修改一个Colliculo - 丘脑鼠脑切片，收纳室部件的3-D打印和多尺度光学成像

Summary

利用多角度切割鼠标小狗大脑，我们在提高先前描述的急性脑切片捕捉之间最重要的听觉脑和前脑结构的连接。

Abstract

大脑处理感官信息的能力取决于上升和下降的投影集。直到最近，研究这两个系统以及它们如何相互作用的唯一方法是使用体内制剂。在包含体感、视觉和听觉系统中的丘脑皮层和皮质-丘脑通路的急性脑切片方面取得了重大进展。通过对我们最近对听觉丘脑皮层切片¹ 的关键改进，我们能够更可靠地捕捉大多数主要听觉中脑和前脑结构之间的投射：下丘 （IC）、内侧膝状体 （MGB）、丘脑网状核 （TRN） 和听觉皮层 （AC）。在保留了所有这些连接的一部分后，我们能够回答详细的问题，以补充可以通过体内制备回答的问题。使用黄素蛋白自发荧光成像使我们能够快速评估任何给定切片中的连接性并指导随后的实验。将此切片与记录和成像技术结合使用，我们现在能够更好地理解当信息上升到皮层时，信息处理如何在听觉前脑的每个点发生，以及下行皮层调制的影响。用于构建切片室组件的 3D 打印允许双面灌注和对切片内网络的广泛访问，并保持充分利用这种制剂的关键广泛连接。

Introduction

在听觉系统，虽然有感官周边和下丘之间的信息实质性加工，有相当大的附加的处理之前到达听觉皮层。我们所知甚少有关如何处理已完成，因此一些关于这种转变让大脑解释传入的感觉信息。除嗅觉，每个感官具有与最初被中继高保真其中下降的信号上升到皮质外设信号非常相似的组织。皮质然后发送突起到下部结构来进一步调节所述输入信息。这种复杂的系统进行了研究，以各种方式在体内以及在一些体外制剂。在前者中，所有的连接都完好，使研究者探测任何组连接，同时控制感觉输入和测量输出在任何给定的区域中。采用这种方法，很少有无法控制的种类繁多的其他投入，包括其他感觉输入，觉醒和重视，以一种强烈的复杂的输出便出现在体外 ，大脑切片被切断捕捉到一个单套的预测，或者两个相连的脑区，这使研究人员，以刺激和评估各种传入或脑区。这些通常是要么丘脑皮层或tectothalamic片，其中任一输入到丘脑或丘脑和其输出到皮层被保留^2-5。这些制剂允许各种各样的药理，电气和光遗传学操作。然而，只有两个脑区，它们主要评估的信息的传送，并且缺乏以评估信息的改造，因为它通过丘脑的能力。另外，网状丘脑突起，其可在关注调制发挥作用^6-9是公关ESENT在此片。在这里，我们展示的改进在我们之前的准备^1，允许各种投入到丘脑研究者控制给予的丘脑盖茨和过滤信息如何以独特的视角。我们夫妇这种新颖的切片准备与黄素蛋白自发荧光成像来评估片连接和大规模活化分析，在丘脑神经元群体分析钙成像，和单细胞记录以测量的各种输入上的单细胞水平的影响。

为了协助维护这些应用广泛的联系，我们还开发了一些垂直切片锚（又名"竖琴"）的修改举行的脑切片的地方，桥梁，以提升切片增强灌注。竖琴被设计成修改马蹄形以包围切片，并允许可定制的连接点为竖琴字符串。三字符串附，使得i）一种位于沿水平方向内侧边缘的切片，ⅱ）从IC到AC的尾部边缘的尾部边缘上的一个延伸，并且iii）一种从斜内侧缘的片的延伸到的区域喙到AC（ 见图 1A）。小凹口在帧胶合（与氰基丙烯酸酯胶）的琴弦允许有减少量的压力中的片上，以帮助保持片完整性的（参见图1B）。通过使用三维印刷，我们能够定制设计竖琴我们独特的规格，以及其允许的上方和下方的组织的人工脑脊液（ACSF）理想的流量桥。这也保持着大面积的光穿透组织的膜片钳电。

