一种可筛选的 在体 内 使用转基因生物发光技术检测线粒体调节剂的实验方法 秀丽隐杆线虫

摘要

本文描述了一种在模式生物 Caenorhabditis elegans 中 in vivo 检测线粒体抑制剂作用并鉴定潜在增强化合物的实验方案。该方案可用于筛选能够调节线粒体功能的化合物文库。

摘要

多细胞模式生物 秀丽隐杆线虫 是一种成年后体长约1毫米的小型线虫，具有良好的遗传操作性和实验可及性。它培养成本低，易于在液体培养基中培养和分装，非常适合中通量筛选。我们此前已验证了转染表达荧光素酶的转基因 秀丽隐杆线虫 菌株以提供快速 体内 线虫ATP水平的评估^1-3 在此，我们介绍了利用生物发光法进行生物测定所需的材料和操作步骤。 秀丽隐杆线虫 菌株 PE254 或 PE255（或其任何衍生菌株）。该方案适用于 体内 检测可能提示线粒体毒性的药物亚致死效应，以及用于 体内 检测潜在的有益药物效应。文中提供了百草枯、鱼藤酮、草酰乙酸以及四种萤火虫荧光素酶抑制化合物的代表性实验结果。该方法可扩展用于高通量筛选能够调节线粒体功能的化合物药物库。药物毒性的临床前评估通常在永生化的人类癌细胞系上进行，这类细胞主要通过糖酵解产生ATP，通常对线粒体毒性物质具有耐受性。^4,5 相比之下， 秀丽隐杆线虫 依赖氧化磷酸化来维持向成体的发育，与人类具有相似性，为在完整活体多细胞生物的生理环境下进行化合物评估提供了独特机会。

引言

该实验方案的总体目的是快速定量测定细胞或组织的能量状态 秀丽隐杆线虫 体内 旨在将此作为化合物筛选中的终点指标。 其原理基于在秀丽隐杆线虫中转染表达萤火虫荧光素酶 秀丽隐杆线虫^1-3 通过质粒pSLGCV（¹https://www.addgene.org/49862). 荧光素酶与绿色荧光蛋白GFP融合，且在细胞质中组成型、普遍表达（已去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向信号）。当外源提供底物荧光素时，可引发发光反应。由于线虫具有透明特性，可在发光仪中以相对光单位（RLU）检测所发出的光。细胞内的ATP为生物发光反应提供能量，其可用性决定了发光强度。因此，发光检测为评估相对ATP水平提供了便捷手段，进而可反映线粒体功能，因为ATP主要在线粒体中生成。此前已通过沉默线粒体电子传递链基因并伴随发光强度降低，证实了线粒体功能与生物发光水平之间的关联。¹

所构建的生物发光菌株被命名为PE254(feIs4) 和 PE255(feIs5)¹ （参见材料列表），可互换使用。³ 已有许多研究利用这些传感菌株来报告细胞内的ATP水平 体内 暴露于叠氮化钠等各种外源性化学物质后¹，镉²，污水污泥提取物³5’-氟-2-脱氧尿苷⁶，以及一种烟草特异性亚硝胺⁷这些菌株还被用于监测暴露于C波段紫外线辐射的影响⁸ 并研究破坏线粒体呼吸链功能的影响。^1,9 一种早期的发光传感器（PE39），其表达不含GFP融合的荧光素酶基因，已被用于研究重金属和呼吸解偶联剂的影响。¹⁰ 菌株 PE254 和 PE255 携带荧光素酶:GFP 融合蛋白，GFP 荧光强度与线虫生物量呈正比增加，为荧光素酶活性值的标准化提供了便捷方法。^6,9 通过在实验中设置多个技术重复（每种条件至少5个孔），可以抵消每孔中线虫数量差异所带来的影响。³

该方案提供了在完整多细胞生物体的生理环境下进行能量水平体内监测的可能性（相较于技术上更为繁琐的体外 ATP检测），从而实现化合物的筛选与再定位。通过将染色体整合的转基因与现有的突变品系杂交，和/或通过RNA干扰沉默特定基因，该方法可拓展应用于多种遗传背景，充分利C. elegans作为模式生物的优势。该技术有望减少因线粒体毒性导致的药物候选物在后期研发阶段的失败，并有助于减少高等动物实验的使用。

方案

注意：所有步骤均须在无菌条件下（超净工作台内）进行，并使用预先灭菌的材料（126 °C 高压灭菌 11 分钟）。需要将划线接种的 E. coli OP50 LB 培养皿保存在 4 °C 环境中，每月转接至新的 LB 培养皿并重新划线接种。

