小鼠离体乳头肌收缩力测量用于心肌变力性研究

摘要

小鼠左心室乳头肌可用于在体外研究心脏收缩功能。in vitro。本文详细描述了用于研究心脏收缩特性的组织分离与实验操作步骤。

摘要

从成年小鼠心脏分离的乳头肌可用于研究不同生理/病理条件下心肌的收缩功能。该方法可在排除血管张力或神经体液状态等外界因素影响的情况下，独立评估心肌的收缩特性。该技术介于分离心肌细胞的单细胞测量与 体内 超声心动图等研究。因此，乳头肌标本是研究心脏生理学/病理生理学的优良模型，可用于药物干预效应的调节研究或转基因动物模型的探索。本文介绍一种分离小鼠左侧前乳头肌的方法，用于在器官浴装置中研究心脏收缩功能。与从心室壁分离的肌条标本相比，乳头肌的制备更为可行 整体上 不会严重损伤心肌组织。器官浴槽装置包含多个温度可控、通气并配有电极的器官浴槽腔室。分离出的乳头肌固定于器官浴槽腔室内，并施加电刺激。通过压力换能器记录诱发的收缩力，分析收缩力幅度和收缩动力学等参数。可采用不同的实验方案，研究钙离子浓度依赖性和频率依赖性收缩功能，以及儿茶酚胺或其他药物等收缩剂的剂量-反应曲线。此外，还可模拟急性缺血等病理状态。

引言

研究离子通道等蛋白质在心肌收缩功能中的作用，对于揭示不同疾病的病理机制以及建立缺血和心力衰竭等心脏疾病的新治疗策略至关重要。

哺乳动物心肌细胞的收缩功能已知受多种离子通道、转运体及其他蛋白质的调节。动作电位引发的电压依赖性肌膜L型Ca²⁺ 通道导致Ca²⁺ 来自细胞外空间的内流，随后进入 Ca²⁺诱导的 Ca²⁺ 钙诱导钙释放（CICR）¹，从而引发细胞收缩². Ca²⁺信号转导在心肌收缩力以及对生理或病理应激的适应中起核心作用。儿茶酚胺激活心肌β-肾上腺素能受体，从而刺激腺苷酸环化酶（AC）合成cAMP。蛋白激酶A（PKA）被激活后，可磷酸化多种细胞内及膜相关蛋白，如L型Ca²⁺通道²⁺ 通道、磷兰蛋白和雷诺丁受体，导致Ca的修饰²⁺ 瞬时反应与心脏收缩力^1,3,4cAMP 被磷酸二酯酶（PDE）降解。除β-肾上腺素受体外，其他Gs偶联受体的激活也可导致cAMP积累。

离体心室肌条收缩力测定技术在较大型哺乳动物中已得到广泛应用^5-8。鉴于小鼠基因靶向操作的可行性，建立用于分析小鼠心脏生理功能的方法显得尤为重要。然而，目前关于小鼠离体心肌组织生理特性的研究数据因实验条件不同而存在差异^9-12。

所述方法用于分析左心室乳头肌标本的心肌收缩力 体外在不受影响心肌收缩力因素干扰的情况下进行心肌收缩力的检测 体内，如血压、神经体液刺激以及生理或代谢应激。可以明确定义并任意改变收缩肌肉标本的搏动频率。在特定刺激条件下（如钙离子浓度、搏动频率或温度），可对收缩力进行分析。此外，通过控制上述实验条件，该方法还可用于研究不同信号通路组分，并比较经基因修饰的小鼠模型的心脏功能表现。

方案

注意：分离操作的基本步骤如图 1所示。以下方案中将详细描述所有步骤。乳头肌的分离、在器官浴槽中的安装、信号采集与分析需按顺序在规定的时间范围内连续进行。

所有动物实验均依照德国动物保护法规进行，并已获得海德堡大学伦理审查委员会的批准。

1. 仪器准备

1. 进行收缩性测量时，使用多腔室器官浴槽装置。该装置的组成部分包括 离体 收缩性器官浴装置的设置如图所示 图2.
   注意：为尽量缩短乳头肌制备与实验方案开始之间的时间，应在采集实验组织前预先设置好仪器并准备好缓冲液。这样可最大程度地保持组织的活性，以确保有充足的时间进行实验。
2. 启动计算机和数据采集设备。打开器官浴槽加热装置（预设为 32 °C），并让设备达到预设温度。
3. 准备采集设备。按照软件手册中的说明开始记录数据。
4. 检查并根据需要对每个通道进行校准，然后将所有通道归零，以标准化各测力传感器（与相应通道相关联）输出的电信号，校准至由经认证的砝码提供的2克力。
5. 打开气体供应（95% O₂）₂/5% CO₂₂) 加入器官浴槽室中。在整个实验流程的测量期间，持续向所有槽室通入气体。

