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方法文章

阿尔茨海默病伴发脑卒中转基因大鼠模型中运动功能及海马依赖性空间学习与参考记忆评估

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DOI：

10.3791/53089

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2016年3月22日

 ,  ,  ,  , 
1Anatomy and Cell Biology, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University

本文内容

摘要

为了在一种新型模型中研究阿尔茨海默病（AD）与脑卒中共病的情况，本文描述了三种用于评估运动控制和认知行为的行为学任务。这些任务包括平衡木行走实验、圆筒实验和莫里斯水迷宫实验。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种导致神经退行性变和记忆丧失的严重神经退行性疾病。虽然年龄是AD的主要风险因素，但中风也被认为是其风险因素和加重因素。与单独患有中风或AD相比，中风与AD共病会导致更严重的中风相关运动控制障碍以及更显著的AD相关认知功能缺损。为了模拟中风与AD共病的情况，研究人员采用一种新型的AD转基因大鼠模型，该模型在其DNA中整合了突变形式的淀粉样前体蛋白（一种参与AD发病的关键蛋白），并在此大鼠上诱导产生小范围的单侧纹状体中风。

对于同时模拟脑卒中和阿尔茨海默病（AD）的模型，必须实施能够评估脑卒中相关运动控制、运动功能以及AD相关认知功能的行为学测试。圆筒实验采用一种成本低廉且用途广泛的装置，用于评估动物前肢的自发性运动使用情况。在该实验中，将大鼠置于一个圆柱形装置内，大鼠会自发性地直立并用前肢接触圆柱壁。这些接触行为被视为前肢运动使用，在测试结束后通过视频分析进行量化。另一种成本较低的运动功能测试是横梁行走实验，用于评估前肢控制能力、后肢控制能力以及运动功能。该实验要求大鼠穿过一根木质横梁，通过分析前肢打滑、后肢打滑以及跌落情况来评估肢体运动控制能力。本行为学范式中，学习与记忆功能的评估采用莫里斯水迷宫实验。该实验方案首先进行空间学习训练，即大鼠寻找一个固定且隐藏的平台。完成空间学习后，移除平台，进而评估短期和长期的空间参考记忆。上述三项实验均对行为学差异具有较高敏感性，且可在28天内完成，因此该行为学范式具有较高的时间效率和成本效益。

引言

阿尔茨海默病（AD）是老年人群中最常见的痴呆类型，也是一种致残性神经退行性疾病。从组织病理学上看，AD表现为淀粉样斑块、神经原纤维缠结和神经元丢失。淀粉样斑块主要由β-淀粉样肽（Aβ）构成，Aβ是淀粉样前体蛋白（APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶异常蛋白水解切割后产生的1,2,3。其切割产物Aβ在脑内沉积，形成病理性淀粉样斑块，并对大脑产生毒性作用，导致典型的认知障碍和记忆丧失。上述所有过程合称为"淀粉样级联假说"3,4。尽管该假说在AD研究中具有重要意义，但已发现其他细胞变化早于斑块形成，偏离了最初的淀粉样级联通路。这些其他细胞变化被认为在斑块形成之前即参与了AD相关的早期记忆丧失、学习障碍及其他认知功能障碍3,5,6。

随着阿尔茨海默病（AD）的发病率日益升高，AD发病的风险因素已成为研究的重要焦点。尽管年龄是散发性AD最主要的危险因素，但其他风险因素也已被识别，包括中风7,8。中风不仅是风险因素，还可能加重已存在的痴呆症状。例如，临床研究表明，既往曾发生中风的患者，其AD病情进展更为严重9。此外，在实验性动物模型中，将Aβ毒性与诱导性中风相结合的研究发现，APP表达增加以及Aβ积聚加剧10,11。鉴于中风与AD之间存在这种重要的相互作用，有必要在共病模型中对这两种病理过程进行联合深入研究，以更好地理解两者共同涉及的病理生理机制及行为学改变。

