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方法文章

用于细胞内靶向应用的固体脂质纳米颗粒（SLNs）

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DOI：

10.3791/53102

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2015年11月17日

 ,  ,  , 
1Research and Exploratory Development Department, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins School of Medicine, 3Asymmetric Operations Sector, The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory

本文内容

摘要

本研究描述了一种合成超小生物相容性纳米颗粒群体的方法，以及若干 体外 用于评估其细胞相互作用的方法。

摘要

基于纳米颗粒的递送载体在细胞内靶向应用中展现出巨大潜力，可提供一种特异性调控细胞信号传导和基因表达的机制。在之前的一项研究中，已证明了超小型固体脂质纳米颗粒（SLN）在局部药物递送和生物标志物检测中的合成方法。固体脂质纳米颗粒（SLN）是已被广泛研究的一类纳米递送系统，已成为一种有前景的药物递送载体。在本研究中，SLN被负载荧光染料，并作为模型用于研究颗粒与细胞之间的相互作用。采用相变温度（PIT）法合成生物相容性超小型纳米颗粒。在开展纳米颗粒-细胞相互作用研究之前，使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑（MTT）实验确定合适的给药剂量。此外，将人原代皮肤成纤维细胞和小鼠树突状细胞在不同时间点暴露于负载染料的SLN中，并利用荧光显微镜和流式细胞术对毒性及颗粒摄取等相互作用特性进行表征。本研究证明，作为一类纳米递送系统，超小型SLN适用于不同类型细胞的细胞内靶向。

引言

基于纳米颗粒的递送载体在细胞内靶向应用中展现出巨大前景，可提供一种特异性调控细胞信号转导和基因表达的机制。这些载体可负载旨在影响细胞反应并在靶组织中实现预期效果的药物、蛋白质和核酸。已有多种类型的纳米载体被探索用于治疗和诊断目的，包括脂质、聚合物、硅和磁性材料。由于这些系统具有实现局部给药、提高靶组织中药物浓度以及降低全身毒性的潜力，因而具有显著吸引力。

固体脂质纳米颗粒（SLNs）是一种被广泛研究的纳米颗粒递送系统的典型示例，近年来已成为一种具有前景的药物递送载体。SLNs 可方便地用于多种应用，包括生物传感1、化妆品2以及治疗性药物递送3-7。其优势在于完全由可吸收、无毒的脂质组成，因而具有更高的生物相容性。在合成过程中，可将亲脂性药物包载入 SLN 载体中，从而提高药物的溶解度及其适用于肠外给药的特性。SLN 载体还有助于稳定所包封的治疗剂，减少其降解和清除，最大化治疗效果。由于在体温下具有良好的稳定性，这类载体特别适用于长效、控释制剂3,4,8,9。重要的是，将药物包封于脂质纳米颗粒中可改变药物分子固有的药代动力学特征，这一特性为实现治疗指数较窄的药物的可控释放提供了潜在优势。SLN 所载治疗剂的释放速率可根据脂质的降解速率或药物在脂质基质中的扩散速率进行调节。

SLNs 通常被设计为在特定靶组织中蓄积。例如，其尺寸（通常大于 10 nm）有助于在循环系统中滞留，而肿瘤组织的血管通透性有利于颗粒沉积。此外，给药途径已被证明可改变颗粒的生物分布，从而有可能靶向特定的生理结构，如淋巴结10,11。当颗粒沉积于靶组织后，由于细胞膜能够选择性调控离子和分子进出细胞，实现适当的细胞相互作用及纳米颗粒的最终内化仍具挑战性12。为促进细胞摄取，可对纳米载体进行修饰，连接特定配体，包括多肽、小分子和单克隆抗体13,14。已有研究描述了多种纳米颗粒穿越细胞膜的机制，包括被动穿透和主动转运3,12,15。总体而言，研究表明，细胞与纳米颗粒的相互作用受到纳米颗粒理化性质的影响，包括尺寸、形状、表面电荷和表面化学性质，同时也受细胞特异性参数的影响，如细胞类型或细胞周期阶段12。

