粒子示踪微流变学用于研究材料的粘弹性。本文中，该技术被用来测定细菌生物膜不同基质组分的粘弹性、蠕变柔量以及有效交联作用。该基质由细菌分泌的聚合物物质组成，其组分决定了生物膜的结构和力学特性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细菌细胞能够通过将自身包裹在胞外聚合物基质（EPS）中，形成附着于表面的生物被膜群落，即生物被膜。EPS 作为一种物理性保护支架，容纳细菌细胞，其成分包括蛋白质、胞外多糖和 DNA 等多种物质。EPS 的组成可能发生改变，从而重塑生物被膜的力学特性，以响应环境信号，进一步发育或支持其他类型的生物被膜结构（如流束状结构）。然而，目前关于 EPS 组分如何影响生物被膜力学性质与功能的定量描述仍然较少。流变学是研究物质流动特性的学科，对生物被膜具有特殊意义，因为许多生物被膜在流动环境中生长，并持续受到剪切应力作用。此外，流变学还能提供有关生物被膜在表面扩展行为的测量与洞察。本文采用粒子追踪微流变学方法，研究生物被膜发育过程中不同区域中基质组分的黏弹性及其有效交联作用。该方法使研究人员能够在微米尺度上测量生物被膜的力学特性，可能为生物被膜的调控与工程化设计提供有价值的信息。
引言
大多数细菌细胞能够采用浮游（自由生活）和附着于表面（固着）两种生长模式1。在表面附着生长模式中，细菌细胞会分泌大量胞外聚合物（EPS），并将自身包裹其中，从而形成生物膜。EPS主要由蛋白质、胞外多糖和胞外DNA组成，对生物膜的形成至关重要2。EPS可作为物理支架，使细菌实现空间上的分化，并保护细菌免受有害环境条件和宿主免疫反应的影响。EPS的不同组分在生物膜形成过程中发挥着独特的作用3，而EPS组分表达水平的变化可显著重塑生物膜结构4。此外，EPS组分还可作为信号分子发挥作用5，近期研究表明，某些EPS组分可与微生物细胞相互作用，引导其迁移及生物膜的分化过程6-8。
基于对特定胞外多糖（EPS）组分缺陷型突变株所产生的生物膜进行形态学分析，目前关于EPS的研究已取得显著进展9,10。此外，EPS通常在宏观尺度上进行表征（整体表征）11。然而，形态学分析可能缺乏定量细节，而整体表征所得结果为平均值，会丢失生物膜内部异质性所包含的精细信息。目前，越来越多的研究趋向于在微尺度上对EPS的力学性质进行实时表征。本实验方案展示了粒子追踪微流变学如何用于确定基质组分Pel和Psl胞外多糖对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜黏弹性及有效交联程度的时空影响4。
被动微流变学是一种简单且低成本的流变学方法，迄今为止可实现对材料进行空间微流变采样的最高通量12,13。在被动微流变学中，将探针微球置于样品中，通过视频显微镜追踪其由热能（kBT）驱动的布朗运动。可同时追踪多个粒子，这些粒子随时间变化的坐标遵循传统的随机行走模式。因此，平均而言，粒子保持在相同位置。然而，粒子位移的标准差或均方位移（MSD）并不为零。由于黏性流体会发生流动，黏性流体中粒子的MSD随时间呈线性增长。相比之下，黏弹性或弹性物质中存在的聚合物交联结构有助于抵抗流动，使粒子的位移受到限制，从而导致MSD曲线出现平台期（图1A）。这一现象符合关系式 MSD∝tα，其中α为扩散指数，与物质的弹性与黏性贡献之比相关。在纯黏性流体中运动的粒子，其α = 1；在黏弹性物质中，0 < α < 1；而在弹性物质中，α = 0。MSD还可用于计算蠕变柔量，该参数反映材料随时间发生永久形变的趋势，并可评估材料扩散的难易程度。
微粒的尺寸、密度和表面化学性质对于微流变学实验的正确应用至关重要，需根据所研究的体系（本例中为生物膜基质中的聚合物，见图1B）进行选择。首先，微粒所测量的是其自身尺寸远大于被测物质内部结构时的流变特性。若被测物质的结构尺度与微粒相近，则微粒的运动将受到这些个体结构形状和取向的干扰。然而，若微粒周围结构的尺度远小于微粒本身，则此类影响较小且会被平均化，从而使微粒处于一个均质的环境中（图1B）。其次，微粒的密度应与介质相近（对于水基介质约为1.05 g ml-1），以避免沉降并使惯性力可忽略不计。大多数聚苯乙烯微粒均能满足上述标准。理想情况下，微粒不应与生物膜基质中的聚合物发生相互作用，因为只有当微粒的运动是随机的、由热能驱动并受到介质结构碰撞影响时，对其均方位移（MSD）的流变学解释才成立。可通过观察探针微粒是否倾向于结合或弹离已形成的生物膜表面来判断其是否满足该条件。然而，尽管微粒应不与生物膜产生吸引力，但仍需能够被整合进基质中。此外，生物膜的理化异质性可能导致不同类型的微粒在生物膜的不同区域中更适合作为探针。因此，应将具有不同尺寸和表面化学性质的微粒应用于生物膜研究。