2. 缓冲液与生理溶液的制备

1. 配制Krebs-Henseleit缓冲液，使其终浓度为119 mM NaCl；25 mM NaHCO₃；4.6 mM KCl；11 mM 葡萄糖；1 mM Na-丙酮酸盐；1.5 mM CaCl₂；1.64 mM MgSO₄；1.18 mM KH₂PO₄，并调节pH至7.4（见表1 生理溶液）。
2. 另配制一份用于细胞分离的Krebs-Henseleit缓冲液，如步骤2.1所述，并额外添加30 mM 2,3-丁二酮单肟（BDM）和50 IE 肝素/mL。将溶液冷却至4°C（见表1 分离用溶液）。如需模拟缺血条件，请按表1所述配制缺血溶液。
3. 对于Ca²⁺-依赖性收缩力实验，将Ca²⁺加入Krebs-Henseleit缓冲液中，达到所需终浓度。
   注意：这些溶液应在使用前现配，并用碳氧混合气（carbogen）饱和，以防止碳酸钙沉淀。使用前将溶液预热至32°C。

3. 乳头切除术中使用的通气管和解剖皿的准备

1. 在专业操作下，将一根软质充气管（外径 2-4 mm）连接至气体接口（100% 氧气，或 alternatively 使用碳合气体）。
2. 将充气管在解剖皿内形成一个闭合环路。在充气管上穿刺多个小孔，以确保持续产生气泡。此充气管可多次使用。
3. 准备底部带有硅胶弹性体（厚度 0.5 cm）的解剖皿，以便可将大头针插入其中。此解剖皿可多次使用。

4. 小鼠左前乳头肌的分离

注意：在开始分离乳头肌之前，请检查气体管路是否畅通无阻。

1. 在开始制备乳头肌之前，按照第1-3节所述准备好器官浴装置。所有溶液均需在实验当天配制。
2. 根据专业操作规范和机构指南，通过颈椎脱位法处死小鼠（约8-12周龄）。
3. 将动物仰卧位固定于解剖板上，用大头针固定前肢和后肢；使用锋利的骨剪从两侧横向剪开肋骨以打开胸腔，再横向剪断膈肌。去除心包膜。此时心脏和主动脉已暴露可及。
4. 用钝头镊子夹住靠近心脏的血管干固定心脏，并用剪刀迅速将心脏从肺组织及周围组织中分离出来。
5. 将跳动的心脏转移至盛有经氧气饱和的低温制备液（见步骤2.2）的培养皿中。让心脏继续跳动，并通过镊子轻触心尖以轻微刺激心肌收缩。
6. 一旦心脏完全排空血液，立即将其转移至盛有经O₂饱和的低温制备液（见步骤2.2）的解剖皿中。自此步骤起使用体视显微镜进行操作。
7. 用细针穿过右心室将心脏固定，使心脏呈背侧朝上（从操作者视角看，右心室位于右侧）。
8. 使用显微外科剪刀在房室交界水平剪除左右心房，剪除与心室相连的结缔组织并弃去；从房室瓣水平沿心室壁向心尖方向剪开，注意避免施加任何机械压力。
9. 打开心室腔，用镊子夹住左侧游离壁，以便观察两个左心室乳头肌。
10. 沿左前乳头肌两侧轻轻剪除周围心室组织，保留乳头肌附着的一部分瓣膜帆状结构，尽可能避免触碰或牵拉乳头肌。仔细剥离乳头肌上残留的心室壁组织。
11. 在乳头肌标本两端分别结扎丝线（7/0，公制0.5），一端系于瓣膜帆状结构，另一端系于肌肉部分。将标本固定于盛有器官浴液并以碳合气（carbogen）饱和的器官浴槽中，建议温度维持在32 °C。