1. 细菌食物（Escherichia coli OP50）制备

1. 第1天。在两个通用瓶中，分别接种一单菌落于2 x 5 ml LB培养基中 大肠杆菌 OP50，置于37 °C摇床（220 rpm）中培养8小时。
2. 孵育8小时后，使用2 ml的 E. coli 接种3份各200 ml的LB培养基至OP50 LB培养物中，将锥形瓶置于摇床培养箱内（220 rpm）于37 °C过夜（17小时）培养。
3. 称量20个50 ml离心管，并将重量标记在管壁上。
4. 第2天。使用刻度移液管，分装30 ml过夜培养物 E. coli 将OP50培养物转移至预先称重的离心管中。在10 °C下以7,741 × g离心8分钟。
5. 小心倾倒上清液，将离心管倒置并盖上管盖，静置数分钟。用移液器吸去可能积聚在管盖内的残留上清液。称量离心管重量，计算沉淀物的重量。
6. 计算所需体积以配制30 g/L的悬浮液，并在离心管上标记该体积。标注日期、贴标签后，将离心管置于-20 °C保存，用于1-3个月内使用；若需保存超过3个月，则置于-80 °C保存。
7. 制备用于培养线虫的细菌悬液；将细菌沉淀解冻，并加入所需体积的S完全培养基^11,12 向每管中加入后，轻轻涡旋以重悬沉淀，合并不同管中的内容物以获得所需体积。在无菌条件下操作。

2. 96孔板中药物标准品的制备

注意：如果使用药物文库，药物板将以单一浓度的化合物溶于DMSO的形式提供。初筛将使用单一浓度的化合物进行测试。以下说明适用于在0-160 μM范围内进行浓度梯度的确认性化合物测试的药物板制备，该浓度范围的选择基于在10 μM时达到统计学显著性。以下步骤可根据需要调整以测试其他浓度。

警告！操作药物时需遵循必要的安全防护措施（通常需要佩戴口罩、安全护目镜和手套）。

1. 准备用于确证性筛选的药物板：将所需量的化合物称取至无菌1.7 ml微量离心管中，用DMSO配制成16 mM的化合物溶液（即， 相对于暴露所需最高浓度的100倍浓缩液。
2. 将16 mM的母液用DMSO按1:2比例进行系列稀释，得到8、4、2、1、0.5和0.25 mM的标准溶液（无菌操作）。这些溶液为100倍浓缩液，在药物处理时将稀释至终浓度分别为0（仅溶剂对照）、2.5、5、10、20、40、80和160 μM（含1% DMSO）。
3. 在超净工作台中，将化合物标准品以每孔20-50 μl加入96孔板的某一列中，例如：A1孔为16 mM，B1孔为8 mM，C1孔为4 mM，D1孔为2 mM，E1孔为1 mM，F1孔为0.5 mM，G1孔为0.25 mM的药物，H1孔为DMSO。不同药物的稀释系列应使用不同的列。
4. 将溶剂分装至药物板第12列各孔中。
   注意：这将有助于沿纵列进行溶剂对照组的测试，同时结合沿 H 行的测试，确保溶剂在整块板具有代表性的位置上均得到测试。
   注意：用于确证性筛选的每块药物板最多可容纳11种不同药物的浓度梯度稀释系列，另加溶剂对照。
5. 标记并密封培养板，用铝箔包裹后置于 -20 °C 保存备用。

3. 线虫实验

注意：所有步骤均须在无菌条件下无菌操作，并使用预先灭菌的材料和试剂。C. elegans 菌株常规培养于含 E. coli OP50 的 NGM 平板上¹²。不同实验步骤的建议时间见表1。