为了研究共病情况，需要建立一个合适的模型，使脑卒中能够与 Aβ 相互作用，从而产生类似阿尔茨海默病（AD）的病理变化。首次使用了一种携带突变人源 APP 基因的 APP21 转基因大鼠，以建立合适的 AD 模型。这些突变为瑞典型双错义突变和印第安纳型单错义突变，二者均与家族性阿尔茨海默病相关4,8,12。在无额外损伤的情况下，该大鼠模型在衰老过程中不会出现典型的 Aβ 斑块或神经纤维缠结12。因此，为了诱导类似 AD 的行为学病理改变，通过在右侧纹状体诱发小梗死灶，模拟痴呆患者中常见的小的皮质下脑卒中9。在 APP21 转基因大鼠中引入脑卒中可模拟共病状态，从而能够研究两种疾病状态下共同涉及的多种行为改变。特别是，在成年大鼠中诱导出类似 AD 的病理变化和认知缺陷，使我们能够探究 AD 发生之前最早期的分子和认知变化。

由于目标是确定行为变化的最初迹象，而中风和阿尔茨海默病（AD）具有截然不同的行为病理特征，因此在研究共病模型时，行为学任务需要评估多种行为表型。已有若干相对敏感的测试方法可用于分析啮齿类动物模型中的运动与认知行为，这些方法涉及多种实验范式和设备。为特异性分析前肢和后肢的运动功能，已采用圆筒实验（cylinder task）和平衡木行走实验（beam-walk task）来检测运动功能障碍并监测该模型中的运动能力。其他一些敏感性任务则被设计用于特异性评估前肢精细运动技能（即 阶梯任务和单颗粒抓取任务）需要食物剥夺11,13,14为避免食物剥夺对疾病病理学已知影响的干扰15,16,17，这些测试被认为不适用于本研究。圆筒实验通过记录大鼠在新环境中直立时前肢的自发使用情况，可检测单侧脑卒中大鼠前肢使用上的不对称性。10,18该实验任务的一个主要优势在于，所使用的装置还可用于其他行为学实验，例如波索尔特（Porsolt）强迫游泳实验19与圆柱体实验不同，平衡木行走实验除了可用于分析运动功能外，还可用于分析后肢和前肢的运动控制10,14. 束桥行走测试包含运动功能、平衡能力以及精准足部定位三个组成部分。这两种测试方法成本低、操作简便且耗时短，能够阐明中风和阿尔茨海默病对肢体功能差异的影响。

除了运动功能的改变外，阿尔茨海默病（AD）还涉及记忆障碍，这些障碍可在疾病进展的早期阶段出现。在研究啮齿类动物模型中的AD样病理时，评估依赖海马的学习与记忆功能至关重要，因为海马是AD中受累最显著的重要脑结构之一2。海马是空间学习和记忆的关键脑区，其功能可通过多种迷宫范式在啮齿类动物中进行检测。其中，莫里斯水迷宫是用于不同疾病啮齿类动物模型中最广泛使用的一种迷宫任务20。莫里斯水迷宫利用空间线索帮助大鼠定位一个固定的隐藏平台，并在移除平台后测试其空间参考记忆。水迷宫实验装置的一个重要优势在于，其设计可根据具体的研究问题进行高度调整和适应20。

首次采用所述技术，在一种新型的卒中与阿尔茨海默病共病大鼠模型中评估运动与认知功能，该模型涉及APP21转基因大鼠发生的小卒中。 通过在APP21转基因大鼠的纹状体内诱导血管收缩以产生小卒中，从而建立共病模型。该卒中模型在另一种阿尔茨海默病大鼠模型中已被充分确立为共病状态。11. 推进这一新型APP21转基因大鼠模型的建立，旨在产生更具转化价值的模型。尽管行为学任务是使用共病卒中与阿尔茨海默病（AD）的大鼠模型进行描述，但这些任务还可进一步应用于其他卒中模型或其他神经系统疾病模型即 帕金森病）。所描述的通用方法可广泛适用于这些其他疾病状态，但行为测试的时间线和范式可能需要根据具体的研究问题和模型进行调整。除了具有良好的适应性外，所述任务在检测细微功能缺陷方面也具有较高效能，同时兼具成本低和耗时短的优点。 

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方案

所有行为学实验操作均须在开始实验前获得相应机构动物伦理委员会的批准。本文所述所有动物实验均已通过西安大略大学动物使用小组委员会的审批，并遵循加拿大动物护理委员会的指导方针。 这些动物实验均在光照期进行。

