一种用于表征原代多发性骨髓瘤细胞药物敏感性的类器官高通量系统

摘要

我们描述了一种用于原代多发性骨髓瘤细胞的高通量药物敏感性检测方法。该方法包括在多孔板中重建骨髓微环境（包含细胞外基质和基质细胞），以及一种对细胞活力进行纵向定量的非侵入性方法。

摘要

在本研究中，我们描述了一种结合了新型方法的策略 离体 药物敏感性检测与数字图像分析用于评估患者来源的多发性骨髓瘤（MM）细胞的化疗敏感性及异质性。该方法将直接从骨髓穿刺液中分离的原代MM细胞接种于多孔板中集成的微流控腔室，每个腔室均重建了骨髓微环境，包含细胞外基质（胶原或基底膜基质）以及基质成分（患者来源的间充质干细胞）或人源性内皮细胞（HUVECs）。腔室中加入不同药物及浓度处理，并在配备数码相机的电动显微镜下，通过明场显微镜连续成像96小时。数字图像分析软件通过细胞膜运动的有无识别活细胞与死细胞，生成细胞存活率随药物浓度和作用时间变化的曲线。我们采用计算模型确定肿瘤群体对每种药物的化疗敏感性参数，以及亚群数量作为肿瘤异质性的度量。这些针对患者的个体化模型可用于模拟治疗方案并预测临床疗效。

引言

本方法旨在表征多发性骨髓瘤（MM）原代细胞对一系列药物的敏感性 离体尽可能接近生理条件，并具有足够的精确度，以利用这些结果识别肿瘤负荷中具有化疗耐药性的亚群，并最终为旨在预测临床反应的计算模型提供参数。

计算模型是分析复杂系统（如癌症-宿主-治疗相互作用）的有力工具。然而，模型的准确性取决于用于参数化的数据质量。遗憾的是，文献中大多数现有数据由于通常是在互斥的实验条件下获得的，因此无法直接用于此类模型的参数化。因此，通常需要设计新的实验，以获取所需的一组实验参数。然而，大多数细胞活力检测方法具有破坏性，因而只能在少量时间点进行检测，通常仅有一个时间点。这严重限制了化学敏感性检测在计算模型参数化中的应用，因为这类实验无法提供系统时间动态变化的信息。对于原代癌细胞而言，这一问题尤为突出：每份样本通常仅有数百万个细胞，且在活检后存活时间较短，从而限制了可实施的实验条件数量。此外，大多数细胞活力检测在定量时需要将癌细胞与非癌细胞（基质细胞）分离，这不仅增加了实验操作步骤，进一步干扰了细胞状态，也限制了可开展的实验数量。

40年前，Salmon 及其合作者¹ 提出了他们著名的 体外 用于评估肿瘤细胞化疗敏感性的集落形成实验。遗憾的是，由于在对照条件下能够形成集落的多发性骨髓瘤（MM）患者样本数量较少，该实验的应用效果有限：据估计，仅有极小亚群（0.001%至0.1%）的MM....

方案

以下所述使用来自活检的人类细胞的研究已获得莫菲特癌症中心机构审查委员会的批准，并在位于H. Lee Moffitt癌症中心和研究机构进行的临床试验MCC# 14745下开展。

1. 从骨髓穿刺液中分选多发性骨髓瘤细胞

1. 用含钠肝素的注射器采集患者骨髓穿刺液（20 ml）。
2. 将骨髓液用无菌 PBS 等体积稀释后，置于无菌水相密度梯度介质上，以 400 × g 离心 30 分钟，室温下分离单个核细胞。
3. 收集界面层细胞，其中含有单个核细胞。用预冷的 PBS 洗涤细胞，并使用台盼蓝染色法通过血细胞计数板或自动细胞计数仪计数并评估细胞活力。
4. 制备薄层细胞涂片¹⁰，采用 Wright-Giemsa 染色法评估浆细胞比例¹¹。
5. 根据细胞数量和浆细胞比例计算所需 CD138 磁珠的用量。若起始样本中浆细胞比例低于 20%，则每 5 × 10⁶ 个细胞使用 90 µl 分离缓冲液和 10 µl CD138 磁珠重悬细胞；若起始样本中浆细胞比例高于 20%，则每 1 × 10⁷ 个细胞使用 80 µl 分离缓冲液和 20 µl CD138 磁珠重悬细胞。
6. 将细胞与磁珠在 4 °C 条件下孵育 15 分钟。
7. 将细胞通过置于磁性分离器中的预润湿分离柱（LS 柱）并使用 35....

