本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。
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本文内容
摘要
摘要
除了实质性的肝细胞外，肝脏还包含非实质细胞（NPC），即库普弗细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC）。原代人肝细胞（PHH）的二维（2D）培养仍被认为是 "金标准" 用于 体外 药物代谢与肝毒性的测试。众所周知，原代人肝细胞（PHH）的二维单层培养存在去分化和功能丧失的问题。最近研究表明，肝非实质细胞（hepatic NPC）在肝脏（病理）生理学及维持PHH功能方面发挥着核心作用。目前的研究重点在于重建 体内 利用三维共培养模型构建组织结构，以克服二维单层培养的局限性。此前，我们在《实验生物学与医学》杂志上发表了一种分离人肝细胞的方法，并研究了这些细胞用于细胞培养的适用性。1鉴于该技术受到广泛关注，本文旨在提供更为详尽的肝细胞分离操作流程，包括配套视频，以便于该技术的简便重现。
通过两步EGTA/胶原酶P灌注法，从人肝脏组织手术标本中分离人肝细胞。将肝组织灌流液以50 × g离心，初步分离出原代人肝细胞（PHH）与非实质细胞（NPC）。采用密度梯度离心法去除死细胞。利用特定的细胞特性及细胞分选技术，从富集的NPC组分中分离出不同的肝细胞亚群。除分离PHH外，我们还成功分离出库普弗细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC），用于后续培养。
综上所述，本方案可从一个供体组织样本中高质量、高产量地分离出原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞（NPC）。获得纯化的肝细胞群体有助于建立 体内 类似于人类肝脏模型。
引言
人类肝脏组织具有高度复杂性，由两种不同的细胞实体组成：实质细胞和非实质细胞（NPC）。肝脏实质细胞包括肝细胞和胆管上皮细胞。肝细胞占肝脏细胞总数的60%至70%，负责执行大部分肝脏代谢功能， 例如胆汁酸和补体因子的合成、生物转化以及能量代谢2,3。
非实质细胞（NPC）占肝脏总细胞的30-40%。NPC包括多种细胞群体，即库普弗细胞（KC）、肝窦内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC）。这一异质性细胞组分在肝脏的生理过程中发挥着核心作用。此外，NPC还参与介导急性肝损伤 ，例如药物性肝损伤（DILI），以及在肝硬化等慢性肝损伤中发挥作用4。
近年来，人肝细胞在药物测试、药物开发以及肝病中新生化通路鉴定等研究中变得越来越重要。体外测试中，原代人肝细胞（PHH）单层培养仍被视为"金标准"5。当前同型肝细胞模型的主要局限性在于肝细胞在数天内即发生去分化并丧失功能4。三维（3D）培养技术的建立表明，这些局限性可以得到弥补4,6。然而，即使是现代的3D培养技术，也无法完全再现所有肝毒性作用模式7。现有体外模型中非实质肝细胞（NPC）群体的缺失，被认为是导致与体内情况存在差异的可....
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方案
注意：所有细胞均来自部分肝切除术后剩余的非肿瘤性人肝组织，该手术用于治疗原发性或继发性肝肿瘤。患者知情同意书的获取符合柏林夏里特大学医学中心的伦理准则。
1. 材料与溶液的准备
- 提前对所有器械和材料进行灭菌，以避免在分离过程中发生细菌污染。
- 根据表1和表2配制肝脏组织样本灌注、肝细胞与非实质肝脏细胞分离过程以及原代人肝细胞培养所需的溶液，其中消化液（Digestion-Solution）需在使用前新鲜配制。所有溶液均可在4 °C保存，建议在配制后4周内使用。
- 使用0.22 µm瓶顶滤器对所有溶液进行灭菌。
2. 灌注设备的准备
- 按照 图1A 所示设置肝脏组织样本灌注与消化的设备。
- 将水浴温度调节至 39 °C，以确保灌注和消化过程中胶原酶 P 的最佳活性。
3. 肝组织样本的灌注与消化（1.5 小时）
- 从切除的肝组织中选取带有完整格利森氏被膜的组织样本。切割组织样本时，尽量获得较小的切面，并确保血管清晰可见。运输和处理肝组织样本时需置于冰上，以避免热缺血时间。
- 在无菌条件下称取组织重量，将....
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结果
通过密度梯度离心法分离出实质和非实质细胞组分，结合细胞贴壁特性及磁珠分选（MACS）进行纯化处理，可成功分离原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞（NPC）。PHH 和 NPC 均可实现高质量和高产量的分离。图1展示了肝脏灌注与消化所用设备的典型配置。在含有胶原酶 P 的灌注液 II 中添加 10% 胎牛血清（FCS），以降低蛋白酶的蛋白水解活性，同时稳定胶原酶 P 的活性。因此，在分离 NPC 所需的较长消化时间条件下，仍可避免对 PHH 活性产生不利影响。
图1： 灌注与消化装置示意图。<.......