1. 粗大前肢运动功能评估的圆柱体实验

  1. 设备设置
    1. 获取一个带有穿孔盖的有机玻璃圆柱体，其尺寸应与实验所用大鼠的体型相匹配。圆柱体的尺寸应确保大鼠在直立时无法触及顶部，且圆柱体壁与大鼠鼻尖之间以及与大鼠尾基部之间均保留约2 cm的空间。对于6月龄（400–600 g）的大鼠，标准圆柱体尺寸为直径23 cm、高40 cm。
    2. 将一面镜子以45°角置于圆柱装置下方，圆柱装置放置在亚克力支架或其他支撑物上，距桌面约30 cm。
    3. 将摄像机安装在三脚架上，调整至适当距离，使圆柱体在摄像机监视器中的镜像能够完整显示其直径。
    4. 将灯光调至较暗的设置，并在房间内播放白噪声（即 低音量、轻柔的音乐，以减少突然出现的较大噪音带来的影响。这有助于促进活动，防止因噪音过大而出现僵直反应。
  2. 实验步骤
    1. 将大鼠移至实验室内，于首项试验开始前30分钟进行适应，期间播放音乐并调暗灯光，使大鼠适应环境。
    2. 填写相应的动物和试验信息（即 在小块白板上记录动物编号、时间线中的天数和试验编号，并将该白板放置于镜子前方。
    3. 在镜子前方放置好带白板的摄像机并开始录像，抓住大鼠尾部基部，将大鼠放入圆筒中并盖紧盖子。站在圆筒侧边，避免干扰视频录制。
    4. 从镜子前方移除白板，让摄像机记录大鼠在圆筒中的行为5分钟（使用计时器，从移除白板时开始计时5分钟）。此为一次试验。
    5. 试验结束后，用纸巾和水清洁圆筒。
    6. 重复步骤 1.2.2–1.2.5 两次，共完成三次试验。每次试验之间应间隔 20–30 分钟，以降低对圆筒产生习惯化的可能性。在此期间，可对其他大鼠进行圆筒试验。
  3. 视频分析
    1. 将摄像机视频文件导入视频编辑程序即 iMovie
    2. 将视频剪辑为每个试验的片段。关闭视频的音频，并将视频速度降低至原始速度的25%。
    3. 分别记录左前肢和右前肢与圆筒壁接触的次数。当左右前肢同时接触时，将这些前肢接触计为 "两者"请注意，视频是通过镜面录制的，因此视频中显示的左前肢实际上对应动物真实的右前肢。
    4. 使用以下公式计算患侧前肢（对侧于脑卒中侧）的使用百分比：[(患侧触地次数 + ½ 双侧触地次数) / 触地总次数] × 100。 野生型组和无脑卒中的转基因组的表现均被视为对照组，用于评估疾病诱导问题的呈现情况。

