一种可重复的计算机化方法通过甲襞毛细血管显微镜检测定量毛细血管密度

摘要

甲襞微循环显微镜检查是一种无创、高效、相对经济且易于掌握的技术，可直接观察微循环中的毛细血管。然而，迄今为止仅有一篇文献报道了用于定量分析甲襞微循环数据的复杂软件程序的可靠性。本文中，我们介绍一种基于标准化算法的简单且可靠的毛细血管定量分析方案。

摘要

甲襞毛细血管显微镜检查是一种无创、高效、相对经济且易于掌握的技术，可直接观察微循环。该技术能够反映患者的微血管健康状况，因而在皮肤科、眼科、风湿科和心血管科等多种临床领域具有潜在的重要应用价值。此外，肿瘤生长可能依赖于血管生成，而通过测量肿瘤内的微血管密度可对这一过程进行量化。然而，目前该领域尚缺乏统一的技术标准，且迄今为止仅有一篇文献报道了现有复杂计算机算法在量化毛细血管显微镜数据方面的可靠性¹。本文介绍了一种新的、更简便、可靠且标准化的毛细血管计数算法，用于量化甲襞毛细血管显微镜数据。此类简单且可重复的计算机化毛细血管显微镜分析算法，将有助于该技术在科研人员和临床医生中的更广泛应用。目前许多研究人员仍采用手工方式分析毛细血管显微镜图像，容易导致操作者疲劳并引入结果的主观性。本文描述了一种新颖、易于使用的全自动图像处理算法，以及一种可重复的半自动化计数算法。该算法可在数分钟内完成图像分析，显著降低主观性；掌握该技术所需的培训时间极短（根据我们的经验，少于1小时）。

引言

微血管成像技术是一个发展迅速的领域，具有多种潜在的临床应用价值。² 例如，肿瘤学家正利用微血管成像来评估肿瘤血管生成的程度，从而获得有关肿瘤状态的重要信息，并为可能的治疗方案提供参考。³⁴ 然而，甲襞毛细血管显微镜检查可能是目前成本效益最高且应用最广泛的微血管成像方式。研究人员正采用视频甲襞毛细血管显微镜技术来研究血流速度并分析毛细血管形态。⁵⁶ 视频与静态图像甲襞毛细血管显微镜检查均可作为辅助手段，用于雷诺现象及包括系统性硬化症在内的多种结缔组织疾病的诊断与治疗。²

甲襞毛细血管显微镜检查在心血管领域也具有多种潜在应用。目前利用甲襞毛细血管显微镜检查开展的研究表明，1型和2型糖尿病患者中存在异常毛细血管形态的比例较高，但与非糖尿病个体相比，其毛细血管密度保持不变^7-8。毛细血管显微镜检查也已在高血压中进行实验性研究。与非高血压个体相比，高血压个体表现出结构性毛细血管稀疏，导致毛细血管密度降低^9-10。与这些年龄较大（平均年龄40岁及以上）并表现出结构性稀疏的高血压患者不同，近期研究显示，较年轻的高血压患者（平均年龄低于40岁）存在功能性稀疏，而无结构性稀疏¹¹。这表明功能性稀疏可能先于结构性稀疏发生，并可能随时间推移发展为结构性稀疏。

有趣的是，接受特定降压药物（如培哚普利/吲达帕胺）治疗的高血压患者在治疗后表现出正常的毛细血管密度和内皮功能，而接受血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂或利尿剂治疗的患者尽管血压控制程度相当，毛细血管密度仍保持较低水平¹²。这表明某些降压药物可能通过逆转高血压引起的毛细血管稀疏来使毛细血管密度恢复正常。此外，其他研究人员已证实，减少盐摄入量可使高血压个体的功能性和结构性毛细血管稀疏发生逆转¹³。

尽管该技术具有多种潜在的临床应用价值，但目前在毛细血管密度图像的定量技术方面仍缺乏标准化。² 研究表明，只有在每次计数均针对完全相同区域的情况下，毛细血管密度的结果才具备观察者内部和观察者之间的可重复性。^{1,14 15} 值得注意的是，以往的研究人员主要依靠肉眼手动进行毛细血管计数，^{9 16 1718} 这一过程耗时且具有主观性。

标准化的计算机算法在毛细血管图像定量分析中理论上能够提供更高效、更可重复的数据分析结果，减少主观性，从而促进毛细血管显微镜技术在临床中的应用。一些研究人员确实已使用基于计算机的程序对甲襞毛细血管镜图像数据进行定量分析^{1,6 19 20}。然而，迄今为止仅有一篇文献报道了可用于定量毛细血管镜数据的复杂软件程序的可靠性¹，且如上所述，该程序较为复杂，因其要求必须对完全相同的视野进行计数。本文中，我们提出一种更简便且可靠的毛细血管定量方案，采用标准化算法，允许多个视野的使用。多个视野的使用不仅简化了操作流程，还可评估毛细血管计数中正常的生物学变异。

本研究的目的是描述一种可重复且高效的基于计算机的算法，该算法可标准化毛细血管定量过程。尽管这些方法尚未完全自动化，但所需用户输入极少，能够对图像进行快速而可靠的定量分析。

方案

注意：获取毛细血管图像的采集过程此前已有发表，是通过使用静态数码相机并结合相应的图像采集与分析计算机程序来完成的。¹¹²¹ 本实验室采用静态图像进行分析，而非视频，从而简化了用于分析的图像采集过程。以下描述了从图像中定量毛细血管的新技术。

