协议主要人肝细胞的分离和相应的非实质肝细胞的主要种群

摘要

描述了一种从同一供体中分离人肝细胞和非实质肝细胞的技术。不同的肝细胞类型为功能性肝脏模型和组织工程奠定了基础。这种新方法旨在以高产量和活力分离肝细胞。

摘要

旁肝实质细胞，肝脏由非实质细胞（NPC）即Kupffer细胞（KC），肝内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC）的。原代人肝细胞（PHH）的二维（2D）文化仍然被认为是"黄金标准"的体外药物代谢和肝毒性的测试。它是众所周知的，PHH的2D单作从去分化和功能丧失缺点。最近已表明肝鼻咽癌在肝（病理）生理学中心作用和PHH功能的维持。目前研究的重点体内组织架构的重建由3D-共培养模式，以克服单一种植2D的局限性。先前我们发表以分离的人肝细胞的方法，并研究这些细胞的适合其在细胞培养物中的实验生物学和医学¹使用。基于此TE的广泛兴趣chnique本文的目的是提供用于肝细胞分离过程包括视频，这将允许该技术的一个简单的再现的更详细的协议。

人肝细胞从外科手术的人肝组织样品通过一个两步EGTA /胶原酶P灌注技术分离。 PHH从人大通过的初始离心50×g的分离。被用于去除死细胞的密度梯度离心的步骤。个人肝细胞群体从富集的人大分数使用特定的电池特性和细胞分选程序中分离。旁边的PHH隔离，我们能够分离KC，LEC和HSC进一步培育。

总之，所提出的协议允许PHH和NPC的从一个供体组织样本的高品质和数量的隔离。纯化的肝细胞群的访问可以让人类像李创造体内版本车型。

引言

人肝组织是高度复杂的，由两个不同的细胞的实体，实质细胞和非实质细胞（NPC）的。实质肝细胞包括肝细胞和胆管。肝细胞代表总肝细胞的60至70％，占大部分的代谢肝功能， 例如，胆汁酸和补体因子的合成，生物转化和能量代谢^2,3。

较小的人大馏分构成总肝细胞的30​​-40％。鼻咽癌包括不同的细胞群，即Kupffer细胞（KC），肝内皮细胞（LEC）和肝星状细胞（HSC）。此异种细胞部分起着在肝脏的生理过程中心作用。此外，NPC参与调解急性肝损伤， 如药物性肝损伤（DILI）以及慢性肝损伤，如肝硬化^4。

近年来，高度乌曼肝细胞在肝脏疾病已成为研究和药物测试，药物开发和新的生化途径鉴定发展，越来越多的关键。对于体外试验PHH单一种植仍被认为是"黄金标准^"5。电流同型肝模型的主要限制是在几天内⁴去分化和肝细胞功能的丧失。的3维（3D）培养技术建立已经表明这些限制可以补偿^4,6。然而，即使现代3D培养技术是无法显示的操作⁷所有肝毒性模式。缺少鼻咽癌种群在现有的体外模型作为一个可能的原因这种差异的体内情况进行讨论。已经表明，不同的肝细胞群体之间的细胞 - 细胞通讯起着生理动态平衡中发挥中心作用，而且在pathophysiologic处理^8。因此，科学的关注重点越来越多的NPC和细胞间的相互作用。它们在共培养和组织工程化的系统目的的用途可能是用于体外肝模型^8,9-这是因为接近尽可能体内情况的高需求的解决方案。

目前的主要挑战是标准化的人类肝脏共培养模型，其中包含PHH和NPC的明确规定部分的发展。结果，需要为非常异种肝细胞的分离技术和那些必须被优化以获得纯的细胞群。虽然有¹⁰ PHH隔离标准化的协议，人类NPC的标准化隔离仍在发展。大多数公布鼻咽癌隔离协议是基于与非人类细胞^11,12实验。只有少数出版物描述人类鼻咽癌的隔离工艺和最多只是覆盖键入^11-16用于单个细胞的分离方法。已被利用用于细胞分离的最重要的细胞特征是尺寸，密度，附着行为，和表面蛋白的表达。在这些特征的基础上，我们开发了一个简单的协议来隔离PHH，KC，LEC和HSC，这是在实验生物及医学 ¹先前公布。因为在这种技术的广泛兴趣的，本文的目的是提供用于肝细胞分离过程包括视频，这将允许更容易地再现的技术中的更​​详细的协议。该协议还包括用于产量和活力的评价以及利用特定immunostainings鉴定和纯度评估质量控制方法。