Protocol

所有的程序都在伊利诺伊大学批准的机构动物护理和使用委员会。所有动物饲养在批准的实验室动物护理的认可美国协会动物护理设施。每试图尽量减少所使用的动物的数量，并减少痛苦在研究的所有阶段。

1.准备并清除脑小鼠切片

1. 准备灌注和切片孵化。
   1. 大约切片前30分钟，制备高蔗糖裁剪解决方案和低钙学联的前记录或成像切片的培养。
   2. 奠定了所有必要的工具（大钝头剪刀，小弹簧剪刀，镊子解剖，大剪刀​​或断头台，虹膜剪刀，镊子珠宝商10毫升注射器使用27G英寸x 1/2英寸寸毫针，小片1厘米×2cm的过滤器纸，和一破放倒巴斯德吸管于sl冰传输）灌注和切片，并准备灌注托盘。
   3. 建立孵化室含氧学联在32 ^摄氏度的水浴和一个培养皿中充满了切削液。
2. 准备切割阶段切片。
   1. 切一小片3％琼脂的大约1cm ^3作为逆止对大脑和1.5厘米×1.5毫米×3毫米到用于凸块，以用于支撑所述集成电路。
   2. 胶逆止到与氰基丙烯酸酯类粘合剂的阶段以及在右侧的逆止使得它们形成一个^80ø角度的凸起。
3. 取出大脑。
   1. 深深麻醉为P12-P20（理想p14-18）鼠标氯胺酮100 mg / kg和xylaxine 3毫克/千克（或类似的伦理委员会批准的程序）。
      注:经确认缺乏应对脚趾捏适当的麻醉水平。当动物是在麻醉状态下简要地，眼药膏是不必要的。
   2. 使用钝器结束剪刀，从剑突到颈部暴露胸腔。
      1. 找到剑突，并进行了约1.5厘米的横向切断。
      2. 请从以前的水平切口的两端的垂直切到肩膀，约1.5厘米。
   3. 通过在隔膜和肋软骨结切割以暴露心脏。
   4. 随着小弹簧剪刀，做一个小的，2-5毫米切开右心房，从腹侧背心脏的一侧。
   5. 使用10毫升注射器用27G英寸x 1/2英寸英寸针，注入左心室，并迅速灌注高蔗糖切削溶液的动物。
   6. 一旦气血运行清晰，使用较大的剪刀去除头。
      注:我们还没有系统地评估灌注的效用。然而，根据我们的经验，在小鼠这个年轻transcardiac灌注可近100％的成功完成，并且确实有消除红BL的好处洪水细胞，它可以发出荧光，干扰成像。
   7. 切开皮肤下的正中线，露出颅骨。
   8. 使用弯曲虹膜剪，两眼之间的头骨，然后从眼睛的切割，由前精心切割沿中线缝合，注意不要下损伤大脑后侧开始。
      注:通常硬脑膜与颅骨脱落。如果需要的话，前仔细去除脑部取出硬脑膜。
   9. 使用珠宝商钳，撬打开颅骨，小心地取出大脑，然后将大脑中切割解决方案。请注意，以避免损坏皮质。

2.准备的大脑切片

1. 准备的大脑，用于安装在vibratome阶段。
   1. 使用^在 90标有两行的滑动，并在¹⁷ O从左上到右下的顶部的对角线，相交，两条线的满足，将大脑背侧，使用刀片，去除2-4毫米的喙端大脑创造一个平坦的表面上。
   2. 放置脑尾侧上新创建的平坦面，并对准脑的背侧表面与水平和脑与垂直线的中线。
   3. 对齐刀片与¹⁷ O线，倾斜剃刀以^30°角和在一个双对角切口^（17 O从水平面和⁶⁰度从所述冠）除去约3毫米的右皮质。
2. 安装脑上vibratome阶段。
   1. 放置一小片滤纸1厘米×2厘米的脑的腹侧，使得长尺寸垂直于中线。
   2. 小心将少量氰基丙烯酸酯类粘合剂的该地区中的逆止（和凸块的左侧）的前面。
   3. 将双对角切脑面子上的胶水，使脑和后脑的尾部分是PRopped经凸点和右脑的是针对逆止。
   4. 微妙按下上脑，保证整个表面与切片室接触。