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讨论
已发表的实验方案描述了一种从同一样本人类肝组织中同时高质量、高纯度分离纯化原代人肝细胞（PHH）和非实质细胞（NPC），即库普弗细胞（KC）、肝星状细胞（HSC）和肝窦内皮细胞（LEC）的技术。大多数关于肝细胞分离的研究仅针对上述细胞群中的一种18-20，而使用人源组织进行的分离操作则较为罕见（Damm et al.对此进行了综述）21。将原本建立于动物组织（e.g., 大鼠肝脏）的方法应用于人肝组织时，发现动物与人类细胞群在细胞特性上存在多个差异。在建立涵盖多种肝细胞类型的分离方法过程中发现，由于实质细胞与非实质细胞在消化时间上的需求不同，将两者分离过程相结合是一个关键步骤。为应对这一挑战，我们开发了一种肝细胞分离方案，整合了多种技术，并将其适配于我们既有的PHH分离方案10。
通过在含有胶原酶P的溶液II中添加10% FCS，我们能够降低蛋白酶的蛋白水解活性。该改进使得更长时间的消化成为可能，这对于获得大量NPC是必要的。因此，我们能够同时分离出高质量且高产量的PHH和NPC。.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
我们感谢 Jia Li Liu 在制作图 1 过程中的支持。本研究由德国联邦教育与研究部（BMBF）项目“虚拟肝脏”（Virtual Liver）资助，项目编号：0315741。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 通用设备 | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| 移液器 | Eppendorf | ||
| 显微镜 | Carl Zeiss | ||
| 显微镜 | Olympus | ||
| CO2-培养箱 | Binder | ||
| 层流台 | Heraeus | ||
| Centrifuge Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| 尿液烧杯 | Sarstedt | 2041101 | |
| 50 ml 注射器泵 | B.Braun | 12F0482022 | |
| 瓶顶过滤器 | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml 聚丙烯圆锥管 | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml 聚丙烯圆锥管 | BD Biosciences | 352096 | |
| 组织培养板 | BD Biosciences | 533047 | 24 孔 |
| 血清移液管 | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| 移液器吸头 | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µl, 200 µl, 1,000 µl |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 分离设备 | |||
| 水浴锅 | Lauda | ||
| 蠕动泵 | Carl Roth | ||
| 循环恒温器 | Lauda | ||
| pH 计 | Schott | ||
| 精密天平 | Sartorius | ||
| 支架 | |||
| Büchner 漏斗 | Haldenwanger | ||
| 塑料漏斗 | |||
| 硅胶管 | |||
| 带橄榄头的套管 | |||
| 玻璃皿 | |||
| 镊子 | |||
| 手术刀 | Feather | 12068760 | |
| Neubauer 计数板 | Optic Labor | ||
| 细胞刮 | Costar | ||
| 手术铺巾 | Charité Universitätsmedizin Berlin | A2013027 | |
| 纱布垫 | Fuhrmann | 40013331 | |
| 无菌外科手套 | Gammex PF | 1203441104 | |
| 组织胶 | B. Braun | 1050052 | |
| 玻璃瓶 | VWR | ||
| 胶原酶 P | Roche | 13349524 | |
| Percoll 分离液 | Biochrom | L6145 | 密度 1.124 g/ml |
| Hank’s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15 - 002 | 不含 Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| 白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1,064,041,000 | |
| KCl | Merck | 49,361,000 | |
| Hepes 缓冲液 | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 培养基设备 | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | 低葡萄糖 (1 g/L) (不含 L-谷氨酰胺) |
| HEPES 缓冲液 1 M | GIBCO | 1135546 | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 - 039 | 不含 L-谷氨酰胺 |
| 丙酮酸钠 | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William’s E | GIBCO | 32551-020 | |
| 含 GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| 人胰岛素 | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| 胎牛血清 (FCS) | PAA | A15-101 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 免疫染色设备 | |||
| CD 68 | R&D Systems, USA | 单克隆 | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | 多克隆 |
| CK18 | Santa Cruz | K2105 | 单克隆 |
| Vimentin | Santa Cruz | 单克隆 | |
| GFAP | Sigma Aldrich | 单克隆 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| 羊抗小鼠 IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| 羊抗兔 IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| 甲醇 | J.T.Baker | 1104509006 | |
| 4% 甲醛 | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
参考文献
- Pfeiffer, E., et al. Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Exp Biol Med. , Maywood. (2014).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev Cell. 18 (....
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重印与许可