方案

注:所有细胞从手术非肿瘤性人肝组织，这仍然偏后肝切除原发或继发肝肿瘤隔离。 Universitätsmedizin柏林 - 根据查理特的道德准则，得到患者的知情同意。

1.材料和解决方案的研制

1. 消毒所有仪器和材料事先避免在隔离过程细菌污染。
2. 制备用于肝组织样品，肝细胞和非实质肝细胞的分离方法，并根据表1和2中的原代人肝细胞培养的灌注所需的解决方案，这是新鲜制备的消解解的例外在使用之前。所有的解决方案可以被存储在4℃下，建议制备后4周内使用它们。
3. 消毒采用0.22微米瓶顶过滤器的所有解决方案。

2.灌注设备的研制

1. 设置的设备的肝组织样品的灌注和消化， 如图1A所示 。
2. 调节水浴温度至39℃，以确保灌注和消化过程中最佳胶原酶P活性。

肝组织样品的3灌注和消化（1.5小时）

1. 选择与来自切除肝组织完整Glisson囊的组织样品。当切割组织样本，尝试得到具有良好可见血管的小的切割表面。在运输和冰上处理肝脏组织样本，直到血流灌注，避免热缺血时间。
2. 取组织重量在无菌条件下，并放置在肝组织样品中的空气层流培养皿。清洁组织样品的表面与来自重无菌压缩剩余的血，并使用1×灌注-溶液I，以确保所有的套管都是可渗透冲洗套管组。
3. 使用组织胶固定套管的橄榄在一些较大的血管。取决于肝组织样品的大小和表面上的血管的数量，使用的插管具有3至8的插管设置。测试灌注及检查泄漏。关闭所有的血管，从而泄露明确1X灌注的解决方案我，用纸巾胶水。
4. 放置插管肝组织样本进入其穿孔的过滤盘（ 图1A）上的布氏漏斗。
5. 置7.5毫升/分钟，这取决于所用的插管的数目和对肝脏组织的电阻14.6毫升/分钟之间的蠕动泵的流速。每次调节流速，以确保有电流通过，但缓慢灌注。灌注所述组织，直到全血冲洗出来，但至少20分钟。观察组织具有良好的perfusi区域变得更亮上。
   注意:在某些情况下，可能有必要以夹紧用塑料夹具插管之一或通过与针对肝包膜抹刀轻轻推动以增加面积的内压，以优化灌注。一个完整的颜色更改为浅黄色至浅棕色的颜色表明了良好的灌注。
6. 改变灌注流体含有胶原酶P（ 表1）消化-解。
7. 重新排列为消化步骤的安装（ 图1A）。因此，根据图1B进行长达15分钟消化溶液的循环流动。
   注:关键是要立即停止灌注时肝组织样本被充分消化。一个好的消化可以观察到，当组织没有显示出弹性的迹象由维修胶囊变形的评估中，当用刮刀推动。

