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方法文章

利用Caco-2细胞研究肠道脂质转运

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DOI：

10.3791/53086

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2015年8月20日

 , 
1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, California Northstate University, 2Department of Biomedical Sciences, James H. Quillen College of Medicine, East Tennessee State University

本文内容

摘要

Caco-2 细胞可作为 体外 用于研究肠上皮细胞对脂质及脂溶性药物/维生素的转运模型。可渗透膜系统将顶膜侧与基底外侧区室分离，而慢病毒表达系统提供了一种高效的基因过表达方法。通过透射电镜（TEM）确认脂蛋白的分离。

摘要

对膳食脂肪吸收的研究通常采用带有淋巴导管的动物模型进行。尽管该动物模型被广泛接受为膳食脂肪吸收的体内模型，但其涉及的手术技术具有挑战性且成本高昂。对该动物模型进行基因操作也耗资巨大且耗时较长。相比之下，体外模型则更具成本效益、节省时间且操作难度较低。尤为重要的是，体外模型允许研究者将肠上皮细胞作为一个独立系统进行观察，从而降低整体生物体模型固有的复杂性。本文介绍了人结肠癌细胞（Caco-2）如何作为体外模型用于研究肠上皮细胞对脂质以及脂溶性药物和维生素的转运。文中阐述了Caco-2细胞的正确培养方法及其脂质混合物的制备，并进一步讨论了使用可渗透膜系统的有效方案。由于分化后的Caco-2细胞具有极性，采用可渗透膜系统的主要优势在于能够将顶膜侧与基底外侧区隔开来。因此，可将脂质混合物添加至顶膜侧，而从基底外侧收集脂蛋白。此外，本文还探讨了慢病毒表达系统在上调Caco-2细胞基因表达方面的有效性。最后，本文描述了如何通过透射电子显微镜（TEM）验证肠道脂蛋白成功分离的方法。

引言

通过使用淋巴瘘模型，可在体开展膳食脂肪以及脂溶性药物和维生素肠道吸收的研究1–4。然而，相关的手术技术不仅具有挑战性，而且成本较高。尽管也可采用基于粪便分析的在体方法，但其主要用于测定胃肠道对物质的吸收百分比2,5。本文所述的体外模型更具成本效益，且相关技术操作相对简便。利用该体外模型进行基因修饰研究也更为经济且耗时更短。

由于被肠上皮细胞吸收的脂溶性物质会被包装成脂蛋白 6,7，该方法的有效性 体外 建立能够生成脂蛋白的模型至关重要。肠道中两种主要的脂蛋白是乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）。乳糜微粒被定义为直径大于或等于80 nm的脂蛋白，仅在胃肠道腔内存在大量脂质时由小肠严格合成。由于乳糜微粒是体积最大的脂蛋白，因此可被认为是效率最高的脂质转运载体。 体外 能够产生乳糜微粒的模型 8可用于研究膳食脂肪吸收、肠道对脂溶性维生素的吸收以及口服脂溶性药物的生物利用度。脂蛋白组分中存在脂溶性分子、维生素或药物，是其经小肠吸收的指标。如前所述，该模型可用于提高口服脂溶性药物的生物利用度。 6.

本文介绍了如何在可渗透膜或常规组织培养皿中培养Caco-2细胞，如何制备用于刺激脂蛋白生成的脂质混合物，如何利用慢病毒表达系统实现高效过表达，以及如何对分离的脂蛋白进行分析。