先前的一项研究表明，可合成用于局部给药的亚10 nm固体脂质纳米粒（SLNs） 16 和生物标志物检测应用 1 采用相转变温度（PIT）法 17这是一种温和的合成方法，其中 2 在逐渐改变温度的过程中，体系组成保持恒定。加热溶液在持续搅拌下冷却至室温，可形成纳米乳液。该过程可制备出粒径更小的固体脂质纳米粒（SLNs）。1 低于先前使用各种脂质纳米颗粒合成方法所报道的结果17-22小于20 nm的最终粒径尺度在细胞内靶向应用中具有优势，因其具有更大的比表面积以及增强细胞相互作用的潜力。

一种用于递送荧光染料或治疗药物的SLNs示意图如图所示 图1. SLN由脂质内核组成（例如，直链烷烃）可允许掺入疏水性化合物（例如，染料或治疗剂）和表面活性剂外层（例如，由水包围的线性非离子表面活性剂。在本研究中，将固体脂质纳米粒（SLNs）负载荧光染料，并用作模型以研究颗粒-细胞相互作用。将原代人皮肤成纤维细胞和小鼠树突状细胞随时间暴露于负载染料的SLN中，以表征其在毒性和颗粒摄取方面的相互作用。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基氯化四氮唑（MTT）实验确定合适的给药剂量。采用荧光显微镜和流式细胞术两种方法检测颗粒摄取情况 体外.

脂质纳米颗粒示意图；脂质、表面活性剂、尼罗红染料水溶液、胶束形成。
图1. 显示固体脂质纳米颗粒（SLN）主要成分的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

1. SLNs 的制备

  1. SLNs的合成
    注意：使用 PIT 方法 1,17,20 制备亚20 nm的固体脂质纳米粒（SLNs） 1.
    1. 使用无菌技术、生物试剂或细胞培养级试剂以及无菌材料（即移液管、刮刀、小瓶 等等。).
    2. 使用生物安全柜进行SLN的合成（图2).
    3. 将0.6 mg荧光染料（Nile Red，NiR，NiR浓度约为0.3 mg/ml）与0.10 g二十一烷（Heneicosane，脂质，脂质浓度为5 wt/wt%）加入一个15 ml小瓶中，共熔于 90 °C，搅拌。
    4. 加入0.11 g聚氧乙烯（10）油醚（表面活性剂，表面活性剂浓度为5.5 wt/wt%）。将所得混合物共熔于 90 °C 并搅拌。
    5. 加入1.79 g无菌水至混合物中，加热至 90 °C，搅拌至形成透明的纳米乳液。
      注意：在持续搅拌和控制冷却的条件下，可形成固体脂质纳米粒（SLNs）。这些条件促使水包油乳剂发生相转变，形成油包水乳剂。亲脂性分子（如NiR）会分配至脂质液滴中。
    6. 并行制备一种不含荧光染料的纳米乳液，作为对照样品。将0.10 g二十一烷和0.11 g聚氧乙烯（10）油醚加入到一个15 ml小瓶中，共同熔融 90 °C，搅拌。
      1. 加入1.79 g无菌水至混合物中，加热至 90 °C，搅拌至形成透明的纳米乳液。
    7. 使用无菌滤器对每种纳米乳剂进行进一步灭菌 0.2 µm 过滤器
    Nanoemulsion diagram with heating, stirring setup for formulation process and phase inversion.
    图2. SLNs 合成示意图。 请点击此处以查看此图的放大版本。
  2. 粒径与多分散性
    1. 采用动态光散射（DLS）法测定固体脂质纳米粒（SLNs）的粒径及多分散系数 1 使用玻璃比色皿和专用于测量粒径的仪器。
    2. 在测量样品之前，按照生产商提供的标准品制备和测量方案，测定两种已知标准品的粒径。
    3. 将1.5 ml标准溶液加入玻璃比色皿中，并在与样品相同的测量条件下测定标准溶液。
      注意：对每个标准品均重复上一步骤。
    4. 测量已制备的样品。每份样品使用以下实验参数：运行时间100秒，水的折射率（1.33），水的黏度 20 °C (1.002 mPa·sec)
      注：该技术利用频率偏移的光来测量纳米颗粒的尺寸。
    5. 报告颗粒的平均直径及粒径分布的多分散性。
  3. 熔点与熔化潜热
    1. 使用配备自动进样器和液氮冷却源的差示扫描量热仪（DSC）研究固体脂质纳米粒（SLNs）的热行为 1.
    2. 将已制备好的SLNs用移液器转移至 40 µl 使用质量约为25 mg的铝盘，并用通用压接机密封铝盘，以尽量减少DSC扫描过程中的水分流失。
    3. 从5到，测量每种纳米乳剂 80 °C.
    4. 从DSC曲线中报告熔点和熔融潜热，其中谷值代表熔点，DSC曲线下方曲线区域的积分除以材料质量即为熔融潜热。

