粒子示踪微流变学用于研究材料的粘弹性。本文中，该技术被用来测定细菌生物膜不同基质组分的粘弹性、蠕变柔量以及有效交联作用。该基质由细菌分泌的聚合物物质组成，其组分决定了生物膜的结构和力学特性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细菌细胞能够通过将自身包裹在胞外聚合物基质（EPS）中，形成附着于表面的生物被膜群落，即生物被膜。EPS 作为一种物理性保护支架，容纳细菌细胞，其成分包括蛋白质、胞外多糖和 DNA 等多种物质。EPS 的组成可能发生改变，从而重塑生物被膜的力学特性，以响应环境信号，进一步发育或支持其他类型的生物被膜结构（如流束状结构）。然而，目前关于 EPS 组分如何影响生物被膜力学性质与功能的定量描述仍然较少。流变学是研究物质流动特性的学科，对生物被膜具有特殊意义，因为许多生物被膜在流动环境中生长，并持续受到剪切应力作用。此外，流变学还能提供有关生物被膜在表面扩展行为的测量与洞察。本文采用粒子追踪微流变学方法，研究生物被膜发育过程中不同区域中基质组分的黏弹性及其有效交联作用。该方法使研究人员能够在微米尺度上测量生物被膜的力学特性，可能为生物被膜的调控与工程化设计提供有价值的信息。
引言
大多数细菌细胞能够采用浮游（自由生活）和附着于表面（固着）两种生长模式1。在表面附着生长模式中，细菌细胞会分泌大量胞外聚合物（EPS），并将自身包裹其中，从而形成生物膜。EPS主要由蛋白质、胞外多糖和胞外DNA组成，对生物膜的形成至关重要2。EPS可作为物理支架，使细菌实现空间上的分化，并保护细菌免受有害环境条件和宿主免疫反应的影响。EPS的不同组分在生物膜形成过程中发挥着独特的作用3，而EPS组分表达水平的变化可显著重塑生物膜结构4。此外，EPS组分还可作为信号分子发挥作用5，近期研究表明，某些EPS组分可与微生物细胞相互作用，引导其迁移及生物膜的分化过程6-8。
基于对特定胞外多糖（EPS）组分缺陷型突变株所产生的生物膜进行形态学分析，目前关于EPS的研究已取得显著进展9,10。此外，EPS通常在宏观尺度上进行表征（整体表征）11。然而，形态学分析可能缺乏定量细节，而整体表征所得结果为平均值，会丢失生物膜内部异质性所包含的精细信息。目前，越来越多的研究趋向于在微尺度上对EPS的力学性质进行实时表征。本实验方案展示了粒子追踪微流变学如何用于确定基质组分Pel和Psl胞外多糖对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜黏弹性及有效交联程度的时空影响4<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 生物膜培养
- 细菌菌株的制备
- 生物膜培养前1天，从冷冻保存的细菌菌种中接种2 ml适宜的生长培养基，制备浮游细菌培养物。使用LB培养基（10 g L⁻¹-1 NaCl，10 g L-1 酵母提取物，以及 10 g L-1 胰蛋白胨）用于粘液型 P. aeruginosa 及其 Δpel 和 Δpsl 有缺陷的突变体。在37°C下过夜孵育 37 °C 以及 200 rpm 振荡条件。将过夜培养物稀释至 OD600 使用分光光度计测定吸光度为 0.40。
- 组装之前已描述过的流动池装置 14最好放置在可移动平台或手推车上，以便将流动池带入显微镜室进行成像，而无需拆卸。
- 为每个流式细胞仪准备2 L或5 L瓶装的无菌培养基。使用M9最低培养基（48 mM Na2HPO4，22 mM KH2PO4，19 mM NH4Cl，9 mM NaCl，2 mM MgSO₄4，以及 0.1 mM CaCl2) 加入 0.04% 葡萄糖（wt/vol）和 0.2% 酪蛋白氨基酸（wt/vol）的 P. aeruginosa 流动池生....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
研究了生物膜不同区域的局部黏弹性特性，这些区域包括孔隙（生物膜上方的培养基）、平原区（未分化的平坦细胞层）和微菌落（见图2A中的标注）。同时还测定了生物膜在成熟过程中（第3天至第5天）黏弹性特性的时序变化。孔隙中颗粒的均方位移（MSD）被用作对照，其值与纯培养基中颗粒的MSD相当。相比之下，被困在生物膜中的颗粒在固定位置振动，其MSD值范围从典型的黏弹性材料到强弹性凝胶不等（图3）。
黏液型P. aeruginosa野生株及其Δpel突变株（图2A和2B）在形成生物膜的第3天时，于一层薄平面上分散形成微菌落。第3天的平面过薄，无法用于流变学性质的研究。在黏液型P. aeruginosa野生株和Δpel株形成的生物膜中，第3天微菌落内颗粒的均方位移（MSD）在时间滞后0.1秒至10秒范围内与时间无关（α = 0），表明这些微菌落具有弹性（图4
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
微流变学是用于异质系统（如微生物生物膜）局部流变学测量的一种有效工具。该技术具有非破坏性，能够对同一生物样本在多个时间点进行实时监测，观察其流变性质的变化。在本实验方案中，采用粒子追踪微流变学方法研究了Pel和Psl胞外多糖突变体如何影响生物膜基质的弹性及有效交联程度。结果显示，Psl促进形成弹性较强且有效交联程度较高的生物膜，而Pel则倾向于形成黏弹性更强、结构更松散的生物膜。当两种胞外多糖同时存在时，随着生物膜的成熟，微菌落的有效交联程度逐渐降低，这与Psl相对于Pel的减少趋势一致。
不同细菌物种形成的生物膜具有不同的胞外多糖（EPS）组成。本研究所用的黏液型P. aeruginosa菌株，其EPS主要由胞外多糖组成16。其他物种可能以大分子细胞外黏附蛋白17和DNA18作为EPS的主要成分。本文所述方法可用于确定其他EPS组分的流变学贡献及其对生长的影响。此外，在不同条件下培养的生物膜可能具有显著不同的物理特性，从而影响其流变性质。例如，添加葡萄糖培养的黏液型P. aeruginos.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究由新加坡国家研究基金会和教育部卓越研究中心计划、南洋理工大学启动资助（M4330002.C70）以及新加坡教育部AcRF第二级资助（MOE2014-T2-2-172）支持。作者感谢Joey Yam Kuok Hoong参与本实验方案的演示。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm 红色荧光（580/605）羧基修饰微球 |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | 落射荧光显微镜 | |
| Masterflex L/S 数字驱动泵 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | 蠕动泵 |
| 流动池腔室 | 丹麦技术大学 | ||
| 气泡捕获器 | 丹麦技术大学 | ||
| 硅胶管 | Dow Corning | 外径 3 mm，内径 1 mm | |
| 透明聚丙烯塑料接头 | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 英寸（1.588 mm） |
| 文件夹夹具 | 用于夹紧管路 | ||
| 盖玻片 | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| 3 ml 注射器 | Terumo | ||
| 27 G 针头 | Terumo | ||
| 2 L 储存/培养基瓶 | VWR® | ||
| 推车 | 用于放置生物膜实验装置 |
参考文献
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