1. 第1天任务：建立生物传感器菌株的液体培养物，用于后续同步化。
   1. 从一个6 cm NGM平板（食物刚好耗尽且含有大量幼虫）中吸取线虫，加入2 ml S完全培养基，转移至含有30 g/L的锥形瓶中 E. coli OP50 菌株接种于 S 完全培养基中（总体积 30 ml，置于 250 ml 锥形玻璃瓶中），20 °C、160 rpm 振荡培养 3 天。
2. 第4天任务（约需30–35分钟）：用次氯酸钠溶液处理培养物以收集卵并同步线虫群体。所有离心步骤均在600 × g下离心1分钟。
   1. 使用前配制漂白液：向每16 ml的0.156 M KOH/NaOH溶液中加入4 ml漂白剂。
   2. 将2份14 ml线虫培养物倒入15 ml锥形离心管中。静置使线虫自然沉降（3分钟）。移除并弃去沉降线虫上方的液体。每管加入5 ml次氯酸钠溶液，并启动计时器。将各管液体合并至同一管中。
   3. 轻轻倒置离心管2分钟，在体视显微镜下检查线虫是否破裂以及卵是否已释放到悬浮液中。当大部分卵已释放，或在次氯酸钠溶液中处理达到最长2分钟时，进行离心。
   4. 小心移除上清液。用 14 ml S 完全培养基将沉淀洗涤 1 次，并离心。
   5. 弃去上清液，加入10 ml 次氯酸钠溶液并启动计时器（此第二次漂白步骤可确保大多数线虫尸体解体，在体视显微镜下不可见）。在次氯酸钠溶液中处理时间最长不超过2 min后，离心。
   6. 将沉淀物用S完全培养基洗涤3次，每次离心后小心倾去上清液，并将沉淀物重新悬浮于14 ml S完全培养基中。最后一次洗涤后，将卵沉淀物重新悬浮于14 ml S完全培养基中。
   7. 将体积转移至锥形玻璃烧瓶中，在20 °C、160 rpm条件下孵育18–24小时。
      注意：收获的卵将过夜孵化，由于缺乏食物，幼虫发育将在第一龄幼虫（L1）阶段停滞，因此所有个体将处于相同的生长阶段。
3. 第5天任务：建立同步化线虫培养物用于药物检测。
   注意：悬浮在饥饿培养基中的线虫容易粘附于疏水性塑料表面，如移液器吸头和离心管。此处使用0.01%吐温-20作为表面活性剂，以增加塑料表面的亲水性，从而提高计数的准确性（也可使用0.01% Triton-X100）。当线虫处于添加细菌的培养基中时，通常不易粘附塑料表面。
   1. 确定烧瓶中孵化的L1幼虫数量，将烧瓶置于摇床上（160 rpm）。
      1. 从烧瓶中分别取3份100 μl样品（每次使用新的枪头），加入含900 μl液体培养基和0.01% Tween-20的独立1.7 ml微量离心管中。
         注意：仅用洁净的吸头吸取100 μl样品一次。随后在分配时，将液体在含Tween的培养基中上下吹打数次，以释放粘附在吸头上的线虫。
      2. 从每个三份稀释管中取4份10 μl液滴，计数线虫数量。计算平均值，并估算锥形玻璃烧瓶中线虫的总数。
   2. 计算制备2 × 20 ml培养液所需的孵化线虫悬液体积，每10 μl含10条线虫。为补偿后续离心步骤中的部分线虫损失，将计算所得体积增加10%。
   3. 将所需体积倒入2个15 ml离心管（预先称重）。称量离心管以确定实际加入的体积，轻轻涡旋混匀，并用5 ml移液器移除多余液体以调整至目标体积（仅无菌吸头应进入管内）。
   4. 用新鲜的S完全培养基定容至14 ml以洗涤线虫。离心（1分钟，600 g）。小心移除上清液并弃去，注意不要扰动线虫沉淀。
   5. 加入5 ml含30 g/L的S完全培养基 E. coli OP50加入到已收集的线虫中。将每管5 ml转移至含有15 ml S完全培养基（含30 g/L）的锥形玻璃烧瓶中 E. coli OP50。记录线虫首次获得食物的时间。
   6. 轻轻摇动锥形瓶（160 rpm），吸取9次每次10 μl的液滴至显微镜载玻片上（每次使用新的吸头），用于计数线虫，并确认每10 μl液体中平均约有10条（±2）线虫。
   7. 将线虫培养瓶置于20 °C、160 rpm的摇床培养箱中振荡培养42–44小时。
4. 第7天任务：将线虫转移至96孔板并开始药物处理。
   1. 将线虫培养物合并至一个烧瓶中，轻轻摇动烧瓶，并将3份各4 ml的线虫培养物转移至60 ml无菌槽中。将槽置于摇床上（160 rpm）。
   2. 使用八通道移液器将25 μl悬浮的线虫分装至96孔黑色微孔板的每个孔中，微孔板需具有平底透明底面（用于同时检测发光和荧光信号；或使用白色板仅检测发光信号）。盖上板盖，置于一旁备用。
      1. 每设置完两块板后，向槽中补充另外2 × 2.5 ml的线虫，以补偿损失的体积（保持槽中约7 ml的“死体积”）。
      2. 设置13/14个线虫培养板。测试两个96孔药物板需要11个线虫培养板。第12个^th 线虫平板将仅加载载体作为对照。13^th 在第8天将使用该孔板建立背景荧光值（见下文）。可额外准备一块孔板，以备设置过程中出现失误时使用。
   3. 将74 μl S完全培养基分装至各孔中，将培养板置于加湿培养盒内（见材料清单），并在摇床培养箱中（20 °C，160 rpm）孵育，直至达到预选的发育时间，用于分装待测化合物例如， 45小时30分钟（提供食物后）。[每孔体积现为99 μl]。
   4. 解冻待检测的药物板。
   5. 使用多通道移液器在含有药物的线虫培养板上加样，每次更换枪头。每块96孔板分装药物需预留5分钟。
      1. 从1中取1 μl^st 药物板的列中取出并加入含有线虫的板的第1-5列；从第2列重复此步骤^nd 将药物板中的列转移至含有线虫的板的第8-12列。向线虫板的第6和第7列各加入1 μl溶剂。
         注意：线虫板中每孔的总体积为 100 μl，将导致化合物/溶剂被稀释至 1:100。
      2. 重复该过程，加入 1 μl 的 3^rd/ 4^th 将药物板的列转移至第二块线虫板的第1-5列和第8-12列；向线虫板的第6列和第7列加入载体。
      3. 继续测试剩余的药物板列。从药物板第12列取样，制备至少一块所有孔中均含有溶剂对照的线虫板。将平板放回潮湿容器中，置于摇床培养箱内（20 °C，160 rpm）孵育20–22小时（参见第8天注释）。
   6. 为次日实验预先配制发光缓冲液：向所需体积的S完全培养基中加入DMSO和10% Triton X-100，使终浓度为1% DMSO和0.15% Triton X-100。每块板检测发光信号需准备5 ml缓冲液，另加1 ml用于润洗发光仪进样器。
5. 第8天任务：读取实验终点数据——荧光和生物发光。（建议使用GFP荧光读数来标准化生物发光数据。）
   注意：为防止在所述实验条件下线虫产生大量后代，建议在向线虫提供食物后66-67小时左右读取实验终点。
   1. 设置一个孔板，用于GFP读数的背景对照。合并第13孔中的内容物^th 将样品转移至15 ml离心管中，静置2–3分钟使线虫沉淀。取上清液，每孔加入100 μl细菌悬液，接种于微孔板（黑色板体，透明底）中。
      1. 在显微镜下观察背景对照板，记录可见线虫的孔位，并在后续数据分析所用的背景估计中排除这些孔位。
   2. 读取每块96孔板的荧光值，包括背景对照。（设置：从板底部进行光学检测；滤光片：激发波长485/20，发射波长528/20。）
   3. 准备用于发光检测的缓冲液：将荧光素（20 mM）加入前一日已部分配制的缓冲液中，配制成含1% DMSO（1×）、0.15% Triton-X100（3×）和0.3 mM 荧光素（3×）的发光检测缓冲液。用150 μl 发光检测缓冲液对化学发光仪的注射器进行6次预冲洗。
      1. 上一步骤假设药物处理期间以1% DMSO作为溶剂。当溶剂为水时，需将发光缓冲液中DMSO的浓度调整至3%（即， 3x
   4. 一次处理一块板。每孔加入50 μl 发光缓冲液。（每孔终体积为150 μl；发光缓冲液3倍稀释后终浓度为：1% DMSO、0.05% Triton-X100 和 0.1 mM 荧光素。）立即置于摇床上并启动计时器。
      1. 在摇床（160 rpm）上振荡3分钟后，读取发光值（每检测1秒）。