因此，粒子均方位移（MSD）能够提供有用信息，揭示不同组分如何影响生物膜的流变学特性和扩散行为。此外，使用不同的探针可获取生物膜空间物理化学异质性的相关信息。该方法可用于检测抗菌处理对生物膜力学性质的影响，或应用于多物种生物膜，以研究引入新物种后生物膜力学性质的变化。粒子均方位移还可用于表征生物膜的分散过程。此类研究有助于加深我们对生物膜的理解，可能促进生物膜治疗策略的改进，并推动功能性生物膜的工程化设计。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 生物膜培养
- 细菌菌株的制备
- 生物膜培养前1天，从冷冻保存的细菌菌种中接种2 ml适宜的生长培养基，制备浮游细菌培养物。使用LB培养基（10 g L⁻¹-1 NaCl，10 g L-1 酵母提取物，以及 10 g L-1 胰蛋白胨）用于粘液型 P. aeruginosa 及其 Δpel 和 Δpsl 有缺陷的突变体。在37°C下过夜孵育 37 °C 以及 200 rpm 振荡条件。将过夜培养物稀释至 OD600 使用分光光度计测定吸光度为 0.40。
- 组装之前已描述过的流动池装置 14最好放置在可移动平台或手推车上，以便将流动池带入显微镜室进行成像，而无需拆卸。
- 为每个流式细胞仪准备2 L或5 L瓶装的无菌培养基。使用M9最低培养基（48 mM Na2HPO4，22 mM KH2PO4，19 mM NH4Cl，9 mM NaCl，2 mM MgSO₄4，以及 0.1 mM CaCl2) 加入 0.04% 葡萄糖（wt/vol）和 0.2% 酪蛋白氨基酸（wt/vol）的 P. aeruginosa 流动池生物膜
- 将荧光微球分装至微量离心管中，加入无菌H2在 9,391.2 g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，加入 1 ml 培养基重悬，以去除叠氮化钠（消毒剂），然后接种至 2 L 或 5 L 培养瓶中的培养基中。
注意：不同尺寸的微球浓度不同，应根据说明书相应稀释。例如，分散 120 µl 的 1.0 µm 直径微球， 15 µl 的 0.5 µm 直径微球和 0.96 µl 的 0.2 µm 将直径微球加入2 L培养基中，使浓度达到2.18 × 106 微球 ml-1 针对每种粒径。 - 将培养基瓶连接至流式细胞室的上游，使培养基流经整个装置。停止流动，将稀释的过夜培养物注入流式细胞室腔室中。让细菌在盖玻片基质上附着1小时，随后以约5.5 x 10的流速继续通入培养基-3 毫秒-1，或使用蠕动泵以8 rpm的转速。
注意：通常在室温下培养生物膜（25 °C3-7 天。 - 或者，对于静态培养体系，通过在微量离心管中加入液体将过夜培养物稀释100倍 10 µl 将过夜培养物加入至含颗粒的1 ml生长培养基中。与用于流动生物膜的颗粒浓度相比，静态培养中生长培养基的颗粒浓度需提高约500倍。例如 洗涤并重悬 600 µl 的 1.0 µm 在10 ml培养基中加入直径为微米级的微球），因为流动池中的生物膜会持续补充颗粒，而静态培养则不会。
- 添加 200 µl 将稀释的过夜培养物与颗粒加入8孔载玻片的小室中。于 37 °C 在静态条件下培养。通常生物膜的培养时间为1天。若生物膜培养超过1天，需每日更换新鲜培养基，并加入颗粒物。
2. 显微镜检查
- 第3天和第5天，关闭蠕动泵的流体流动，将流动池装置移入显微镜室。在流动池腔室的入口和出口附近夹紧管路，以防止因环境变化引起的漂移（一种系统性误差）。将流动池放置在正置显微镜的载物台上。
注意：使用倒置显微镜对微孔进行成像。 - 使用40倍油镜荧光显微镜，在不同位置（微菌落和平坦未分化层）及不同时间点（第3天和第5天）拍摄生物膜中嵌入微球的运动视频，以进行时空分析。采用较高帧率拍摄较短时长的视频，以研究短时间内发生的事件例如 1.5-3 分钟的视频，帧率为每秒 25-50 帧，用于研究快速动态过程；以及帧率较低的较长时间视频，用于观察较长时间尺度上的事件例如 15-30 分钟的视频，帧率为 2.5-5 帧/秒，适用于较慢的动力学过程。
注意：一段视频通常包含 5-10 个颗粒，文件大小通常为 1.0-2.5 GB。较大的微菌落可能包含更多颗粒。每种类别采集 5-10 段视频例如 不同微菌落及扁平未分化层中不同位置的 5-10 个视频。生物膜具有异质性结构，可能包含微菌落、通道、空腔和扁平未分化层。 - 以 Fiji/ImageJ 可读的适当格式保存视频例如 czi, tif
