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小鼠结肠黏膜显微解剖的冷冻切片法

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DOI：

10.3791/53112

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2015年7月12日

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1Epithelial Pathobiology and Mucosal Inflammation Research Unit, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, Georgia

本文内容

摘要

本文介绍一种简单的方法，用于分离空间位置不同的鼠结肠上皮表面细胞与 underlying crypt-base 细胞。

摘要

结肠黏膜组织为管腔内抗原提供了一道重要的屏障。该屏障由单层简单的柱状上皮细胞构成。结肠上皮处于动态更新状态，其上皮细胞由含有干细胞的利贝昆隐窝（Lieberkühn crypts）生成。在隐窝基底部产生的祖细胞向管腔表面迁移，并经历细胞分化过程，最终脱落进入肠腔。为了在分子水平上研究这些过程，我们建立了一种简便的方法，用于显微分离结肠黏膜中两个空间位置不同的区域：增殖性隐窝区和已分化的表面上皮细胞区。我们的目标是从小鼠结肠黏膜中分离出特定的隐窝和表面上皮细胞群体，以提取RNA和蛋白质。

引言

结肠上皮层是一种高度再生的组织，其组织每几天便由定居的干细胞进行更新1。这种再生过程需要维持一个具有增殖能力的干细胞区室。随着时间推移，新产生的子代细胞逐渐失去增殖潜能，并向肠腔表面迁移。在迁移过程中，前体细胞分化为成熟的形成屏障的肠上皮细胞或分泌黏液的杯状细胞。该分化程序的失败被认为可能导致上皮屏障功能受损，这在炎症性肠病和结肠癌中可见2,3。

深入研究上述过程需要分离隐窝基底和表面细胞群体的方法。目前存在多种方法，每种方法均有其独特的优势与局限性。现有的肠道上皮细胞分离方法包括使用螯合剂和机械解离，根据实验条件的不同，可获得完整的隐窝、上皮细胞片层或单个细胞4,5。这些方法细胞得率较高，但已有报道指出，在这些条件下细胞间的信号传导可能发生改变，无法真实反映其天然微环境6,7。激光捕获显微切割技术可用于获取空间位置明确的组织材料，但其分子得率较低8,9。在人类结肠组织中，已开发出连续水平冷冻切片法10。然而，小鼠黏膜组织体积过小，难以直接应用该技术。在人类中，结肠隐窝长度（隐窝基底至表面细胞的距离）约为 ~100–1,000 μm11。在小鼠中，隐窝长度约为 ~50–300 μm（见图1A）。小鼠隐窝体积较小，给现有实验方案中分离这两类细胞群体带来了挑战。

我们现介绍一种低成本、高得率的方法，用于分离小鼠结肠组织中的隐窝基底部和表面上皮细胞群体。以此方法获取的组织可进一步用于多种常规下游应用分析，包括免疫荧光染色、实时聚合酶链式反应（RT–PCR）或蛋白质印迹（western blotting）。.

方案

实验使用10至12周龄的C57BL/6小鼠。所有涉及动物的实验程序均经埃默里大学机构动物护理和使用委员会审查和批准，并依照美国国立卫生研究院的标准执行。

1. 实验设置

  1. 设置冷冻切片机
    1. 将冷冻切片机平衡至 -20 °C，包括微切刀片和样品夹（操作时务必极度小心刀片！）。
    2. 用OCT（最佳切割温度包埋剂）填充一个空的冷冻模具，并平衡至 -20 °C（约30分钟）。将已冻结的OCT从模具中取出，用液态OCT将其固定在样品夹上。将样品块/样品夹装入微切臂中，静置10分钟使OCT完全凝固。
    3. 将冷冻切片机设定为每片10 µm厚度，修片至OCT样品块表面平整。将微切臂从刀片处向后移开数厘米。此后在整个实验过程中不再调整刀片或样品夹位置。
  2. 准备剃须刀片：每份样品准备2片剃须刀片。使用金属锉刀将刀片的锋利边缘磨钝。接着，用镊子取下铝制法兰。
  3. 将一个Pyrex培养皿或其他平坦表面置于干冰上预冷。
  4. 准备一个解剖皿，插入10-15根解剖针。可使用直径10 cm、填充50%硅胶的组织培养皿。加入5 ml室温的Hanks缓冲液。

2. 远端结肠组织的解剖

  1. 将小鼠放入密闭容器中，通过吸入异氟烷并进行颈椎脱位处死小鼠，然后用70%乙醇喷洒腹部和胸部12。
  2. 用剪刀在腹部皮肤上做一小切口，再做切口以暴露腹膜腔。类似的操作步骤可参见此处12。
  3. 在肛缘处切断大肠，并分离肠系膜，直至结肠完全游离。
  4. 切除距肛门0至6 cm处的一段远端结肠。此处隐窝深度约为150 µm（见图1B）。用剪刀沿纵轴切开结肠，并清除粪便内容物。
  5. 将组织固定于解剖皿中，黏膜面朝上。在Hanks缓冲液中，用解剖针将组织在硅胶皿上拉伸，并于室温下静置10分钟（图1C）。此步骤可消除组织褶皱，并使肌肉层松弛。