4. 数据分析

1. 从荧光结果中减去平均 GFP 背景读数，然后将生物发光值除以相应的 GFP 读数。
   1. 当检测到暴露于化合物的线虫出现较高的 GFP 值时，应单独测量该化合物的荧光，以排除化合物自身荧光的干扰。如果其荧光值高于平均水平，则应以此作为背景值进行校正。
2. 将生物发光、GFP 标准化后的生物发光以及 GFP 荧光数据表示为每块板中溶剂对照组平均值的百分比。
3. 绘制每个浓度的平均值及其误差线。
4. 采用双因素方差分析（ANOVA），对“浓度”、“实验”及其交互作用进行显著性检验（每个数据点对应一个单独的孔），并以 Dunnett 法作为事后检验（与溶剂对照组比较）。
   注意：如果“实验”或“交互作用”项具有显著性，则可能需要进一步实验以确认响应结果。若从数据图中观察不到实验间的明显变异，可对独立实验的合并数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。
   1. 对于仅含溶剂的板（plates）的统计分析，选择第 6–7 列的所有孔以及 H 行的所有孔作为对照组（这些位置在化合物测试中通常用于放置溶剂对照）。

结果

为说明该方法，获得了鱼藤酮（图1）、百草枯（图2）、草酰乙酸（图3）以及在药物文库筛选中被鉴定为萤火虫荧光素酶抑制剂的4种化合物（图4）的代表性结果¹³。所有处理均在L4期开始，但百草枯处理实验在向线虫首次提供食物后41小时开始，而其他化合物则在45–46小时开始。本方案允许在药物处理起始时间和处理时长的选择上具有一定的灵活性。然而，出于筛选目的，一旦确定时间点，应保持一致，以确保实验间的可重复性。为防止孔中发生大量产卵和子代孵化，终点指标应在发育时间66–67小时之内进行测量。表1中提供了时间安排的指导建议。

鱼藤酮是一种线粒体复合物 I 抑制剂，在较短时间（2 小时）和较长时间（24 小时）暴露于一系列浓度后均导致生物发光信号下降（图 1）。本实验未进行 GFP 测量，但所使用的技术重复数（n=6）足以抵消各孔之间线虫数量的差异³。24 小时的暴露时间涵盖了线虫的生长阶段，由于复合物 I 受到抑制导致发育减缓，预期会进一步导致生物发光信号降低。这一现象通过体视显微镜下的视觉观察得到证实，可见发育延迟，尤其是在 20 μM 及更高浓度下；此外，在 40 μM 浓度及以上还观察到一定的致死效应（定性观察结果未量化）。在 2 小时暴露后未观察到致死效应，但已可见对线虫运动的影响。在所测试的最低鱼藤酮浓度（2.5 μM）下，生物发光信号相对于对照组即出现显著下降，而在此浓度和 2 小时暴露条件下，通过快速肉眼观察难以察觉明显效应。该生物发光信号的下降与细胞内 ATP 水平降低一致。使用最低浓度的鱼藤酮（2.5 μM）即达到了最大抑制效果，表明任何后续专门针对鱼藤酮的实验应在 0 至 5 μM 范围内进行[选择 0–160 μM 的浓度范围是出于与其他药物的比较研究需要，这些药物最初被发现于 10 μM 时具有显著效应（将另文发表）]。