2. 用于粗大运动评估的光束行走实验

  1. 设备设置
    1. 获取一个光滑密封的 宽2 cm、长约120 cm的木梁（适用于200–600 g大鼠的最佳宽度）。
    2. 将两张桌子或置物架放置在相距100 cm的位置，每个单元的表面距离地面约40 cm。
    3. 使用胶带将梁的两端固定在桌面或架子表面。此时，应使约1米长的梁段悬空，并抬高至离地面40厘米处。
    4. 将摄像机安装在支架上，确保能够拍摄到横梁的整个长度。使用白化大鼠时，为增强视频中的对比度，可在横梁后方设置黑色背景。
  2. 实验步骤
    1. 将大鼠移至实验室内，于首次试验开始前30分钟进行适应性放置，期间播放音乐并调暗灯光，使大鼠适应环境。
    2. 将大鼠的笼舍或环境富集管置于横梁的一端，将大鼠放置于横梁的另一端。
    3. 在正式实验前两天进行数次非记录性训练。让大鼠探索区域，并通过握住大鼠尾根部引导其走向横梁。
    4. 当大鼠穿过横梁后，将笼子或管子移至横梁另一端并重复该过程。当大鼠能够自由地在两个方向上穿过横梁时，训练阶段结束。所有动物之间的训练次数应保持一致。
    5. 填写相应的动物和试验信息（即 动物编号、时间线中的天数和试验编号）写在一块小的白板上，并将该白板用胶带固定在平衡木后方的墙上。
    6. 将大鼠的笼具或环境富集管道放置在横梁的一端。
    7. 按下摄像机的录制按钮，用镊子夹住大鼠尾根部将其提起，放置于横梁远离笼盒或导管的一端。
    8. 记录整个试验过程，试验结束于大鼠成功穿越高架横杆的全程。若大鼠在横杆中途停留，可轻轻抓握其尾根部或轻触尾巴以促使其继续前行。切勿以任何方式推动大鼠前进。
    9. 重新进行大鼠在横梁上行走时出现侧身、反复停止或行走不连贯的试验。若大鼠跌落但仍悬挂在横梁上，应轻轻将其托起，并放回跌落处的横梁位置，继续试验。
    10. 将饲养笼或管道移至横梁的另一端，更改白板上的试验编号，并记录下一次试验。
    11. 重复此步骤，直至总共完成6次试验，每个方向记录3次试验。可在开始下一只大鼠的试验前，先完成并记录该大鼠全部6次试验。
  3. 视频分析
    1. 将摄像机视频文件导入视频编辑程序即 iMovie
    2. 将视频按每次试验剪辑成片段，并静音视频中的声音。逐帧分析每个视频片段。
    3. 记录大鼠行走横梁全长所用的总步数，以及左后肢、右后肢、左前肢和右前肢滑落的总次数，还有跌落的总次数。 将野生型组和无卒中转基因组的表现与共病组进行比较，以评估共病条件下特有的功能缺陷的出现情况。