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方案

1. Caco-2 细胞的培养与维护

  1. 使用常规组织培养皿
    1. 将冻存的Caco-2细胞从冻存管中取出，放入37 °C水浴中解冻，立即加入含有10 ml 预温培养基（含15%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））的10 cm组织培养皿中。
      1. 当Caco-2细胞达到50–70%融合度时，以1:6比例传代：在37 °C条件下用3 ml 0.05%胰蛋白酶/0.53 mM乙二胺四乙酸（EDTA）孵育细胞，直至细胞脱落（约15分钟）。为避免细胞结团，需通过轻柔吹打多次混匀细胞。取0.5 ml 胰酶消化后的细胞悬液加入含有10 ml 预温培养基的10 cm组织培养皿中。
    2. 轻轻前后方向晃动培养皿数次，再左右方向晃动数次。避免旋转晃动，以免导致细胞分布不均。
    3. 将培养皿置于37 °C、含5% CO2的培养箱内的平坦表面上。倾斜表面也可能导致细胞分布不均。
    4. 开始培养后第二天更换培养基。
    5. 观察细胞状态并记录其达到融合的日期。从传代之日起，细胞约需1周时间达到融合。
    6. 在细胞达到融合前，每周更换两次培养基；细胞达到融合后，每隔一天更换一次培养基；细胞融合后第7天起，每天更换一次培养基。
      注：当细胞处于融合后第13天时，即可用于实验（图1）。由于细胞产生脂蛋白的能力会随时间逐渐下降，建议使用融合后第13至17天的细胞8。接下来请进入步骤3以了解如何开展实验。
  2. 使用可渗透膜系统
    1. 按照上述步骤1.1.1.1的方法，将Caco-2细胞接种至可渗透膜插入式培养皿中。避免直接使用冻存管中的细胞，因其生长速度通常较慢（处于恢复期）。简要操作如下：将0.5 ml 胰酶消化后的细胞悬液加入含有10 ml 预温培养基的顶端室（上室）中，同时向基底外侧室（下室）加入10 ml 预温培养基。
      注：为确保操作规范，应先向顶端室加培养基，再向基底外侧室加培养基；更换旧培养基时，应先移除基底外侧室的培养基，再移除顶端室的培养基。操作过程中避免触碰聚碳酸酯膜，以防膜破裂。
    2. 由于聚碳酸酯膜透光性差，细胞可视性较低，建议同时在常规组织培养皿中以相同密度接种Caco-2细胞，并利用该培养皿判断细胞融合程度。
    3. 参照上述步骤1.1.2–1.1.6进行操作。

2. 基因过表达

  1. 使用常规转染方法
    1. 按照上述 1.1.1.1–1.1.4 的描述，将 Caco-2 细胞接种于组织培养皿中。
      注意：当细胞融合度达到约 40–50% 时，即可进行转染。
    2. 在微量离心管中，将 67 μl 转染试剂加入 472 μl 低血清培养基中。避免未稀释的转染试剂接触管壁。
    3. 将 23 μg 的 pLL3.7 增强型绿色荧光蛋白（eGFP）9 加入转染试剂/低血清培养基混合液中。
    4. 在室温下孵育该混合物 20 min 。
    5. 将 Caco-2 细胞的生长培养基更换为含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基 8 ml 。
    6. 将 DNA/转染试剂/低血清培养基混合液逐滴加入培养皿中。
    7. 轻轻前后晃动培养皿数次，再左右晃动数次。
    8. 将培养皿放入 37 °C 培养箱中。
    9. 开始孵育后 24 小时，将培养皿中的培养基更换为 10 ml 新鲜生长培养基。
    10. 监测基因表达。
      1. 不使用 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色监测基因表达。使用荧光显微镜观察，确定呈绿色的细胞百分比。该百分比代表转染效率。
      2. 使用 DAPI 染色监测基因表达。 
        1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次。
        2. 加入含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液 10 ml 固定细胞（室温孵育 10 分钟）。
        3. 用 PBS 洗涤细胞三次。
        4. 在避光条件下，室温用含 1:500 DAPI、1% BSA 和 0.01% 洋地黄皂苷的 PBS 溶液 8 ml 孵育细胞 15 min 。
        5. 用 PBS 洗涤细胞三次。
        6. 使用荧光显微镜，确定呈绿色/蓝色的细胞数量相对于仅呈蓝色的细胞数量的比例（图 2 上图）。计算所得百分比即为转染效率。
  2. 使用慢病毒过表达系统 10
    1. 将人胚胎肾（HEK）293T 细胞接种于 15 cm 组织培养皿中（使用含 10% FBS 的 DMEM 作为生长培养基）。
      注意：当细胞融合度达到约 60–70% 时，即可进行转染。
    2. 在微量离心管中，将 162 μl 转染试剂加入 1,133 μl 低血清培养基中 11。避免未稀释的转染试剂接触管壁。
    3. 向转染试剂/低血清培养基混合液中加入 24 μg pLL3.7 eGFP（或其它构建体）、15.6 μg Rev 反应元件（RRE）、6.0 μg REV 和 8.4 μg 水疱性口炎病毒糖蛋白（VSVG）。
    4. 在室温下孵育该混合物 20 min 。
    5. 将生长培养基更换为含 10% FBS 的 DMEM 培养基 16 ml 。
    6. 将 DNA/转染试剂/低血清培养基混合液逐滴加入培养皿中。
    7. 轻轻前后晃动培养皿数次，再左右晃动数次。此时部分 HEK293T 细胞脱落属正常现象。
    8. 将培养皿放入培养箱中。
    9. 孵育 24 hr 后，将培养皿中的培养基更换为 25 ml 新鲜生长培养基。
    10. 次日，收集含有慢病毒的生长培养基（第一次收集）。
    11. 重复步骤 2.2.10 以收集更多慢病毒（第二次收集）。
    12. 合并第一次和第二次收集的病毒液，通过离心（2,500 × g，5 分钟）去除细胞碎片。
    13. 使用一次性瓶顶滤器（孔径 0.45 μm）过滤收集液，并通过离心（JA-20 转子，31,400 × g，2 hr ，室温）浓缩病毒。标记离心管底部沉淀所在位置。弃去上清液，将离心管倒置于室温约 15 分钟。
    14. 用 100 μl 1× PBS 重悬含病毒的沉淀。避免产生气泡。
    15. 将浓缩后的病毒储存于 -80 °C。避免反复冻融。
    16. 通过滴定确定转导 Caco-2 细胞所需的最适病毒量。为节约成本，滴定可使用 24 孔板（每孔 0.3 ml 生长培养基）代替 10 cm 组织培养皿。
      1. 向融合度为 40–70% 的 Caco-2 细胞中加入递增剂量的浓缩病毒（0、1、2、5、10、25 和 50 μl/孔），并补充聚凝胺（终浓度 = 5 μg/ml）。按照 1.1.2 中所述方法轻轻晃动 24 孔板。
      2. 监测其基因表达（步骤 2.1.10）（图 2 下方四幅图）。
    17. 由于外源基因表达通常可持续维持，可将转导后的细胞继续培养用于后续实验，并持续监测其基因表达（步骤 2.1.10）。