- 通过滚动查看已完成的视频，观察颗粒是否未同时朝同一方向移动，以检查视频是否存在漂移。漂移可能由Z轴位移、流动池内液体流动、防震台失衡、气压或温度变化引起。可使用显微镜软件通常提供的后期处理技术校正轻微漂移。若漂移无法校正，则弃用相关视频。记录粒子追踪分析所需的以下参数：分辨率（px/μm）、帧数、持续时间。
- 从显微镜载物台上取下流动池，并重新启动蠕动泵以继续培养生物膜。
3. 颗粒追踪分析
- 使用开源软件（ImageJ）中的插件 TrackMate 获取粒子轨迹。在 http://fiji.sc/Fiji 下载 Fiji。用 Fiji 打开视频，在 Plugins 菜单下选择 Tracking 和 TrackMate。
- 检查或调整窗口中建议的初始校准设置，使其与步骤 2.4 中记录的视频参数相匹配。
- 在 ImageJ 中使用 TrackMate 检测粒子。
- 选择“LoG 检测器”，输入粒子直径和阈值（例如 1,000）。在点击“Preview”按钮的同时滚动浏览视频，检查紫色圆圈是否在整个视频中跟随粒子。根据需要调整直径和阈值：如果在空白区域出现紫色圆圈，则增加阈值；如果检测到的粒子不足，则降低阈值。点击下一步按钮以完成粒子检测。
- 当出现“Initial thresholding”、“Select a view”和“Select a filter”窗口时，若初始粒子检测结果满意，可直接点击下一步按钮，无需添加或删除已检测的粒子。
- 在“Select a tracker method”窗口的选项栏中选择“Simple LAP tracker”，因为在生物膜中粒子很少失焦，易于追踪。使用建议的或较低的链接距离和最大间隙闭合距离值，然后点击下一步。
- 通过滚动视频检查粒子追踪是否满意，确保粒子沿 TrackMate 绘制的轨迹移动，且无多余或缺失的轨迹。跳过各种过滤步骤。进入最后一个窗口“Select an action”，从下拉菜单中选择“Export tracks to xml file”，然后点击“Execute”。选择一个文件夹保存轨迹。
注意：公共领域有多种可用于分析粒子轨迹和微流变学的程序。msdanalyzer 和 TrackArt 是可在 Matlab 环境中运行的粒子追踪分析程序示例。
- 在 Matlab 菜单中选择 File>Set Path...，并将 Fiji 软件包附带的 scripts 文件夹添加到路径中，以准备导入 xml 文件中的粒子轨迹。
- 要使用 msdanalyzer 分析粒子轨迹，请在 http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories 下载 zip 或 tar.gz 文件。
- 解压 @msdanalyzer 文件夹15，并将其放入属于 Matlab 路径的文件夹中（例如 C:\Documents and Settings\\My Documents\Matlab）。启动 Matlab，并通过输入以下命令初始化分析器：
ma = msdanalyzer(2, 'um', 'sec')
其中 um 和 sec 分别为视频中的物理空间和时间单位。- 通过输入以下命令导入粒子轨迹：
[tracks, md] = importTrackMateTracks('FileName.xml', 'clipZ', 'scaleT')
ma = ma.addAll(tracks);
其中 'clipZ' 用于移除二维视频的 z 维度，'scaleT' 用于时间尺度校正。 - 使用以下命令将轨迹绘制成图：
ma.plotTracks;
ma.labelPlotTracks; - 使用以下命令计算粒子的均方位移（MSD）：
ma = ma.computeMSD;
ma.msd - 绘制每个粒子的 MSD 曲线：
figure
ma.plotMSD - 通过重复步骤 3.5.1.1 至 3.5.1.4，合并来自相同类别其他视频的粒子轨迹（例如 第 3 天嵌入野生型微菌落中的粒子）。
- 绘制所有曲线的集合平均值或平均曲线：
ma.plotMeanMSD
将 y 轴和 x 轴从线性刻度更改为对数刻度。在较长滞后时间下，由于长时间尺度的统计信息不足，MSD 曲线会变得嘈杂。由于动态误差，MSD 曲线也可能急剧上升。可使用刷子工具选择曲线末端，然后在“Tools”菜单中选择“Brushing” > “Remove Unbrushed”来删除这些区域。
- 通过输入以下命令导入粒子轨迹：
- 在 http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ 下载 Ezyfit，并将其添加到属于 Matlab 路径的文件夹中（例如 C:\Documents and Settings\\My Documents\Matlab）。在 Matlab 工作区输入 efmenu install 安装 Ezyfit 菜单。重新启动 MATLAB，图形窗口中将显示 Ezyfit 菜单。在 Ezyfit 菜单中选择“Show Fit” > “Power” > “a*x^n”以将 MSD 曲线拟合为幂律函数，其中 n 为估计的扩散指数 α。