除草剂百草枯通过增加活性氧来影响线粒体功能。在此，我们展示了百草枯在不同浓度下暴露24小时后对秀丽隐杆线虫（C. elegans）PE254品系生物发光的影响（图2）。由于该品系携带luc::GFP融合基因，因此也检测了GFP荧光作为归一化的依据。^6,9 百草枯显著降低了生物发光、GFP荧光以及归一化后的生物发光。Dunnet事后检验表明，与溶剂对照组相比，生物发光和归一化生物发光在4 mM和8 mM浓度下差异显著，归一化生物发光在2 mM浓度下也显著降低。唯一显著降低GFP荧光的浓度是8 mM，该浓度下可观察到生长抑制效应及个别线虫死亡（定性观察）。生物发光（及归一化生物发光）的下降幅度大于荧光的下降，这与线粒体功能受损及ATP生成减少的效应一致。

在秀丽隐杆线虫（C. elegans）PE254品系上测试柠檬酸循环中间产物草酰乙酸，仅使用8 mM单一浓度，结果导致生物发光增强（图3）。未获得GFP荧光测量数据，也未进行额外的视觉观察；然而，对单一浓度产生的此类反应值得进一步通过一系列浓度梯度进行验证性暴露，并开展更详细的作用效应观察。该化合物增强生物发光的现象并不意外，因为可推测其促进了柠檬酸循环的活性，最终导致ATP生成增加（尽管在后续实验中仍建议通过检测GFP荧光来控制 Luciferase 水平可能受到的影响）。所示的草酰乙酸数据集揭示了基于荧光素酶实验中所见反应变异性的程度。根据我们的经验，这种变异性是该测试系统的特征，尤其在危害性较小的暴露条件下更为明显。

萤火虫荧光素酶抑制化合物 DDD00001434、DDD0001477、DDD00000635 和 DDD00023047 均被测试 体外 通过观察对纯化酶的影响以及 体内 使用 秀丽隐杆线虫 luc:GFP 表达菌株。在暴露条件下，没有证据表明所测试的任何化合物导致线虫死亡。所有4种化合物均影响了荧光素酶活性 体外 在测试的两个浓度（25 和 100 μM）下图 4A）。DDD00001434 几乎完全抑制了纯化荧光素酶的活性，这为观察到的显著活性下降提供了可信的解释 体内 生物发光图4B）。尽管 体外 和 体内 由于两种检测方法不能直接比较，但 DDD00023047 在两种检测中的反应相似。DDD0001477 和 DDD00000635 引起的下降更为显著 体内 比……更 体外这些化合物在荧光素底物加入前22小时提供给活体线虫，实验结果可能反映出当荧光素出现时，这些化合物难以从荧光素酶的活性位点上被置换。或者，DDD0001477和DDD00000635可能对细胞内ATP水平具有额外影响，这一点需通过不依赖萤火虫荧光素酶的方法进行评估。值得注意的是，暴露于化合物DDD00000635的活体线虫中GFP信号显著增强，这一点将在下文讨论。

图1. 线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮降低了秀丽隐杆线虫（C. elegans）的能量状态，通过PE254品系的生物发光检测进行测定。 在提供食物后45-46小时的同步化L4期线虫，分别暴露于含0、2.5、5、10、20、40、80和160 μM鱼藤酮的1% DMSO溶液中，短时间（2小时）或长时间（24小时）处理，生物发光读数分别在提供食物后48小时和69小时进行。生物发光值（单位为相对光单位，RLU）以溶剂对照组（1% DMSO）的百分比表示。误差线表示每个鱼藤酮浓度下技术重复的均值标准误（SEM，n=6）。所有测试浓度与溶剂对照组相比均表现出高度统计学显著差异（p<0.001）。

图 2. 氧化应激剂百草枯以浓度依赖的方式降低了 C. elegans 菌株 PE254 的能量状态（通过生物发光测定）。同步化的 L4 期线虫（在此实验中为 L1 幼虫接种食物后 41 小时）暴露于 0、0.25、0.5、1、2、4 或 8 mM 的百草枯中，持续 24 小时。使用 GFP 荧光（单位为相对荧光单位，RFU）对生物发光数据（单位为 RLU）进行归一化处理，两个检测终点均在发育至 65 小时时获取。数据以对照组（1% DMSO）的百分比表示。误差线表示技术重复的均值标准误（SEM）（不同浓度组 n=5；对照组 n=18）。单因素方差分析：*** p<0.001，相对于溶剂对照组。