3.获取Colliculo，丘脑片

1. 迅速采取切割阶段，发生在vibratome，填补了舞台切割解决方案。
2. 对准脑的顶部（腹侧）的刀片。
3. 从大脑的顶部除去1-1.5毫米，除去300-500微米切片和除去后评估深度。
   注:当IC的MGB，和外侧膝状体（LGN）都是可见的，而齿状回形成一个"C"形持续一到两个600微米的薄片。参见图3A。
4. 将切片加热^（32℃）储存室。

4.成像切片

1. 准备黄素蛋白自发荧光成像。
   <李>在标准电生理记录室准备脑脊液为切片的灌注，气泡脑脊液用95％ _的 O _2/5％CO 2。
   1. 拉玻璃电极的刺激。注意，多个不同的刺激电极和配置（玻璃，钨，碳纤维，单极，双极）所有的工作非常好，在与黄素蛋白自发荧光成像结合使用。
   2. 打开电脑，相机，显微，光源，刺激软件，图像采集软件。
   3. 灌注录音室含氧学联，将自定义的桥（在补充材料提供设计），以提高切片室。
      注:灌注率可与任何个人设置而有所改变， 5-15毫升/分钟在这里使用。
   4. 将切片室，降低液体水平，在室内，防止片从升降桥下车，同时将专门建造的竖琴过片，同时注意避免将琴弦国米的途径EST（ 图1A）。增加液面上述切片大约1-2毫米，以保持上面和下面片脑脊液流动。
      注意:如果重新定位是必要的，使用断头巴斯德吸管或允许脑脊液水平上升，使用镊子格外小心。
   5. 插入氯化银电极为充满脑脊液玻璃电极，插入玻璃电极到显微操纵并连接到刺激隔离器，并小心地在集成电路/白质，导致丘脑玻璃电极（ 见图 1A）。
2. 黄素自体荧光图像采集。
   1. 收集在4赫兹图像（使用无限远校正2X宏物镜（NA 0.13））和相机105秒而电刺激（每次刺激包括1秒40赫兹2毫秒脉冲组织中的0.05赫兹五次）而照亮该组织与蓝光470-490 nm和捕捉以上515纳米。确保图像既不是Ø黑暗，也没有吹出来见图3左边一列，以供参考。
      注:收集时间，收集频率和刺激频率是可以改变的，以适应该实验中，包括在补充材料自定义程序可以被修改为这样。
   2. 出口图像Matlab的，并使用在补充材料中可用的定制编写程序来分析图像的频谱功率在0.05赫兹。由此产生的图像将显示已连接通路。
      注:自定义程序使用在时间序列的快速傅里叶变换的象素值，以产生图像。
3. 准备钙成像。
   1. 使用3厘米的培养皿，并提出培养膜，以允许脑脊液到在加热垫上达到顶部和切片的底部，并置于保持温度在大约^32℃。制备小孵育室
   2. 填写小孵化室温暖学联，慢慢地泡有95％氧气_2/5％CO 2。
   3. 混合2μl的普朗尼克F-127酸和50的Fura-2AM溶解于48微升的DMSO微克。
   4. 在凸起膜，小心使用微量小孵育室地方添加片染色混合物的MGB正上方（或其它感兴趣的结构）。
   5. 覆盖片防止漂白前成像，并且允许切片孵育45分钟 - 1小时。
   6. 取出切片加热保温室10-15分钟，以洗去多余的材料。
   7. 按照步骤4.1.1到4.1.6的准备，以刺激和形象colliculo - 丘脑片。
4. 钙图像采集。
   1. 在10 Hz（使用20X水浸泡的目的），持续25秒采集图像，而在0.2赫兹电刺激（每次刺激包括一个2毫秒的脉冲）组织的五倍，同时照射组织365纳米的光，并捕获上述510纳米的荧光。
   2. 出口图像Matlab和使用在补充材料中可用的定制编写程序来分析图像的频谱功率在0.2赫兹。由此产生的图像将显示出活跃的细胞。

