阿尔茨海默病伴发脑卒中转基因大鼠模型中运动功能及海马依赖性空间学习与参考记忆评估

摘要

为了在一种新型模型中研究阿尔茨海默病（AD）与脑卒中共病的情况，本文描述了三种用于评估运动控制和认知行为的行为学任务。这些任务包括平衡木行走实验、圆筒实验和莫里斯水迷宫实验。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种导致神经退行性变和记忆丧失的严重神经退行性疾病。虽然年龄是AD的主要风险因素，但中风也被认为是其风险因素和加重因素。与单独患有中风或AD相比，中风与AD共病会导致更严重的中风相关运动控制障碍以及更显著的AD相关认知功能缺损。为了模拟中风与AD共病的情况，研究人员采用一种新型的AD转基因大鼠模型，该模型在其DNA中整合了突变形式的淀粉样前体蛋白（一种参与AD发病的关键蛋白），并在此大鼠上诱导产生小范围的单侧纹状体中风。

对于同时模拟脑卒中和阿尔茨海默病（AD）的模型，必须实施能够评估脑卒中相关运动控制、运动功能以及AD相关认知功能的行为学测试。圆筒实验采用一种成本低廉且用途广泛的装置，用于评估动物前肢的自发性运动使用情况。在该实验中，将大鼠置于一个圆柱形装置内，大鼠会自发性地直立并用前肢接触圆柱壁。这些接触行为被视为前肢运动使用，在测试结束后通过视频分析进行量化。另一种成本较低的运动功能测试是横梁行走实验，用于评估前肢控制能力、后肢控制能力以及运动功能。该实验要求大鼠穿过一根木质横梁，通过分析前肢打滑、后肢打滑以及跌落情况来评估肢体运动控制能力。本行为学范式中，学习与记忆功能的评估采用莫里斯水迷宫实验。该实验方案首先进行空间学习训练，即大鼠寻找一个固定且隐藏的平台。完成空间学习后，移除平台，进而评估短期和长期的空间参考记忆。上述三项实验均对行为学差异具有较高敏感性，且可在28天内完成，因此该行为学范式具有较高的时间效率和成本效益。

引言

阿尔茨海默病（AD）是老年人群中最常见的痴呆类型，也是一种致残性神经退行性疾病。从组织病理学上看，AD表现为淀粉样斑块、神经原纤维缠结和神经元丢失。淀粉样斑块主要由β-淀粉样肽（Aβ）构成，Aβ是淀粉样前体蛋白（APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶异常蛋白水解切割后产生的^1,2,3。其切割产物Aβ在脑内沉积，形成病理性淀粉样斑块，并对大脑产生毒性作用，导致典型的认知障碍和记忆丧失。上述所有过程合称为"淀粉样级联假说"^3,4。尽管该假说在AD研究中具有重要意义，但已发现其他细胞变化早于斑块形成，偏离了最初的淀粉样级联通路。这些其他细胞变化被认为在斑块形成之前即参与了AD相关的早期记忆丧失、学习障碍及其他认知功能障碍^3,5,6。

随着阿尔茨海默病（AD）的发病率日益升高，AD发病的风险因素已成为研究的重要焦点。尽管年龄是散发性AD最主要的危险因素，但其他风险因素也已被识别，包括中风^7,8。中风不仅是风险因素，还可能加重已存在的痴呆症状。例如，临床研究表明，既往曾发生中风的患者，其AD病情进展更为严重⁹。此外，在实验性动物模型中，将Aβ毒性与诱导性中风相结合的研究发现，APP表达增加以及Aβ积聚加剧^10,11。鉴于中风与AD之间存在这种重要的相互作用，有必要在共病模型中对这两种病理过程进行联合深入研究，以更好地理解两者共同涉及的病理生理机制....

方案

所有行为学实验操作均须在开始实验前获得相应机构动物伦理委员会的批准。本文所述所有动物实验均已通过西安大略大学动物使用小组委员会的审批，并遵循加拿大动物护理委员会的指导方针。 这些动物实验均在光照期进行。

1. 粗大前肢运动功能评估的圆柱体实验

1. 设备设置
   1. 获取一个带有穿孔盖的有机玻璃圆柱体，其尺寸应与实验所用大鼠的体型相匹配。圆柱体的尺寸应确保大鼠在直立时无法触及顶部，且圆柱体壁与大鼠鼻尖之间以及与大鼠尾基部之间均保留约2 cm的空间。对于6月龄（400–600 g）的大鼠，标准圆柱体尺寸为直径23 cm、高40 cm。
   2. 将一面镜子以45°角置于圆柱装置下方，圆柱装置放置在亚克力支架或其他支撑物上，距桌面约30 cm。
   3. 将摄像机安装在三脚架上，调整至适当距离，使圆柱体在摄像机监视器中的镜像能够完整显示其直径。
   4. 将灯光调至较暗的设置，并在房间内播放白噪声（即 低音量、轻柔的音乐，以减少突然出现的较大噪音带来的影响。这有助于促进活动，防止因噪音过大而出现僵直反应。
2. 实验步骤
   1. 将大鼠移至实验室内，于首项试验开始前30分钟进行适应，期间播放音乐并调暗灯光，使大鼠适应环境。
   2. 填写相应的动物和试验信息（即 在小块白板上记录动物编号、时间线中的天数和试验编号，并将该白板放置于镜子前方....