5. 乳头肌的平衡与刺激

1. 将乳头肌标本固定于器官浴后，立即使用矩形脉冲（持续时间 2 ms，电流 100 mA）以 1 Hz 的刺激频率进行刺激。
2. 确保频繁更换器官浴中的溶液，可根据所用器官浴装置的配置，采用连续更换或频繁手动更换（每 5 分钟一次）的方式。
3. 逐步增加预张力，直至达到最大收缩力。当继续增加预张力不再引起收缩力进一步增强时，即达到最大收缩力。
4. 平衡 45–60 分钟后，开始实验方案。

6. 收缩力测量的建议实验方案

注意：以下概述的实验方案包含在生理和病理生理条件下表征心肌收缩力的标准操作步骤。在代表性部分中，我们详细描述了这些方案，并展示了代表性结果（另见表2）。

1. 实验方案的记录与分析
   1. 记录时，应使用具有足够时间分辨率（采样率 ≥ 1kHz）的合适软件。
   2. 分析参数包括收缩力幅度（高度）、达峰时间（TTP）和半最大舒张时间（R₅₀/TFall，分别对应软件程序中所提及的参数，例如 ADInstruments 的 Chart 5.5，见图4）。

结果

本论文所述分离小鼠乳头肌制备物收缩力测量方案经过优化，旨在生理条件下获得可重复的实验结果。为确定最佳实验条件，我们进行了预实验，分别改变器官浴温度和细胞外钙离子浓度（另见¹²）。本文所描述的方案采用1.5 mM的细胞外钙离子浓度和32 °C的温度条件。

基础收缩特性

为表征基础收缩特性，本方案采用以下参数：收缩力幅值、收缩频率、达峰时间（定义为从5%基础水平开始达到最大收缩力所需的时间）和半舒张时间（即达到50%舒张力所需的时间）。收缩波形的典型轨迹及这些参数的分析示意图见图3A-B。

钙依赖性收缩性

细胞外钙离子浓度对心肌细胞的兴奋-收缩耦联具有关键性决定作用，通过改变该参数，可评估心肌细胞收缩装置对钙离子的敏感性。如图3C所示，提高细胞外钙离子浓度会导致钙瞬变发生变化，进而引起收缩力的改变。细胞外溶液中的钙离子浓度逐步升高（...

讨论

本文中，我们描述了一种研究小鼠乳头肌收缩力的方法 体外 可用于回答与小鼠心脏生理学和病理学相关的多个科学问题，支持转基因品系的分析，并助力发现治疗心脏功能障碍的新型药物方法。我们展示了该方法在评估心肌收缩功能的生理学、病理学及药理学特性方面的应用（参见 图 3）。此处未展示的其他应用包括使用不同药理学试剂评估细胞内信号通路（另请参见 ¹²).

缺血性心脏病和心力衰竭等心脏疾病表现出显著的临床问题，仍是全球范围内导致死亡和疾病负担的首要原因²²对于许多在心脏中表达的蛋白质而言，其在心肌收缩力方面的作用至今仍知之甚少，或尚未被研究。通过对分离的乳头肌进行收缩力测定，可为研究心肌收缩功能提供一种有意义且可靠的方法。 体外 在小鼠模型中。

尽管该方法在技术上是可行的，并具有良好的可重复性，但仍有一些关键步骤对于确保实验成功至关重要：首先，在分离心脏后，必须确保制备过程中使用无血液的溶液，以便正常操作（可视化观察）。另一个关...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333
葡萄糖	Sigma-Aldrich	D9434
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P5280
二水氯化钙	Sigma-Aldrich	223506
七水硫酸镁	Sigma-Aldrich	230391
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P 5655
2,3-丁二酮单肟	Sigma-Aldrich	B0753
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma-Aldrich	I5879	危险声明 H 302，溶于 DMSO
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
盐酸异丙肾上腺素	Sigma-Aldrich	I5627	危险声明 H 315-H319-H335
肝素钠 250,000 IE/10 ml	ratiopharm	PZN 3874685
盐酸组胺二水合物	Sigma-Aldrich	H7250	危险声明 H 315-H 317-H319- H334-H335