3. 用于海马依赖性空间学习和参考记忆的莫里斯水迷宫

  1. 设备设置
    1. 在圆形水池（直径148 cm，深度58 cm）中心正上方固定一台摄像机。在追踪软件程序中正确对齐水池轮廓所划分的四个指定象限。
    2. 向圆形水池中注入约36 cm深的水。 建议在实验开始前数天即注水，使水温自然升至室温。
    3. 使用白色大鼠时，加入黑色无毒丙烯颜料直至水体不透明；使用深色大鼠时，则应采用浅色（如白色）背景。
    4. 用水池周围的空白墙面（必要时可使用房间隔板）围挡，确保大鼠在水中时无法看到实验操作人员。
    5. 用不同颜色的海报纸剪出4个形状各异的大型空间线索标志，分别贴于北、东、东南和西南四个指定位置的墙上。这些标志应略高于水池边缘。
    6. 在西北象限开启一台音量较低的收音机，以防止测试过程中意外的响亮噪音干扰大鼠。
    7. 将一个圆形平台（直径11.5 cm，表面位于水面下2-3 cm）放置于目标象限的中心位置。
    8. 关闭主照明灯，打开位于水池对面隔板一侧的落地灯，以照亮实验区域。
  2. 计算机配置
    1. 使用专为Morris水迷宫行为实验设计的追踪程序，并在实验开始前完成协议设置。可能使用的程序示例见图4。
    2. 为空间学习实验设定连续4天、每天4次、每次90秒的实验方案。
    3. 在最后一次空间学习试验后24小时以及在第一次探测试验后1周，分别设置两次独立的探测试验，每次持续30秒。
    4. 在第二次探测试验后24小时开始，进行连续2天的线索学习试验，每天4次，每次总时长60秒。
    5. 为每个阶段设定测试顺序，确保每只动物每次试验之间有20分钟的间隔。在此间隔期间可测试其他动物，但每只动物必须维持20分钟的试验间间隔。
    6. 确保平台位置由实验者定义，且所有其他区域均以该指定平台位置为基准进行划分。
    7. 设置程序为手动启动和结束每次试验。
  3. 空间学习实验
    1. 将圆形平台置于西南象限，并与计算机程序中该象限内标记的"平台"区域对齐。
    2. 每只大鼠的入水起始位置应在水池周围随机分配。每个处理组中应涵盖所有起始位置。在本范式中，任何空间学习试验均不得从东北位置开始，以便在探测试验中使用新的起始位置。
    3. 用手握住大鼠尾根部，轻柔地将其放入水池壁旁的指定起始位置，然后迅速离开大鼠视线。
    4. 另一名实验人员应在大鼠入水后立即启动追踪软件，追踪程序中的计时器应从0开始计时。
    5. 若大鼠找到平台，另一名实验人员应立即在计算机上停止试验，并让大鼠在平台上停留至少30秒后再将其取出；若大鼠在试验结束前跳离平台，则试验继续进行。
    6. 若大鼠在规定时间内未找到平台，可用手引导大鼠至平台（通过让大鼠跟随手部移动或握住尾根部引导）。将大鼠在平台上停留30秒。
    7. 通过尾根部将大鼠从水池中取出，置于实验者用毛巾包裹的手臂上，或让其爬到便携式表面上。
    8. 重复步骤3.3.3–3.3.7，每只大鼠共进行4次试验。每只大鼠每次试验之间应有20分钟的间隔。
    9. 完成每只大鼠最后一次空间学习试验后，将其放回饲养笼，并在加热灯下至少停留10分钟 。
    10. 在第2至第4天继续采用完全相同的空间学习实验方案。
    11. 在第2至第4天，不再用手扶持大鼠在平台上停留，而是让大鼠在无辅助情况下自行在平台上停留30秒，实验人员应避开其视线。此操作也可偶尔在第1天的后期试验中实施。
  4. 探测试验
    1. 将平台从水池中移除，但确保计算机中仍保留原平台位置（即西南象限中的圆形区域）。
    2. 将大鼠从东北位置的水池壁旁放入水中，并迅速离开其视线。 使用新的东北起始位置可确保大鼠对平台位置的记忆不受先前训练起始位置的影响。
    3. 另一名实验人员应在大鼠入水后立即启动追踪软件，追踪程序中的计时器应从0开始计时。
    4. 从水池西南象限中通过尾根部将大鼠取出，将其置于毛巾包裹的手臂上，或让其爬到便携式表面上。
    5. 每次探测试验结束后，将大鼠放回饲养笼，并在加热灯下至少停留10分钟 。
    6. 一周后重复该实验（步骤3.4.1–3.4.5）。
  5. 线索学习实验
    1. 使用胶带将一个直径4 cm的白色球形线索固定在平台上高度为8.5 cm的支架上（线索总高度为12.5 cm），使球形线索顶部至少高出水面8.5 cm。
    2. 移除水池周围墙面上的所有空间线索标志。
    3. 对每组中每只大鼠的平台位置和起始位置进行随机化分配。每个处理组应涵盖所有平台和起始位置。
    4. 将平台置于指定的平台区域内，并在追踪软件中进行定义。
    5. 将大鼠从水池壁旁的指定起始位置放入水中，并迅速离开其视线。
    6. 另一名实验人员应在大鼠入水后立即启动追踪软件，追踪程序中的计时器应从0开始计时。
    7. 当大鼠到达平台后，另一名实验人员应在计算机上停止试验。若大鼠跳离平台，则试验继续。在取出大鼠前，应让其在平台上停留15秒。
    8. 通过尾根部将大鼠从水池中取出，将其置于毛巾包裹的手臂上，或让其爬到便携式表面上。
    9. 检查下一只大鼠的平台位置，并将平台移动至追踪软件中定义的相应区域。
    10. 重复步骤3.5.4–3.5.9，完成后续3次试验。每次试验之间应有15分钟的间隔。
    11. 完成每只大鼠最后一次线索学习试验后，将其放回饲养笼，并在加热灯下至少停留10分钟 。
    12. 第2天继续采用相同的实验方案。
  6. 数据分析
    注意：常用指标包括在各区域停留的时间、在各区域移动的距离、平均速度、进入各区域的次数以及首次进入各区域的时间。
    1. 分别分析空间学习和线索学习每天到达平台区域的时间与距离，以及平均速度。对于探测试验，分析首次进入目标区域的潜伏期，可用原始时间或从探测试验1到探测试验2的百分比变化表示。

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结果

所述行为学任务用于验证脑卒中在阿尔茨海默病APP21转基因大鼠模型中的影响。脑卒中与APP21转基因的联合作用预计会导致受累肢体出现更严重的运动功能缺损，并加重记忆功能障碍。