结果

所述行为学任务用于验证脑卒中在阿尔茨海默病APP21转基因大鼠模型中的影响。脑卒中与APP21转基因的联合作用预计会导致受累肢体出现更严重的运动功能缺损，并加重记忆功能障碍。

圆柱体实验用于评估前肢粗大运动功能，以患侧前肢的使用情况来表示。此外，平衡木行走实验则专门用于评估后肢运动功能和运动能力。由于脑卒中是在右侧纹状体诱导产生的，因此如果存在运动功能障碍，预期左侧前肢将表现出运动缺陷。在图2以及图3a和3b中呈现的数据在统计学上并未表明共病转基因大鼠存在前肢或后肢运动功能缺陷。尽管这些动物似乎没有明显的前肢或后肢运动功能障碍，但在与运动相关的运动功能方面确实表现出轻微差异。在平衡木行走实验中，共病转基因卒中大鼠的总步数显著增加（p <0.05，图3c），提示该实验足够敏感，能够检测到步态和运动.......

讨论

脑卒中与阿尔茨海默病的共同作用会导致显著的行为病理学改变，这些改变可能影响运动功能和认知功能，具体取决于每种疾病的严重程度。因此，有必要采用多种行为学任务来确定这两种疾病各自的独立影响，同时揭示其在共病状态下可能存在的联合效应和相互作用。本文所展示的数据表明，三种经济高效、时间高效且敏感的行为学任务可用于评估一种新型共病APP21转基因大鼠模型在发生脑卒中后运动功能以及海马依赖的空间学习和参考记忆能力。除本文所展示的数据外，这些行为学任务已在更严重的脑卒中模型^10,14,18以及阿尔茨海默病（AD）模型^8,16中得到验证，应可广泛适用于这两种疾病的多种动物模型。

尽管如此，任何实验任务都存在一定的局限性。对于运动任务而言，如果大鼠对圆筒和横梁产生习惯化，可能需要进行一些故障排除。在圆筒实验中，可能需要采取激励措施，以确保大鼠用前肢充分接触圆筒壁。为实现这一目标，可在圆筒的穿孔盖子或筒壁上涂抹无毒气味物质，以促使大鼠直立并用前肢接触筒壁。例如，可在圆筒内壁靠近顶部的位置涂抹少量花生酱或香草精，进一步鼓励活动较少的大鼠探索筒壁。此外，也可在圆.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
圆柱体	西方大学	Plexiglas 圆柱体 圆柱体直径：23 cm 圆柱体高度：40 cm 平台高度：30 cm 镜子长度：35 cm 镜子宽度：26.5 cm	该装置由西方大学机械服务中心专为本实验室定制。请联络您选定的制造商设计此产品。
手持式摄像机	JVC	GZ-E200
摄像机三脚架	Slik	F163
调幅/调频时钟收音机	Sylvania	SCR1388
白板	沃尔玛	宽度：71.12 cm 高度：55.88 cm	此类物品可在任意商店购买（例如沃尔玛、大学书店）
白板笔	Expo	Expo 白板笔原装款	此类物品可在任意商店购买（例如沃尔玛、大学书店）
木梁	Rona	胶合板 宽度：2 cm 长度：100 cm
VWR 通用实验室胶带	VWR Intl.	89097-920
iMovie '11	Apple Inc.	版本 9.0.9 (1795)	本文稿使用的是此版本，但其他任何 iMovie 版本或视频编辑软件亦可使用。
莫里斯水迷宫池及平台	Stoelting Co.	60136/60035	这些并非视频中使用的精确产品，但本质上完全相同。
平台提示物	-	-	所用平台提示物由小型金属支架和白色球形泡沫球制成。此类材料可能在任何销售家装材料的商店（例如沃尔玛、Rona 等）购得。
Mainstays 71" 落地灯	沃尔玛	HW-F0377SLV
ANY-Maze 行为追踪软件	Stoelting Co.	60000	ANY-maze® 提供包含摄像机（可选配计算机及配件）的套装。
紧凑型摄像机	Logitech	V-U0023
笔记本电脑	惠普	HP Pavilion dv6 笔记本电脑	笔记本电脑具体配置：AMD A6-3420M APU 搭载 Radeon HD 显卡，主频 1.50 GHz，6.00 GB 内存，64 位操作系统。
Americana 无毒丙烯酸涂料	DecoArt	DAO67-9	可通过 DecoArt 官网订购，或在 DecoArt 零售商门店购买。
海报板	沃尔玛	PA-1961