制作小型孵育室，使 aCSF 能同时接触脑片的上下面，并将孵育室置于加热垫上，维持温度约 32 oC。
- 向小型孵育室中加入温热的 aCSF，并缓慢通入 95% O2/5% CO2 混合气体。
- 将 2 µl Pluronic F-127 酸与溶于 48 µl DMSO 中的 50 µg Fura-2AM 混合均匀。
- 将脑片置于抬高的培养膜上，小心使用微量移液器将染色混合液直接滴加在内侧膝状体（MGB）或其他感兴趣结构的上方。
- 覆盖脑片以防止成像前发生荧光淬灭，并让脑片孵育 45 分钟至 1 小时。
- 将脑片转移至预热的保存浴槽中孵育 10–15 分钟 ，以洗去多余染料。
- 按照步骤 4.1.1 至 4.1.6 的方法准备用于刺激和成像丘脑皮层-上丘-丘脑-皮层通路脑片的实验。
- 钙成像图像采集。
- 在 365 nm 光照射组织并采集波长高于 510 nm 的荧光信号的同时，以 10 Hz 的频率（使用 20X 水浸物镜）连续采集图像 25 秒 ，同时进行电刺激（每次刺激包括在 0.2 Hz 频率下重复 5 次，每次 1 个 2 毫秒脉冲）。
- 将图像导出至 Matlab，并使用补充材料中提供的自定义程序分析图像在 0.2 Hz 频率下的频谱功率。所得图像将显示激活的细胞。
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结果
显示了在P15小鼠中获取的上丘-丘脑-皮层小鼠脑切片示例 图2理想的切片应包含中脑和前脑的四个主要听觉结构：下丘（IC）、内侧膝状体（MGB）、丘脑网状核（TRN）和听觉皮层（AC），当刺激下丘时，这些结构均会被激活。图2A）。通过傅里叶分析，测量电刺激频率处的频谱功率，相互连接的脑区会表现出在刺激频率下呈周期性且同步的活动10该方案可用于研究信息的上行传递，特别是以丘脑作为中脑与大脑皮层之间连接枢纽的功能。尽管该方案有助于制备连接性的上丘-丘脑-皮层脑片，并通过引入3D打印技术提供了一套更易于定制的硬件设备，但此处也包含了一个丘脑与皮层之间未实现连接的脑片示例（图2B），以及一种连接模式，即丘脑在黄素蛋白自体荧光成像中未显示出活动图2C）。这很可能是因为该连接位于脑片内部，因此激活不在脑片表面，无法通过黄素蛋白自体荧光成像观察到。尽管存在逆向激活的可能性，但可能性较小。在刺激丘脑皮层投射的白质时，我们并未观察到逆向激活现象。11，且在此刺激范式下，丘脑中的突...
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讨论
本方案描述了对先前报道的p12-20小鼠上丘-丘脑-皮层脑切片技术的改进，用于研究听觉系统中的信息传递1。与其它类似的脑切片制备方法相比，该方法具有多项优势，能够在单一切片中保留更多脑区之间的连接，从而为研究人员提供了新的工具，以理解前脑中听觉核团之间的相互作用与协同关系。相较于我们之前的工作1，本方案进行了几项关键性修改，显著提高了具有完整连接的切片获得率。这些修改包括在水平面上采用略微不同的切割角度（17o，而非20o），在冠状面上增加一个60o的倾斜角度（相对于冠状面），以及在下丘（IC）下方使用更小的垫块（1.5 mm，而非2 mm）。尽管这些改动较小，但经过练习后，切片的成功率和可靠性显著提升，具有连接结构的切片可达到80–100%的获取率。此外，本方案还描述了对切片连接性的快速评估方法，确保在进行后续实验前确认切片的连接状态。由于切片的可靠性增强，未来将更易于将其与疾病模型结合使用，以探究疾病状态下听觉系统发生的变化。
为了优化获得上丘-丘脑-皮层切片的效果，有...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了美国耳聋与其他交流障碍研究所颁发的R03-DC-012125（授予D. A. Llano）和F31-DC-013501（授予B. J. Slater）以及卡弗基金会的支持。
作者感谢 Jason MacLean 和 Matthew Banks 在钙成像技术方面的指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高蔗糖切割液 | 单位为 mM：206 蔗糖，10.0 MgCl2, 11.0 葡萄糖，1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl，pH 7.4 | ||
| 低钙人工脑脊液（aCSF） | 单位为 mM：126 NaCl，3.0 MgCl2, 10.0 葡萄糖，1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl，pH 7.4 | ||
| 人工脑脊液（aCSF） | 单位为 mM：126 NaCl，2.0 MgCl2, 10.0 葡萄糖，1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl，pH 7.4 | ||
| 刺激隔离器 | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | 批号：1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | 批号：144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | 批号：1499369 |
| 大培养皿 | Fisherbrand | 08-757-13 | 100 × 15 mm 培养皿 |
| 小培养皿 | Falcon | 353001 | 35 × 10 mm 培养皿 |
| 抬高式培养膜 | Millicell | PICMORG50 | 用于维持脑片两侧的含氧液体灌流 |
| 黄素蛋白成像荧光滤光片组 | Olympus | UMNIB | 激发光：470–490 nm，二向色镜：505 nm，发射光：515 nm 长通滤光片。 我们发现几乎任何绿色荧光蛋白滤光片组在此均可使用 |
| 钙成像荧光滤光片组 | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365 nm 激发，XF2001 400 nm 二向色镜，XF3080 510 nm 发射 |
| 用于固定脑组织的琼脂 | 3%（质量/体积）水溶液 | ||
| Viper si 立体光刻装置 | 3D Systems |
参考文献
- Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse. J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).
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