图 3. 三羧酸循环中间产物草酰乙酸（8 mM）增强了 C. elegans 菌株 PE254 的生物发光。 同步化的L4期线虫（在L1幼虫给予食物后45–46小时）暴露于新鲜配制的8 mM草酰乙酸中，持续18小时±30分钟。在发育时间63.5小时±1小时时检测生物发光（单位为RLU），并以溶剂对照（ddH₂O）的百分比表示。不同柱状图代表同一次实验中分配至不同96孔板的八次技术重复所组成的独立数据集。误差线表示技术重复的均值标准误（n=8）。双因素方差分析（‘数据集’和‘浓度’作为因素）结果显示：‘数据集’p>0.05，‘浓度’p<0.001，交互作用项p>0.05。

A

B

图4. 对邓迪药物发现化合物库中的4种化合物¹³（C1:DDD00001434，C2:DDD0001477，C3:DDD00000635 和 C4:DDD00023047）的响应测试，这些化合物已知可抑制萤火虫荧光素酶的发光。（A）化合物对纯化萤火虫荧光素酶活性的影响（以光单位RLU表示），以溶剂对照组的百分比表示。使用ATP生物发光CLSII试剂盒（Roche，Manheim，德国），按照说明书操作，将等量的荧光素酶分装至各孔（白色96孔微孔板）。ATP终浓度为10 μM，加入1 μl化合物（终浓度如标注所示）或DMSO（1%）。发光信号积分时间为10秒。误差线表示技术重复的SEM（n=4）。分析：单因素方差分析；*p<0.05 或 *** p<0.001，相对于溶剂对照组。C1（DDD00001434；p<0.001）在25和100 μM之间的差异高度显著，C2和C3（分别为DDD0001477和DDD00000635；p<0.05）差异显著。（B） 体内测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）PE254品系在暴露于测试化合物22小时后，于67小时发育时间点的生物发光、生物发光相对于GFP荧光的归一化值以及GFP荧光。误差线表示技术重复的SEM（n=8）。统计分析（单因素方差分析）基于3组数据集（3 × n=8）的合并数据进行。*p<0.05 或 *** p<0.001，相对于相应的溶剂对照组。仅在暴露于C4（DDD00023047）后，25和100 μM之间归一化的生物发光差异具有统计学显著性（p<0.05）。

一天中的时间	第1天	第2天	第3天	第4天	第5天	第6天	第7天	第8天
9-10								步骤5
10-11								步骤5
11-12							步骤4	步骤5
12-13							步骤4
13-14
14-15
15-16
16-17	步骤1				步骤3
17-18
18-19				步骤2

表1. 线虫实验各天需执行的实验方案步骤概览（第3节）及建议时间安排。

讨论

模式生物 秀丽隐杆线虫 提供了一个强大的实验系统。该生物易于培养，从卵发育至可繁殖的成虫仅需3.5天（经历L1至L4幼虫阶段），并可产生大量遗传一致的子代。由于其个体微小，可方便地在96孔板中培养，便于化合物筛选。本文介绍了一种基于特定品系的表型筛选方案 秀丽隐杆线虫 发挥……作用的 体内 能量水平传感器¹⁴ 该方案适用于任何实验室，但需要配备96孔板化学发光仪和无菌操作台。实验过程中应采用良好的实验室操作技术以防止污染。若手动操作，每次实验最多可处理13块线虫培养板，可用于测试2块96孔药物板，并包含2块溶剂对照板。本文展示了代表性实验结果，所用化合物包括线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮、超氧阴离子生成剂百草枯、三羧酸循环中间产物草酰乙酸，以及四种已知可抑制萤光素酶活性的化合物。前两种化合物导致生物发光信号下降，符合预期；而草酰乙酸则引起信号增强，可能源于ATP生成增加。草酰乙酸的多组数据还体现了以萤光素酶为报告基因的实验本身存在的内在变异性。建议至少进行三次独立重复实验，以确保对未知化合物响应结果的可靠性。

萤火虫荧光素酶活性的抑制可被识别 体外 使用商业试剂盒进行检测。³ 其中一种化合物导致GFP荧光显著增强，这与该抑制剂通过结合萤火虫荧光素酶的活性位点并使其更加稳定，从而提高GFP标记的荧火虫荧光素酶水平的结果一致。¹⁵ 在某些情况下（但本实验不属于此类情况），当过量底物取代抑制剂时，可能会导致生物发光水平升高。¹⁵ 因此，对于与萤光素酶相互作用的化合物，不应将其检测结果错误解读为ATP水平或线粒体功能的降低或升高。发光信号的变化通常与其他健康指标（如运动能力、发育和生长）的检测结果相关。例如，若检测到生物发光信号显著下降，但在显微镜下观察发现线虫与对照组无明显差异，则该化合物可能是萤光素酶抑制剂。若绿色荧光蛋白（GFP）荧光信号增强，且无法由生长或化合物自身荧光解释，则也可能提示存在抑制剂。已有多种萤光素酶抑制剂被报道。¹⁵ 已知并已录入 PubChem。因此，首先应查阅 PubChem 中收录的荧光素酶抑制剂相关信息，随后对化合物效应进行测试 体外 使用纯化酶进行的检测³ 和/或通过其他方法确认对线粒体功能的影响。^16,17