4.隔离肝细胞（1小时）

1. ŧ瓮蠕动泵关闭并将肝组织样品中的玻璃培养皿中。冲洗组织样品的外部用冰冷的停止溶液（ 表1）。取下肝脏组织样本插管。使用解剖刀打开肝组织样品，通过在将插管附着的区域的中间切开。请注意使Glisson's胶囊保持不变。
2. 冲洗组织样品的内部再涂用冰冷的停止 - 解整个组织样品。轻轻摇动组织释放出的细胞组织的。
3. 收集细胞悬浮液，并通过一个视线漏斗（塑料漏斗用纱布压缩衬里）到50ml塑料管中过滤。添加更多的停止 - 解肝组织样品，直到500 ml的终体积被消耗。
4. 离心细胞悬浮液，在50 XG，5分钟，4℃。收集后非实质细胞分离上清。用PBS（ 图2洗细胞沉淀A）。
5. 在50 XG，5分钟，4℃再次离心细胞悬浮液。收集上清液并重新悬浮在肝细胞孵育培养基中的小球（ 表2， 图2B）。
6. 确定在使用台盼蓝染色得到的细胞悬浮液中的细胞数量和生存力。算上在Neubauer计数室的生活和死亡的细胞。计算PHH的使用下面的公式细胞数，存活力和产量。
   
   细胞悬液（毫升）的产量（计数细胞）=计数细胞×稀释系数x数量×万
   
   产率（肝/（每克肝组织样品））=（细胞悬浮液（毫升）产率（肝/（毫升培养基））×体积）/（重量肝组织样品（G））
   
   存活率（％）= 100％×（数活细胞）/（总细胞数）

5.肝细胞的纯化（1小时）

注:建议该纯化步骤中，如果存活力是低于70％。

1. 执行冰的所有步骤。通过混合5毫升密度梯度溶液和15ml PBS中密度梯度离心制备的25％的密度梯度。
2. 小心缓慢地把一个最大50宇细胞共出肝细胞丰富细胞悬浮在25％的密度梯度层的顶部，以确保这两个层的一个明确分开实现（ 图2C）。小心翼翼地把管放入离心机离心1250 XG，20分钟，4℃不带刹车（ 图2D）。
3. 吸出剩余的细胞悬浮液，并在相间的死细胞。取决于脂肪内容的一个可能也吸出密度梯度的溶液。
   注:PHH低脂肪含量形成致密颗粒和密度梯度可以完全被吸出。 PHH具有高脂质含量形成更弥漫粒料和大量活细胞可保留在颗粒上面的密度梯度溶液中。
4. 在50 XG，5分钟，4℃再次重新悬浮，用PBS离心肝细胞粒料。池小球，用PBS洗一遍，并在肝细胞培养液重新悬浮纯化PHH。如步骤4.6中所述进行细胞计数。

6.培养肝细胞

1. 通过用细胞外基质涂覆它们，例如鼠尾胶原（I型胶原）准备PHH的播种的细胞培养皿。根据由拉詹等人建立的协议准备的鼠尾胶原^。17
2. 在PBS 200的稀释:鼠尾胶原蛋白原液1。转移100微升/厘米²鼠尾胶原溶液放入培养皿，照顾整个表面被覆盖。孵育细胞培养物塑料在室温下20分钟。吸剩下的鼠尾胶原溶液。
3. 种子15×10 ⁴肝细胞/厘米²的肝细胞培养液对文化dishe包被的有鼠尾胶原蛋白。培养在湿润的培养箱将细胞在37℃，5％CO ₂的至少4个小时。 4小时后的肝细胞已经粘附和介质是可以改变的。
4. 根据使用的实验装置的调查。建议48小时的培养时间，以使细胞从隔离过程中恢复。

7.隔离非实质肝细胞（1.5-2小时）

1. 离心机72 XG，5分钟，4℃收集的上清液（步骤4.5和4.6），以消除剩余的红细胞和肝细胞。池上清液并离心他们两次以获得两个细胞丸粒:300 XG，5分钟，4℃的HSC，LEC和部分的KC和650 XG，7分钟，4℃对剩余的KC沉降的沉淀。
2. 在HBSS池既颗粒和重新挂起他们。制备25％，通过将密度梯度溶液和PBS对密度梯度centrif 50％的密度梯度ugation（25％的密度梯度溶液分配:5ml密度梯度溶液和15ml的PBS，50％的密度梯度溶液:10毫升密度梯度溶液和10ml的PBS，参见图2）。小心地将25％的密度梯度溶液的50％的密度梯度溶液层的顶部。
3. 小心缓慢地把全国人民代表大会停牌的25％的密度梯度溶液层的顶部，这两个层的明确分离实现的一种方式。
4. 在离心机在1800 XG，20分钟，4℃不带刹车（ 图2.2）密度梯度的细胞悬液。
5. 吸死细胞和从最上层的细胞碎片。人大位于25％和50％的密度梯度层（ 图2）之间的间期。收集鼻咽癌，用HBSS和离心机洗应用上述双离心步骤的细胞悬浮液（步骤7.2）。