3. 刺激脂蛋白分泌

  1. 使用常规组织培养皿
    1. 通过混合50 mg油酸、40 mg卵磷脂和48 mg牛磺胆酸钠制备100倍浓缩脂质混合液。用PBS定容至900 μl （足够用于8个培养皿）。剧烈涡旋振荡脂质混合液。
    2. 将900 μl 的100倍浓缩脂质混合液加入89.1 ml 培养基中。混匀后过滤含脂质的培养基。油酸、卵磷脂和牛磺胆酸钠的终浓度（1倍浓度）分别为2.0 mM、1.36 mM和1.0 mM。
    3. 向细胞中加入10 ml 含脂质的培养基。
    4. 将细胞在37 °C培养箱中孵育4 hr 。
    5. 用PBS洗涤细胞三次。
    6. 向细胞中加入10 ml 培养基以收集脂蛋白分泌产物。
    7. 在37 °C培养箱中孵育2 hr 。
    8. 收集含脂蛋白的培养基。
  2. 使用通透性膜系统
    1. 按照步骤3.1.1–3.1.2制备脂质混合液。
    2. 向顶端室加入10 ml 含脂质的培养基，向基底外侧室加入10 ml 培养基。
    3. 在37 °C培养箱中孵育4 hr 。收集基底外侧室中含脂蛋白的培养基。

4. 脂蛋白分离（图3）

  1. 通过离心（2,000 × g，5 分钟）去除含脂蛋白培养基中的细胞碎片。
  2. 将培养基倾倒入 50 ml 离心管中。
  3. 向培养基中加入 5.95 g 氯化钠。
  4. 若样品将用于透射电子显微镜（TEM）分析，请加入 1 片蛋白酶抑制剂混合物片剂，以维持脂蛋白的完整性。
  5. 加水定容至 23 ml （1.2 g/ml NaCl 密度溶液）。
  6. 充分溶解溶质。
  7. 将全部溶液倾倒入聚碳酸酯超速离心管中。
  8. 轻轻在 1.2 g/ml 密度溶液上层覆盖 0.5 ml 水（1.0 g/ml 密度）。
  9. 通过质量而非体积平衡离心管。
  10. 小心将离心管装入 T865 转子中。
  11. 在 4 °C 条件下，于超速离心机中以 429,460 × g 离心 24 小时 。
  12. 立即通过轻柔移液吸取最上层 0.5 ml 溶液。操作过程中尽量保持离心管静止。

5. 透射电子显微镜分析

  1. 配制 5 ml 2% 磷钨酸（w/v），并调节 pH 至 6.0。
  2. 使用孔径为 0.2 µm 的注射器滤器过滤 2% 磷钨酸溶液。
  3. 在无菌培养皿上滴加 20 μl 脂蛋白样品。
  4. 在同一培养皿中，将 20 μl 过滤后的 2% 磷钨酸滴加在样品旁边。
  5. 将透射电镜载网哑光面朝下，轻轻滴落在样品上。
  6. 室温孵育 1 分钟。
  7. 轻轻将电镜载网侧面在滤纸上轻触，以去除载网上的样品液滴。
  8. 将电镜载网哑光面朝下，轻轻滴落在 2% 磷钨酸溶液上。
  9. 室温孵育 1 分钟。
  10. 轻轻将电镜载网侧面在滤纸上轻触，以去除载网上的磷钨酸溶液。
  11. 使用透射电子显微镜（TEM）拍摄脂蛋白的图像（图 4）。