GFP 荧光检测可用于测定萤火虫荧光素酶水平（并可能检测上述某些荧光素酶抑制剂），因此在条件允许的情况下，强烈建议将该指标与生物发光检测联合进行。将生物发光信号归一化至 GFP 水平，也是校正各孔线虫数量差异的一种方法（尽管也可通过设置多个技术重复来实现）。为了获得更高的灵敏度，必须从检测信号中扣除背景荧光。本方案评估了细菌悬液对背景荧光的贡献，但未考虑线虫自身的自发荧光（这是当前检测方法的一个局限性，尤其在衰老研究中尤为关键，因为线虫的自发荧光会随年龄增长而增强）。测试化合物的自发荧光也应平行评估。当研究人员希望改进本方案，用于比较不同遗传突变体或不同基因沉默后的细胞 ATP 池时，GFP 归一化显得尤为必要，以控制不同品系在生物发光报告基因表达水平上的差异。

该实验方案中的关键参数包括开始暴露的发育阶段、暴露时长，以及在不同孔中获得数量相近的线虫。暴露可以在线虫发育的任何阶段开始，但优选从L3阶段或更晚阶段开始。从该阶段起，线虫依赖氧化磷酸化以完成向成虫的发育，这一点已由线粒体DNA含量、耗氧量和ATP水平的显著升高所证实^18,19,20。本方案在L4阶段开始暴露处理。选择在此阶段才将线虫分装至96孔板（而非在L1阶段初次提供食物时即分装），原因是尽管将培养板置于湿室中以尽量减少蒸发，但在我们的振荡培养箱中仍会发生一定程度的蒸发，表现为盖子上形成微小液滴（其他振荡培养箱可能无此问题）。在即将加入药物标准品前才将线虫分装至各孔，可确保实际药物浓度不受蒸发引起的微小体积变化影响。设置仅含溶剂对照的线虫孔板有助于检查线虫在各孔间的分布是否均匀。若仅含溶剂的孔板出现显著差异，则提示线虫分装操作技术存在问题。

暴露时间是一个需要考虑的重要因素。如果关注的是与生长无关的能量状态变化，可对方案进行修改以适应较短时间的暴露（从几乎即时的反应到例如2小时）。另一方面，化合物进入 秀丽隐杆线虫 组织可能需要较长时间才能达到药物的最高内部浓度。例如，白藜芦醇和5-氟-2'-脱氧尿苷（FuDR）分别需要12–24小时才能达到最大内部浓度。²¹ 因此，延长暴露时间（18至24小时）可能是合理的，以最大化暴露水平。暴露时间应限制在不足以引起显著繁殖发生的范围内。我们建议线虫的总发育时间应控制在66–67小时以内。尽管此时线虫已具有生殖能力并开始产卵，较为便利，但我们发现卵样品产生的生物发光信号可忽略不计（未显示）。 sur-5 启动子驱动的转基因表达最早仅在受精后约2至2.5小时、100细胞阶段时被检测到²² 且几丁质卵壳可能具有限制作用 荧光素的进入。其他研究发现，受精卵对成年雌虫的代谢无显著贡献。²³ 然而，应避免可能导致大量后代产生的条件。如果需要，可将实验时间轴向后调整：我们此前曾在幼虫晚期L3阶段（36小时）开始暴露于环境毒素，并在55小时时进行生物发光和GFP检测。² 或者，可以使用条件性不育的遗传背景来防止子代产生，例如 fer-15(b16) II；fem-1(hc17) IV双突变体可在15 °C下维持培养，但在25 °C下不育。²⁴ 不建议使用FuDR诱导不育，因为其本身可能影响线虫的代谢。²⁵ 该检测也可在角质层通透性更高的菌株中进行，例如部分功能缺失突变株 bus-8 由于药物通透性增加而导致对多种药物敏感的突变体。²⁶ 这将有助于缩短暴露时间并降低化合物浓度。向这些线虫添加荧光素的条件也可能需要调整。 即， 发光缓冲液中的1% DMSO和0.05% Triton-X100可能并非必需，以增强荧光素的可及性。

本实验方案使用1% DMSO作为化合物递送的溶剂。尽管该浓度的DMSO不具致死性，但其仍具有一些生物学效应，我们已在先前的出版物中对此进行过讨论³。目前许多可用的药物文库均以100% DMSO配制，其浓度在将溶剂稀释至0.1%后适用于基于细胞的检测。与人类细胞相比，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中引发反应需要更高的化合物浓度，因此通常难以在低于1% DMSO的条件下开展检测。同样，使用角质层通透性更高的品系可能有助于在更低溶剂浓度下进行测试。不建议使用高于1%的DMSO浓度。