注意：msdanalyzer 需要 Matlab 中的曲线拟合工具箱（Curve Fitting Toolbox）来拟合 MSD 曲线。Ezyfit 是一种可替代的免费软件，也可执行曲线拟合。 - 清除当前的粒子轨迹和 MSD 数据，以在其他位置或时间重新计算新的粒子 MSD：
clear - 在计算了培养基（对照组）、不同菌株的微菌落及未分化区域中粒子的各种平均 MSD 曲线后，将这些曲线复制并粘贴到同一张图中进行比较。样品刚度和交联程度随 MSD 值降低而增加。平坦的曲线具有较低的 α 值，表明样品比具有较高 α 值的陡峭曲线更具弹性。
- 选择曲线并进入“Tools”查看数据统计信息，如中位数和范围。微珠的 MSD 与其嵌入材料的蠕变柔量 J(t) 成正比，关系如下：
其中 J = 蠕变柔量，d = 粒子直径，kB = 玻尔兹曼常数，T = 温度，t = 时间。
- 解压 @msdanalyzer 文件夹15，并将其放入属于 Matlab 路径的文件夹中（例如 C:\Documents and Settings\\My Documents\Matlab）。启动 Matlab，并通过输入以下命令初始化分析器：
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
研究了生物膜不同区域的局部黏弹性特性，这些区域包括孔隙（生物膜上方的培养基）、平原区（未分化的平坦细胞层）和微菌落（见图2A中的标注）。同时还测定了生物膜在成熟过程中（第3天至第5天）黏弹性特性的时序变化。孔隙中颗粒的均方位移（MSD）被用作对照，其值与纯培养基中颗粒的MSD相当。相比之下，被困在生物膜中的颗粒在固定位置振动，其MSD值范围从典型的黏弹性材料到强弹性凝胶不等（图3）。
黏液型P. aeruginosa野生株及其Δpel突变株（图2A和2B）在形成生物膜的第3天时，于一层薄平面上分散形成微菌落。第3天的平面过薄，无法用于流变学性质的研究。在黏液型P. aeruginosa野生株和Δpel株形成的生物膜中，第3天微菌落内颗粒的均方位移（MSD）在时间滞后0.1秒至10秒范围内与时间无关（α = 0），表明这些微菌落具有弹性（图4
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
微流变学是用于异质系统（如微生物生物膜）局部流变学测量的一种有效工具。该技术具有非破坏性，能够对同一生物样本在多个时间点进行实时监测，观察其流变性质的变化。在本实验方案中，采用粒子追踪微流变学方法研究了Pel和Psl胞外多糖突变体如何影响生物膜基质的弹性及有效交联程度。结果显示，Psl促进形成弹性较强且有效交联程度较高的生物膜，而Pel则倾向于形成黏弹性更强、结构更松散的生物膜。当两种胞外多糖同时存在时，随着生物膜的成熟，微菌落的有效交联程度逐渐降低，这与Psl相对于Pel的减少趋势一致。
不同细菌物种形成的生物膜具有不同的胞外多糖（EPS）组成。本研究所用的黏液型P. aeruginosa菌株，其EPS主要由胞外多糖组成16。其他物种可能以大分子细胞外黏附蛋白17和DNA18作为EPS的主要成分。本文所述方法可用于确定其他EPS组分的流变学贡献及其对生长的影响。此外，在不同条件下培养的生物膜可能具有显著不同的物理特性，从而影响其流变性质。例如，添加葡萄糖培养的黏液型P. aeruginos...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究由新加坡国家研究基金会和教育部卓越研究中心计划、南洋理工大学启动资助（M4330002.C70）以及新加坡教育部AcRF第二级资助（MOE2014-T2-2-172）支持。作者感谢Joey Yam Kuok Hoong参与本实验方案的演示。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μm 红色荧光（580/605）羧基修饰微球 |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | 落射荧光显微镜 | |
| Masterflex L/S 数字驱动泵 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | 蠕动泵 |
| 流动池腔室 | 丹麦技术大学 | ||