结果

实验流程简要描述如下 图1如果所有步骤均成功完成，显微镜下获得的图像应相当于 图2：活的MM细胞应清晰地显示为明亮的圆盘状，而BMSCs或HUVECs在背景中几乎不可见且分布良好。如图所示 图2A，MM细胞的大小因患者而异，但总体上小于细胞系。由于它们几乎不进行复制 离体 在实验间隔期（96 小时）内，可接种较高浓度的细胞（1–3×10⁶ 个细胞/ml）。基质应几乎不可见，因为骨髓间充质干细胞（BMSC）会贴附于孔板底部并伸展，呈现较低的形态特征。人骨髓瘤细胞系 H929 显著大于患者来源的多发性骨髓瘤（MM）细胞。图2B），并在24小时内进行重复实验。为避免图像过于密集，MM细胞系以较低密度接种，即0.3×10⁶个细胞/ml。 图2C 和 二维 分别代表患者来源的多发性骨髓瘤（MM）细胞和人骨髓瘤细胞系H929，与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养。HUVECs首先贴附于孔板底部，随后开始相互接触并形成网络结构，.......

讨论

总之，这是一种强大且高通量的方法，可用于定量评估原代多发性骨髓瘤细胞的化学敏感性 离体 骨髓重建中药物的药效动力学。本方案中的关键步骤是正确接种孔板和适当的聚焦（参见 图2 为获得预期结果，请确保骨髓瘤细胞和基质细胞均匀分布，基质细胞贴壁于孔底，所有骨髓瘤细胞处于同一焦平面，且骨髓瘤细胞呈现为周围环绕暗环的明亮圆盘状形态。

如果接种不当（参见图5），请勿继续实验，而应重新接种第二块培养板。若发现基质细胞（MM）或间质细胞密度过低或过高，应在接种前检查细胞悬液的浓度，并在接种过程中定期重悬，以确保细胞在培养基中均匀分布。使用带重复功能的多通道移液器或自动化分液仪可显著减少此类问题。本实验所用细胞/基质与培养基的比例（1:10）旨在最大化可接种的孔数，从而增加可研究的实验条件。然而，若需研究癌细胞或间质细胞产生或消耗的可溶性因子，建议将细胞/基质与培养基的比例调整为1:1。

目前，该系统仅能定量非黏附细胞。为了定量间质细胞数量的变化，需要对该软件.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	配备电动载物台和台式培养箱的数字显微镜。
384孔 CellBind 板	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 孔板 384 孔板，聚苯乙烯材质，CellBIND 表面处理，无菌，透明平底，黑色，带盖
1,536 孔 CellBind 板	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536 孔板，低底，CellBIND 表面处理，无菌
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	用于体外分离人外周血淋巴细胞。
CD138 磁珠	Miltenyi	130-051-301	用于富集 CD138+ 细胞的抗体偶联磁珠。
LS 柱	Miltenyi	130-042-401	用于细胞分离的层析柱。
MidiMACS 分离器	Miltenyi	130-042-302	用于分离柱的磁铁装置。
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	源自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤的细胞外基质凝胶（ECM Gel）
Getrex	Life Technologies	A1413201	无LDEV、低生长因子的基底膜基质
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	人脐静脉内皮细胞（HUVEC）
RPMI-1640 培养基	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 培养基 + L-谷氨酰胺 + 酚红
经热灭活的 FBS	GIBCO	10082-147	胎牛血清，经认证，热灭活，源自美国
3.1 mg/ml 牛 I 型胶原蛋白	Advanced Biomatrix	5005-B	牛 I 型胶原蛋白溶液，3 mg/ml，100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	自动化移液工作站系统