2. SLNs 与成纤维细胞和树突状细胞的相互作用

  1. 原代人成纤维细胞的培养
    1. 按照说明书，将原代人成纤维细胞在人真皮成纤维细胞培养液（medium 106）中进行培养，并添加低血清生长补充剂（LSGS）试剂盒。将细胞维持在37 °C、5% CO2的湿润环境中，当细胞融合度达到80%时进行传代。
    2. 对于MTT检测和成像分析，将细胞以每孔2 × 104个细胞的密度接种于96孔板中，并在暴露于SLN前于37 °C过夜平衡。
    3. 在时间零点，根据脂质浓度将SLN按指定比例（图4）用完全培养基稀释，并向96孔板中每孔加入10 μl，每个样本设复孔。
    4. 在孵育期间，将细胞维持在37 °C、5% CO2条件下。
  2. MTT毒性检测
    1. 与SLN共孵育24小时后，按照试剂盒说明书使用MTT法测定细胞活力。
    2. 将细胞洗涤一次后，向每孔加入新鲜培养基（100 μl/孔）。通过在70%甲醇溶液中孵育10分钟处理杀细胞对照孔，随后更换为新鲜培养基。
    3. 向微孔板每孔加入MTT试剂（每孔10 μl），并在37 °C过夜孵育。
    4. 过夜孵育后，按照制造商说明书使用提供的去垢剂溶液（每孔100 μl）溶解细胞内甲臜结晶。
    5. 室温孵育3小时后，使用酶标仪在570 nm波长下测定吸光度值。
      注意：所用MTT试剂中3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐的浓度应低于1%（w/v）。
  3. 荧光显微镜观察
    1. 成纤维细胞给予SLN后，在特定时间点用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，随后用冷的70%甲醇固定10分钟。
    2. 10分钟后，将甲醇替换为PBS，并使用倒置显微镜配合带通（BP）690/50 nm滤光片组采集图像。
  4. 小鼠骨髓来源树突状细胞的培养
    1. 按照先前描述的方法23,24诱导小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）。简言之，将C57BL/10小鼠骨髓单细胞悬液以每皿2 × 106个细胞的密度接种于100 mm培养皿中，加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF，300 U/ml）和重组小鼠IL-4（B细胞刺激因子，200 U/ml）。每3天更换一次培养基。
    2. 第7天，向培养皿中加入负载NiR的SLN，终浓度分别为0.5和5.0 µg/ml脂质，并将细胞在37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育所需时间。
    3. 通过吸出培养皿中的全部培养基并收集至50 ml离心管中来收集细胞，随后用含4 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS）5 ml彻底冲洗培养皿（以去除松散贴壁的细胞），并将冲洗液一并收集至同一50 ml离心管中。
  5. 通过流式细胞术评估SLN的摄取
    1. 测定步骤2.4.3中获得的细胞悬液浓度，并将3 × 105个细胞分装至12 mm × 75 mm的圆底FACS管中。
    2. 每管加入1 ml PBS洗涤细胞，然后在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
    3. 弃去上清液，将沉淀用含抗CD11c-FITC单克隆抗体（终浓度0.25 μg/ml）的100 µl PBS/2 mM EDTA/0.1%牛血清白蛋白（BSA）（染色缓冲液）重悬，在冰上避光孵育30分钟。
    4. 用1 ml PBS洗涤细胞，然后在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
    5. 弃去上清液，每管沉淀用400 µl染色缓冲液重悬。此时细胞即可用于流式细胞仪检测（仪器最好配备蓝色和红色激光器）。
    6. 使用流式细胞分析软件，通过圈选CD11c+细胞群（FITC阳性）并比较SLN相关荧光强度（在PerCP-Cy5.5或APC通道中检测）来评估树突状细胞对SLN的摄取水平。