Results

在P15小鼠获得colliculo-丘脑皮层小鼠脑切片的一个例子示于图2中 ，理想的切片将包含四个主要脑和前脑听觉结构集成电路，MGB，TRN，和AC，这些当IC被激发的所有激活（图2A）。使用傅立叶分析，光谱功率的测量是在电刺激频率，以显示活性为周期性和夹带在刺激频率¹⁰连接的大脑区域。该协议允许对信息尤其是在丘脑的脑和皮质之间的关系上升流的研究。而在生产连接colliculo-丘脑切片的这个协议助剂，以及提供一个更容易地定制组硬件与三维打印的掺入，包括的是从丘脑皮层（图2B未连接片的一个例子）， 一个 š以及一个连接图案，其中丘脑不显示与黄素蛋白自发荧光成像（ 图2C）的活性。这可能是由于所述连接是内部的片，使得所述活化不是切片的表面上，并因此而无法看见的黄素蛋白自发荧光成像。有可能虽然不太可能，这是逆向活化。刺激丘脑^突起 11的白质时，我们还没有看到逆行激活，并与丘脑这种刺激范式的突触封锁导致可逆消除皮质信号^1。使用这种片，但也可以...

Discussion

该协议描述了对先前描述的p12-20小鼠丘丘脑皮质脑切片的改进，以研究听觉系统中的信息流¹。与其他类似的脑切片制备相比，这种方法具有许多优势，因为它在单个切片中保留了更多大脑区域之间的连接，这为研究人员提供了了解前脑听觉核之间相互作用和相互作用的新工具。与我们之前的工作¹ 相比，该协议中有一些关键修改，这增加了连接切片的产量。这些修改包括水平面 17^o 与 20^o 略有不同的切割角度，冠状平面增加角度，距冠状面 60^° ，IC 下方的凸起比 2 mm 小 1.5 mm。虽然很小，但这些修改大大提高了方法的产量和可靠性，通过实践，应该在 80-100% 的时间内获得切片。除了获得丘丘-丘脑皮质切片外，该协议还描述了对切片连通性的快速评估，确保切片在进行进一步实验之前已连接。随着切片可靠性的增强，将更容易与疾病模型结合使用，以了解患病状态下听觉系统的变化。

有几个关键步骤可以优化获得丘丘-丘脑皮质切片。虽然可以在出生后第12天到出生后第22天使用小鼠，但在切片中获得完全连接的最...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
高蔗糖切割溶液			（mM）：206 蔗糖、10.0 MgCl2、11.0 葡萄糖、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、0.5 CaCl2、2.5 KCl、 pH 7.4
低钙 aCSF			（以 mM 为单位）：126 NaCl、3.0 MgCl2、10.0 葡萄糖、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、1.0 CaCl2、2.5 KCl、 pH 7.4
aCSF			mM：126 NaCl、2.0 MgCl2、10.0 葡萄糖、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、2.0 CaCl2、2.5 KCl、pH 7.4
刺激隔离器	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	批次： 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	批次：144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	批次：1499369
大型培养皿	Fisherbrand	08-757-13	100 x 15 毫米培养皿
小型培养皿	Falcon	353001	35 x10 毫米 培养皿
凸起的培养膜	Millicell	PICMORG50	用于维持切片两侧的含氧液体灌注。
黄素蛋白成像荧光立方体	Olympus	UMNIB	470–490 nm 激发，505 nm 二向色性，515 nm 发射长通。我们发现，几乎所有绿色荧光蛋白滤光片立方体都可以在这里工作。
钙成像荧光立方体	Omega 光学	BX-18	XF1005 365 nm 出口，XF2001 400 nm 二向色性，XF3080 510 nm 发射
脂，用于封闭大脑			中 3% 重量的大脑
Viper si 立体光刻仪	3D Systems