8.分离枯否细胞（粘附分离工序）（1小时）

1. 如步骤4.6中所述进行该KC在NPC馏分细胞计数。 （对于悬浮KC的外观见图3B）。离心机人大馏分用上述双离心步骤（步骤7.2）和重新悬浮人大在枯否细胞接种培养基（ 表2）。
2. 种子以5×10 ⁵的KC / cm ²的密度在塑料细胞培养容器对KC含有级分。孵育KC培养物在加湿培养箱中20分钟，在37℃，5％ _的 CO _2。主KC附着在细胞培养物塑料的短时间（ 图2.3）之内。
3. 收集含有不遵守NPC上清为主的LEC和HSC。池LEC以后分离上清液（见第9）和HSC（见第10）。用HBSS洗粘附KC，并在37℃，5％CO培养他们在枯否细胞培养基（ 表2）₂在加湿培养箱。

9.分离内皮细胞（1.5小时）

1. 离心机在300 xg离心，5分钟，4℃收集的上清液（步骤8.5）。用PBS洗沉淀。在300 XG，5分钟，4℃再悬浮在星状细胞/内皮细胞分离培养基中的细胞，并如在步骤4.6中描述的所有剩余细胞进行细胞计数离心后。
2. 重悬在1毫升星状细胞/内皮细胞分离液1×10 ⁷神达细胞，加入20微升来自MACS-KIT封闭液和20微升的CD31微珠为免疫标记，并在4孵育所得的悬浮液15分钟°C的温度（ 图2.4）。
3. 作为磁激活细胞分选系统MACS（ 图2.5）在manufacturer's议定书中所描述的HSC单独LEC。磁洗脱保留CD31阳性LEC和星状Ç他们暂停ELL /内皮细胞培养基（ 表2）。
4. 如步骤4.6中所述进行细胞的计数LEC。在1.25×10 ⁵细胞/ cm ²的涂有鼠尾胶原细胞培养容器的密度种子LEC（参见步骤6.1）。培养细胞在37℃，5％CO ₂在加湿培养箱。

10.分离星状细胞（0.5小时）

1. 未标记的HSC的MACS过程中通过分离柱。收集HSC分数（见步骤9.5， 图2.5）。如步骤4.6中所述进行细胞计数。
2. 用5×10 ^4个细胞/ cm ²的细胞培养容器涂有鼠尾胶原的密度种子HSC（参见步骤6.1）在星状细胞/内皮细胞培养基（ 表2），并在37℃，5％加以培养_的 CO ₂在加湿培养箱。

表1: 灌注和隔离解决方案。

表2: 培养和分离介质。

结果

分离成一个实质和非实质级分，使用密度梯度离心作为清理过程与使用的附着性和MACS的结合导致成功PHH和NPC隔离。 PHH和NPC可以在高的质量和数量进行分离。 图1示出了设备的肝灌注和消化的代表性设置。 10％FCS中加入含灌注胶原酶对 - 溶液II降低蛋白酶的蛋白水解活性，并在返回到稳定胶原酶P活性。在鼻咽癌隔离所需结果更长的消化时间可以在不PHH的可行性产生负面影响被应用。

图 1: 灌注和消化设置的第一灌注步骤是在奥德进行R以除去残留的血液，热身组织并除去^的 Ca ²⁺通过使用1倍灌注溶液I（PI）（A）中，以...