1. 图像增强过程

1. 使用单色数字相机获取数字图像。通过用相机拍摄已知长度的物体（例如尺子）的图像，对图像进行校准，使计算机程序能够在后续处理中准确测量和计数毛细血管。为获得最高精度，理想情况下应使用网格目镜（即表面蚀刻有标尺的精密制造玻璃片）。使用计算机程序测量1 mm²方框内的像素数量。
   注意：该实验方案的可重复性与标准化在很大程度上取决于1 mm² 被计数的盒子
2. 使用对比度增强工具加深毛细血管并提亮背景，以最大程度地显示毛细血管。在后续步骤中，正确裁剪图像前，首先区分毛细血管与背景至关重要。可通过调整图像的“最佳拟合直方图”实现此目的。具体操作为：点击 capture、intensity、image histogram、best fit。
3. 裁剪毛细血管计数的感兴趣区域（ROI）作为新图像（选择，感兴趣区域）。使用1 mm² 盒子，其尺寸通过校准图像确定，530像素等于1毫米。检查裁剪后的图像是否将毛细血管环的顶端置于图像的最顶端。
4. 展平图像，以便将所有后续的图像调整均匀地应用于图像。操作方法为：点击“process”选项卡，选择“2D filters”，点击“flatten”，背景强度（BG intensity）设为“bright”，对象宽度（object width）设为“75”，然后应用。
5. 提高图像对比度，以最大程度地显示毛细血管。操作方法为：点击“调整”选项卡，选择“显示”，将对比度提高至75。
6. 点击“处理”选项卡，选择“2D滤波器”，点击“去斑”，设置核大小为7×7，应用以平滑毛细血管边缘。
7. 调整图像对比度，使毛细血管呈黑色，背景呈白色。通过将直方图调整为“最佳拟合”模型来完成此步骤。
   注意：请参见 图2 参见代表性结果，了解按这些步骤处理后图像应呈现的样貌。

2. 进行毛细血管计数 / 定量毛细血管密度

1. 在每张图像上，使用“目标对象”功能手动选择一条定义清晰的毛细血管的一部分，作为程序计数时识别的对象。然后，使用“背景”功能选择一小部分背景区域，作为计数算法需忽略区域的参考。
   注意：上述两种标记的结合可使所有毛细血管被高亮显示，同时排除背景噪声。定量（计数）协议利用计算机功能，根据颜色和形态差异对图像各部分进行区分。
2. 使用计数功能，通过成像设备立即统计图像中所有毛细血管。将被计数对象的最小直径设置为5像素，以避免将背景噪声误计为毛细血管。
3. 对每个个体，计算3 - 4张图像的平均值，以获得更可靠的评估结果。
   注意：请参见代表性结果中的图3，了解计数过程中图像应呈现效果的示例。

3. 创建和使用宏以自动执行图像处理

注意：为了节省时间，可以创建宏，以自动对一张或多张图像执行特定的处理流程。这些流程可根据需要进行自定义，从而加快图像修改的速度。本质上，这些宏会记录图像的处理步骤，并快速自动执行所有操作，无需用户干预。使用宏对12张毛细血管图像进行计数，本实验室耗时20至30分钟（每张图片2至3分钟），而不用宏时每张图片约需8分钟。因此，使用宏的效率比手动逐张处理图像高3至5倍。

1. 为了创建宏，请选择“录制宏”，并在一幅图像上执行上述步骤1和步骤2中所述的操作流程。根据所执行的图像处理步骤为宏命名，以便日后参考。在后续图像上使用该宏时，只需点击“运行宏”，程序便会自动将已记录的处理步骤应用到所需图像上。
   注意：本实验使用宏在数秒内完成方法部分第1节中除一步之外的所有操作。唯一需要用户手动输入的步骤是选择图像的裁剪区域，即步骤1.2。

结果

图像处理过程的目标是将毛细血管与背景图像区分开来，以便能够对其进行准确定量。图像处理不足或过度处理都会影响程序对毛细血管的定量能力。如图3所示，处理不足会导致毛细血管难以与背景区分。用户必须能够清晰识别毛细血管的边界，因为上述计数方法依赖于用户准确勾画少数毛细血管的能力。另一方面，如图3所示，不必要的图像处理步骤可能导致毛细血管模糊，从而同样不利于定量过程。

经过最佳处理的图像可在30秒内完成计数，并能清晰地区分毛细血管与背景，以及各毛细血管之间的界限。图2的D部分展示了处理后图像的示例，计数结果见图3。

甲床不同部位的毛细血管密度存在差异。表1显示，随着与甲床顶部毛细血管排的距离增加，毛细血管密度也随之升高。感兴趣区域（ROI）位置的标准化对于计数的可重复性至关重要。图1展示了不同ROI放置方式对图像的影响。

讨论

甲襞毛细血管显微镜检查在未来的肿瘤学、心血管疾病和风湿性疾病临床应用中展现出良好的应用前景。尽管研究人员在图像采集过程方面已较为一致，但目前图像处理与分析仍存在多种方法。现有方法包括计算机辅助和人工毛细血管计数。人工计数存在耗时长、易受操作者主观判断及疲劳影响等问题。当前基于计算机的方法在图像增强和定量分析过程中仍需要大量人工干预。本文所述的新方法对操作者培训和参与要求较低，因为图像增强步骤完全自动化。仅在初始计数阶段需要人工参与，以在处理后的图像中区分毛细血管与背景。采用本文所述的自动化宏程序，其处理效率比逐张手动处理图像高出三至五倍。

目前缺乏可靠的标准化计算机算法来定量分析甲襞微循环显微镜数据。

为了减少主观性并提高效率，需要可靠的标准化计算机方法来进行毛细血管定量分析。本文所述技术表现出优异的可靠性，在观察者内部和观察者之间的可重复性方面均获得良好结果，组内相关系数为0.93至0.98。我们此前已报道过通过计算机化毛细血管密度评估所获得结果与金标准——人工计数之间的相关性²¹。在10名受试者中，软...

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