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结果

图1展示了正常培养至接种后第13天的融合后Caco-2细胞。穹顶状结构和细胞内脂滴的出现是分化成熟的Caco-2细胞的典型特征。当Caco-2细胞在接种过程中未均匀分散时，细胞会聚集并在培养皿的某些区域过度生长，导致培养皿中部分区域无细胞分布。应避免晃动培养皿或将培养皿置于倾斜的表面上。还需注意，融合后的Caco-2细胞在更换新鲜培养基时若操作过于剧烈，更容易发生脱落。因此，添加新鲜培养基时应轻柔操作，以防止细胞脱落。

根据这些研究，Caco-2 细胞的转染效率在 30–60% 之间（图 2 上图）。相比之下，使用慢病毒表达系统对 Caco-2 细胞进行转导时，转导效率约为 100%（图 2 下图）。图 2 还显示，浓缩慢病毒的最佳用量为 10 μl。转导后的 Caco-2 细胞可维持培养至 12 代。如图所示，即使经过 12 代培养，转导细胞仍持续表达 eGFP。转导效率明显依赖于慢病毒的浓度。转染/转导效率的确认至关重要，应在正式实验前作为常规...

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讨论

本文描述了可用于培养Caco-2细胞的两种系统，即常规组织培养皿和可渗透膜系统。使用可渗透膜系统的优势包括能够分离顶端和基底外侧区室，并可同时孵育脂质混合物并收集脂蛋白分泌物。然而，可渗透膜插件价格昂贵，且其聚碳酸酯膜不利于细胞的良好观察。该方法的优点之一是 体外 该模型的优势在于基因操作研究将更加经济且耗时更少。为了获得更好的效果，应使用慢病毒表达系统。转导后的Caco-2细胞通常能够维持其外源基因的表达。

Caco-2 细胞生成乳糜微粒的能力至关重要。若缺乏此能力，Caco-2 细胞将无法有效转运亲脂性物质，包括但不限于亲脂性药物、维生素 A、D、E 和 K，以及任何脂溶性营养物质。文中描述了刺激 Caco-2 细胞生成极低密度脂蛋白（VLDL）颗粒和乳糜微粒的适当方法。这些脂蛋白颗粒的成功分离应通过透射电子显微镜（TEM）加以确认。根据现有文献，该 Caco-2 模型在其他 Caco-2 模型中提供了最高效的脂质转运能力12–14。然而，in vivo 淋巴导管插管模型在脂质...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了加州北州大学药学院种子基金奖（授予 AMN）的支持。作者感谢加州北州大学药学院承担本文的发表费用，同时感谢 George Talbott 在稿件编辑过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMVWR16750-112在添加细胞前，将生长培养基预热至单个组织培养皿中
FBSFisher3600511我们不对血清进行热灭活处理
胰蛋白酶（Trypsin）VWR45000-660胰蛋白酶处理前可用 PBS 洗涤细胞 
可渗透膜系统Fisher7200173直径10 cm培养皿，孔径3 mm，聚碳酸酯膜
10 cm 培养皿Fisher08-772-E组织培养皿
15 cm 培养皿Fisher08-772-24组织培养皿
24孔板Fisher12565163组织培养板
脂质体转染试剂FisherPRE2691可替换为其他转染试剂
低血清培养基Invitrogen11058021用于转染
pLL3.7 eGFPAddgene11795https://www.addgene.org/11795/
瓶顶滤器Fisher9761120孔径0.45 mm
聚凝胺（Polybrene）FisherNC984045410 mg/mL
油酸（Oleic acid）Sigma01383-5G避免反复冻融
卵磷脂（Lecithin） FisherIC10214625蛋黄卵磷脂 
牛磺胆酸钠（Sodium taurocholate）FisherNC9620276产品已停产；替代货号：50-121-7956
蛋白酶抑制剂混合片剂（无EDTA）Fisher5892791001主要用于需要进行透射电镜（TEM）分析的样品
聚碳酸酯超速离心管FisherNC9696153多次重复使用会导致离心管塌陷
超速离心管盖FisherNC9796914需使用专用工具将离心管/管盖从转子中取出
注射器Fisher50-949-261一次性使用
注射器滤器Fisher09-719C孔径 = 0.2 mm；尼龙材质
磷钨酸（Phosphotungstic acid）FisherAC208310250用于配制2%磷钨酸溶液，pH 6.0
镊子Fisher50-238-62超细且坚固的尖端
Formvar/碳支持膜铜网Fisher50-260-34400目方格Formvar/碳膜铜网

参考文献

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