| 气泡捕获器 | 丹麦技术大学 | ||
| 硅胶管 | Dow Corning | 外径 3 mm，内径 1 mm | |
| 透明聚丙烯塑料接头 | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 英寸（1.588 mm） |
| 文件夹夹具 | 用于夹紧管路 | ||
| 盖玻片 | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| 3 ml 注射器 | Terumo | ||
| 27 G 针头 | Terumo | ||
| 2 L 储存/培养基瓶 | VWR® | ||
| 推车 | 用于放置生物膜实验装置 |
参考文献
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al. Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).
- Chew, S. C., et al. Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides. mBio. 5 (4), (2014).
- Irie, Y., et al. Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).
- Zhao, K., et al. Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 497, 388-391 (2013).
- Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).
- Yang, L., et al. Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).
- Bokranz, W., Wang, X., Tschäpe, H., Römling, U. Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract. J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).
- Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).
- Waigh, T. A. Microrheology of complex fluids. Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).
- Wirtz, D. Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells. J Vis Exp. , e2383(2011).
- Tarantino, N., et al. TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures. Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).
- Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms. Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).
- Qin, Z., et al. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Stoodley, P., et al. The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms. Water Science & Technology. 43, 113-120 (2001).
- Jäger-Zürn, I., Grubert, M. Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls. International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).
- Matysik, A., Kraut, R. TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers. BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