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结果

采用 PIT 法合成 SLN，并利用水浴测定相转变温度。将样品缓慢加热并轻轻搅拌，直至溶液变得澄清。使用二十一烷脂质制备的 SLN，其相转变温度为 45 °C。表 1 总结了 SLN 的粒径、多分散性、熔点及熔融潜热。根据上述工艺条件制备的空白 SLN 和负载 NiR 的 SLN，其平均粒径分别为 18.59 和 16.87 nm，多分散性分别为 5.83 和 4.47（图 3）。通过在两种不同储存温度（4 和 23 °C）下连续 6 天监测粒径变化，评估 SLN 分散液的稳定性。结果显示，6 天内粒径未发生改变（数据未显示）。

采用差示扫描量热法研究了固体脂质纳米粒（SLNs）的热行为。合成的SLNs中，空白SLNs的熔点为38.0（± 0.4）°C，NiR载药SLNs的熔点为36.8（± 0.2）°C。相比之下，体相脂质的熔点为40.0 °C，表明SLNs相对于体相脂质其熔点有所降低。正如预期，由于受限于纳米尺度以及具有较高的比表面积，纳米粒子的熔点被抑制1。此外，空白SLNs和NiR载药...

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讨论

本研究探讨了固体脂质纳米粒（SLNs）的合成及其在细胞内靶向应用中的适用性。这些生物相容性纳米颗粒作为递送载体，在药物递送、基因沉默和疫苗技术等多种应用中展现出良好前景25-30。采用一种简便的方法合成了超小SLNs，并研究了其与原代皮肤细胞及原代免疫细胞的相互作用。SLNs的设计包含荧光染料（NiR）的包封，用作模型治疗性货物。

采用相转化法（PIT法）制备固体脂质纳米粒（SLN），并通过动态光散射和差示扫描量热法评估所得纳米粒的粒径、多分散系数、熔点及熔融潜热等理化性质。粒径与多分散系数分析结果显示，所制备的SLN粒径极小且多分散性窄，适用于细胞内靶向应用。如先前报道所述，粒径可显著影响纳米粒与细胞的相互作用 12纳米颗粒的尺寸已被证明具有显著影响，可影响摄取效率、内化途径的选择、细胞内定位以及细胞毒性 12文献中记录的细胞-纳米颗粒相互作用的一些总体趋势包括：临界尺寸可能随细胞类型和纳米颗粒表面性质而变化，且小尺寸纳米颗粒通过被动摄取被内化的概率高于大尺寸纳米颗粒 12本研究中对颗粒的热分...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作得到了约翰斯·霍普金斯大学应用物理实验室研究与探索开发部、技术转让办公室以及Stuart S. Janney奖学金项目的资助，同时获得了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助项目（资助编号：R21HL127355）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
尼罗红（NiR）Sigma19123生物试剂，适用于荧光检测，≥98.0%
二十一烷Aldrich28605298%
Brij O10SigmaP6136Brij 97，C18-1E10，聚氧乙烯（10）油醚
水SigmaW3500无菌过滤，生物试剂，适用于细胞培养
注射器滤器 0.2 µm Supor 膜，低蛋白结合Life SciencesPN4612无热原
Nanotrac Ultra Microtrac序列号 U1985IS仪器
差示扫描量热仪Mettler-Toledo仪器
原代人成纤维细胞 Life TechnologiesC-004-5C新生儿（HDFn）
Medium 106Life TechnologiesM-106-500用于人皮肤成纤维细胞培养的无菌液体培养基。
低血清生长补充剂试剂盒（LSGS 试剂盒）Life TechnologiesS-003-K完整 LSGS 的所有组分
MTT 细胞增殖检测试剂盒Trevigen4890-025-K基于四唑盐 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）还原反应测定细胞增殖的高灵敏度试剂盒
Safire2 微孔板读数仪Tecan----仪器
磷酸盐缓冲液 SigmaP5493适用于分子生物学
重组小鼠 GM-CSF Peprotech315-03>97%，通过还原条件下的 SDS-PAGE 分析并经银染显色验证。
重组小鼠 IL-4 Peprotech214-14>97%，通过还原条件下的 SDS-PAGE 分析并经银染显色验证。

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