圆柱体实验用于评估前肢粗大运动功能，以患侧前肢的使用情况来表示。此外，平衡木行走实验则专门用于评估后肢运动功能和运动能力。由于脑卒中是在右侧纹状体诱导产生的，因此如果存在运动功能障碍，预期左侧前肢将表现出运动缺陷。在图2以及图3a和3b中呈现的数据在统计学上并未表明共病转基因大鼠存在前肢或后肢运动功能缺陷。尽管这些动物似乎没有明显的前肢或后肢运动功能障碍，但在与运动相关的运动功能方面确实表现出轻微差异。在平衡木行走实验中，共病转基因卒中大鼠的总步数显著增加（p <0.05，图3c），提示该实验足够敏感，能够检测到步态和运动...

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讨论

脑卒中与阿尔茨海默病的共同作用会导致显著的行为病理学改变，这些改变可能影响运动功能和认知功能，具体取决于每种疾病的严重程度。因此，有必要采用多种行为学任务来确定这两种疾病各自的独立影响，同时揭示其在共病状态下可能存在的联合效应和相互作用。本文所展示的数据表明，三种经济高效、时间高效且敏感的行为学任务可用于评估一种新型共病APP21转基因大鼠模型在发生脑卒中后运动功能以及海马依赖的空间学习和参考记忆能力。除本文所展示的数据外，这些行为学任务已在更严重的脑卒中模型10,14,18以及阿尔茨海默病（AD）模型8,16中得到验证，应可广泛适用于这两种疾病的多种动物模型。

尽管如此，任何实验任务都存在一定的局限性。对于运动任务而言，如果大鼠对圆筒和横梁产生习惯化，可能需要进行一些故障排除。在圆筒实验中，可能需要采取激励措施，以确保大鼠用前肢充分接触圆筒壁。为实现这一目标，可在圆筒的穿孔盖子或筒壁上涂抹无毒气味物质，以促使大鼠直立并用前肢接触筒壁。例如，可在圆筒内壁靠近顶部的位置涂抹少量花生酱或香草精，进一步鼓励活动较少的大鼠探索筒壁。此外，也可在圆...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）的资助，作者感谢CIHR提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
圆柱体西方大学Plexiglas 圆柱体
圆柱体直径：23 cm
圆柱体高度：40 cm
平台高度：30 cm
镜子长度：35 cm
镜子宽度：26.5 cm		该装置由西方大学机械服务中心专为本实验室定制。请联络您选定的制造商设计此产品。
手持式摄像机JVCGZ-E200
摄像机三脚架SlikF163
调幅/调频时钟收音机SylvaniaSCR1388
白板沃尔玛宽度：71.12 cm
高度：55.88 cm		此类物品可在任意商店购买（例如沃尔玛、大学书店）
白板笔ExpoExpo 白板笔原装款此类物品可在任意商店购买（例如沃尔玛、大学书店）
木梁Rona胶合板
宽度：2 cm
长度：100 cm
VWR 通用实验室胶带VWR Intl.89097-920
iMovie '11Apple Inc.版本 9.0.9 (1795)本文稿使用的是此版本，但其他任何 iMovie 版本或视频编辑软件亦可使用。
莫里斯水迷宫池及平台Stoelting Co.60136/60035这些并非视频中使用的精确产品，但本质上完全相同。
平台提示物--所用平台提示物由小型金属支架和白色球形泡沫球制成。此类材料可能在任何销售家装材料的商店（例如沃尔玛、Rona 等）购得。
Mainstays 71" 落地灯沃尔玛HW-F0377SLV
ANY-Maze 行为追踪软件Stoelting Co.60000ANY-maze® 提供包含摄像机（可选配计算机及配件）的套装。
紧凑型摄像机LogitechV-U0023
笔记本电脑惠普HP Pavilion dv6 笔记本电脑笔记本电脑具体配置：AMD A6-3420M APU 搭载 Radeon HD 显卡，主频 1.50 GHz，6.00 GB 内存，64 位操作系统。
Americana 无毒丙烯酸涂料DecoArtDAO67-9可通过 DecoArt 官网订购，或在 DecoArt 零售商门店购买。
海报板沃尔玛PA-1961

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