讨论

已发布的协议描述的技术来分离纯PHH和NPC，即KC，HSC和LEC，在从人肝脏组织的相同样品的高质量和纯度同时。大多数处理肝细胞隔离出版物只包括与人体组织进行的细胞群^18-20和分离方法之一是罕见的^21条 （达姆等回顾）。与动物组织（如大鼠肝脏），以人类肝脏建立的方法适应揭示了动物和人类细胞群之间的单元格属性一些差异。覆盖不同的肝细胞群体肝细胞的分离方法的建立显示，组合实质和非实质细胞分离是关键的一步，由于在用于优化的结果所需的消化时间差。面对这一挑战，我们开发了一种肝细胞分离协议结合不同的技术和适应了本身我们PHH隔离协议^10。

通过加入10％FCS的含有溶液II胶原酶的P，我们能够降低蛋白酶的蛋白水解活性。此修改允许更长的消化时间，必需取得高数量的NPC。其结果是，我们能够隔离PHH以及质量好全国人大和高量。成功的肝细胞分离初始质量组织的强烈依赖。供体的数据和病历可以影响细胞的质量和数量。根据我们的经验有一个与捐赠者的具体因素无相关性，也非常有经验的工作人员可以面对失败的细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
通用设备
PIPETBOY	Eppendorf
移液器	Eppendorf
显微镜	Carl Zeiss
显微镜	奥林巴斯
CO2 培养箱	粘合剂
Lamin Air	Heraeus
离心机 Varifuge 3.0R	Heraeus
尿液烧杯	Sarstedt	2041101
灌注器注射器 50 ml	B.Braun	12F0482022
瓶顶过滤器	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml 聚丙烯锥形管	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml 聚丙烯锥形管	BD Biosciences 352096
组织培养板	BD Biosciences 533047		24 孔
血清移液管	BD Biosciences	357525、357551、357543	25 ml、10 ml、5 ml
移液器吸头	SARSTEDT	0220/2278014、0005/2242011、0817/2222011	100 µL、200 和微量;l、1,000 和微量;l
名称	公司	>目录号	注释
隔离设备
水浴	Lauda
蠕动泵	Carl Roth
循环恒温器	Lauda
pH 计	Schott
精细秤	Sartorius
支架
Büchner funnel	Haldenwanger
塑料漏斗
橄榄尖
的硅胶管
玻璃盘
镊子
手术刀	羽毛	12068760
Neubauer 计数室	Optic Labor
细胞提升器	Costar
Surgical Drape	Charité大学ätsmedizin Berlin	A2013027
压缩	Fuhrmann	40013331
无菌手术手套	Gammex PF	1203441104
纸巾胶	B. Braun	1050052
玻璃瓶	VWR
胶原酶 P	罗氏	13349524
Percoll 分离液	Biochrom	L6145	密度 1.124 g/ml
Hank's BSS	PAA	H00911-3938
杜尔贝科's PBS	PAA	H15 - 002	不含 Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	默克	1,064,041,000
KCl	默克	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
名称	公司	目录号	评论
媒体设备
DMEM	PAA	E15-005	低葡萄糖 （1 g/L）（不含 L-谷氨酰胺）
HEPES 缓冲溶液 1 M	GIBCO	1135546
L-谷氨酰胺	GIBCO	25030-024	200
mM MEM NEAA	GIBCO	11140-035
青霉素/链霉素	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	不含 L-谷氨酰胺
丙酮酸钠	GIBCO	1137663	100 mM
台盼蓝解决方案	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William's E	GIBCO	32551-020
与 GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
人胰岛素	Lilly	HI0210	100 IE/ml
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165-5G
胎牛血清 （FCS）	PAA	A15-101
名称	公司	目录号	评论
免疫染色设备
CD 68	R&D Systems， USA		单克隆
CK 19	Santa Cruz	D2309	多克隆
CK18	Santa Cruz	K2105	单克隆
Vimentin	Santa Cruz		单克隆
GFAP	Sigma Aldrich		单克隆
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
山羊抗小鼠 IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
山羊抗兔 IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
甲醇	J.T.Baker	1104509006
甲醛 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma Aldrich	A7906-100G