在加入荧光素后至检测前，应遵循固定的孵育时间。如先前所示，加入荧光素后约第二分钟光强度即达到最高水平，并在最初5分钟内保持相对稳定，随后在接下来的30分钟内光强度缓慢逐渐下降¹。在初次加入荧光素后的最初30分钟阶段内，可进行针对特定化学物质的动力学反应检测。

该方案在收集卵后包含一个饥饿步骤，以实现线虫群体的同步化。我们建议对线虫测试群体进行同步化处理，因为不同发育阶段的线虫其细胞内ATP水平存在差异，可能对测试化合物产生不同的反应。通过在S完全培养基而非M9培养基中进行饥饿处理，孵化出的线虫可获得碳源（乙醇），从而使幼虫不继续发育但又不会完全处于饥饿状态。^27,28 研究还表明，处于滞育状态的L1幼虫对食物恢复具有快速响应的准备状态，在获得食物后3小时内即可恢复正常的L1生长速率。²⁹ 然而，不能排除饥饿步骤可能改变C. elegans代谢状态的可能性。³⁰ 因此，饥饿时间不应超过24小时（18小时已足以实现同步化）。某些实验室可能具备使用Copas Biosorter进行年龄同步化的能力，从而完全避免饥饿步骤。其他实验室可能更倾向于在漂白前（步骤3.1）先在固体培养基（含OP50的NGM平板）上扩增线虫群体，这种方法同样有效。我们在化合物暴露过程中使用S培养基作为线虫培养的标准培养基，但也可选择其他培养基，例如K培养基或EPA中等硬度水，这些常用于生态毒理学研究。^31,32

该方案提供了一种筛选和鉴定可能影响线粒体功能的候选化合物的方法，以便进一步测试。在初筛阶段，由于仅测试了一个浓度，部分化合物可能会被遗漏，因此药物筛选不应被视为全面无遗漏。可通过多种技术验证筛选结果，例如检测氧消耗、使用表达GFP标记线粒体的C. elegans品系、线粒体膜电位染色和/或活性氧（ROS）检测。^16,33,34 该方法最重要的意义在于能够在多细胞生物整体水平上对大量化合物和/或条件进行筛选，更重要的是，可利用C. elegans遗传操作的便利性来研究其作用机制。该技术有望加快发现具有重要意义的化合物和靶点的新途径。预计在与人类疾病相关的遗传背景下，将该传感器与化合物文库结合，在疾病相关情境中进行筛选将具有广阔的应用前景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Orion II 微孔板发光仪	贝托德检测系统		使用进样器及 Simplicity 4.2 软件；在完成酶标板检测后将数据转移至 Excel
FLx800 荧光计	Biotek		使用 Gen5 软件；在微孔板检测结束后将数据转移至 Excel
Ks 130 基础型振荡平台	Ika	#0002980000
Innova 4349	新不伦瑞克科学公司		冷藏培养摇床
Eppendorf 离心机 5804R	Eppendorf		使用 Eppendorf 转子 A-4-44  （适用于50/15） 毫升离心管
Stripette，Costar	康宁	#4489	血清移液管
Cellstar 50 ml 离心管	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 ml 离心管	Greiner bio-one	#188261
Cellstar 60 mm 细胞培养板	Greiner bio-one	#628160
Superfrost 显微镜载玻片	VWR	#631-0909
无菌刮勺	康宁	#3007; #3004	用于称量化学试剂
0.22 mM Millex GP 滤器	默克密理博	#SLGP033RS
Axygen Eppendorf 管 1.5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 孔检测板	VWR	#3603	黑色板底透明带盖板
Nunc 96 孔检测板	Fisher Scientific	#236105	带盖白色培养皿
储液试剂 60 ml	赛默飞世尔科技 Finnpipette 移液器	#9510027	在方案第4.4.1节中用作线虫的培养槽
储存盒/保湿室	罗氏诊断	#10 800 058 001	174 × 101 × 56.6 毫米，用作加湿培养盒，内放湿润的纸巾；可容纳两个带盖的96孔板，其中一个置于微孔板盖上方
漂白剂：次氯酸钠溶液，4-4.99% 有效氯含量	Sigma Aldrich	#239305	4℃下分装保存 °C,  用Parafilm密封以防止氯损失，并用铝箔包裹
D-荧光素钾盐	Biotium 公司	# 10101-2	分子探针公司也可作为供应商；用ddH₂O配制20 mM的储存液2O，保存于 -20 °C 分装
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Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	纯度 99.99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	用ddH₂O稀释至10%2O
制霉菌素	CalBiochem	#475914
秀丽隐杆线虫 生物发光菌株	作者自建实验室	PE254, PE255	含有整合的阵列 feIs4 和 feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] 分别位于5号和X号染色体上；筛选表达均一且强烈的个体 luc::GFP 通过荧光显微镜（例如 每隔一段时间挑选15条蠕虫。
大肠杆菌 OP50	CGC
常规化学品	Sigma Aldrich/Fisher Scientific