3. 将组织安装到冷冻切片机上进行切片

  1. 将剃须刀片滑入所需组织切片下方，倒掉 Hank's 平衡盐溶液。在顶部再加一片剃须刀片，形成三明治结构。切割组织片段并移除固定针。将剃须刀片/组织三明治转移至干冰上。使组织冷冻（5–10 分钟，图 1D）。
  2. 拿起剃须刀片/组织三明治，用手指轻触顶部刀片使其略微升温（黏膜面朝上。此方向可确保先切到基底肌层）。分开三明治，沿组织边缘进行修切。切取一段约 0.5 cm × 1 cm 的组织。边缘区域容易卷曲，导致连续切片中包含多层组织。注意宁可多切勿少切，应谨慎操作以避免切得过小。
  3. 让组织稍升温，直至组织表面的冰开始融化。此时迅速而小心地将组织压入恒冷切片机中的 OCT 包埋块内。
  4. 用手指按住样本以移除刀片。热量传递将使您能够取下刀片而不破坏组织。
  5. 用 OCT 包埋剂覆盖组织，并平衡 5 分钟。在恒冷切片机中以 10 µm 厚度切片（图 1E、F）。肉眼检查切片，直至观察到隐窝结构。将切片放入 1.5 ml 离心管或载玻片上。
  6. 如需分析 mRNA 或蛋白质，将样本放入离心管中，每管包含 5 张隐窝基底部、5 张过渡区和 5 张表面区切片。用于 RNA 提取时，每管加入 1 ml 商业裂解试剂，室温孵育 10 分钟。按照试剂盒说明书进行 RNA 纯化。使用 5–10 µg 总 RNA 进行 cDNA 合成。
  7. 如需进行蛋白质提取，每 5 张切片加入 0.5 ml 冰冷 RIPA 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）。在冰上以 70% 功率超声处理 3 次。
    1. 将样本加入 SDS-PAGE 上样缓冲液（Laemmli 缓冲液），100 °C 孵育 10 分钟。进行 SDS-PAGE 电泳并转膜，随后用含 5% 脱脂奶粉的 PBS 封闭 2 小时。进行 Western 印迹分析，然后加入 KLF4 抗体（1:500 稀释），4 °C 过夜孵育。

结果

结肠组织切片经处理后用于组织学评估和H&E染色13。在图2A中可见黏膜的传统横截面视图。基底部包含主要由环形肌层构成的外肌层。向肠腔方向依次可见：黏膜肌层紧邻隐窝基底部的上皮细胞，中间区域为过渡细胞，最表层的细胞群则面向肠腔。此处所述的连续切片方法保持特定取向，使得纵行肌和环形肌首先被观察到（图2B），随后是黏膜肌层（图2C）。请注意图像左上角出现的非肌性间质细胞。在下文所述的后续分析中，肌肉部分将被弃去。接下来的切片包含上皮细胞和间质组织（固有层），起始于隐窝基底部的细胞（图2D）。请注意大多数隐窝中无明显的中央管腔，由于细胞核排列紧密，隐窝染色较深。这些层次包含增殖区。过渡细胞表现为排列紧密的腺体结构，具有明显的中央管腔（图2E）。最后，表层细胞群结构不规则，部分区域的上皮单层以正面观（en face）呈现（图2F）。

如上所述的连续切片也可用于免疫荧光标记和共聚焦显微镜分析（如文献14所述）。图2G展示了用100%甲醇固定并通透处理的分离隐窝，随后对细胞核（蓝色）和细胞间连接蛋白闭锁小带蛋白1（ZO-1，绿色）进行染色。在传统的切片方向中，可同时观察到隐窝和表面细胞（图2G）。请注意，ZO-1的连接结构染色沿结肠隐窝管腔分布。这种沿管腔分布的ZO-1信号也可在过渡细胞群体的连续切片样本中观察到，位于圆形腺体的中央区域（图2G）。在表面细胞群体中可见增强的ZO-1染色信号（图2I 和 J）。

已知多种分化因子沿隐窝至表面轴呈时空特异性表达。其中包括转录因子Kruppel样因子4（KLF4），该因子在表面细胞群体中富集。利用传统的切片方法，可在管腔面朝向的表面细胞群体的细胞核中检测到KLF4（图2K）。因此，我们推测KLF4 mRNA主要在表面细胞群体中表达。为验证这一假设，收集连续切片并分组为表面、过渡区及隐窝基底部样本。随后采用标准Trizol法提取RNA，并通过RNeasy柱进一步纯化及DNA酶处理。每份样本收集自5张连续切片的合并组织，可获得5–10 µg总RNA。接着对KLF4和参照基因TATA框结合蛋白1（TBP-1）进行半定量实时PCR分析（图2L）14。如图2L所示，在以TBP-1归一化后，表面细胞中KLF4 mRNA的表达量可达隐窝细胞的8倍。类似地，KLF4蛋白水平在隐窝-表面轴上也表现出空间调控特征。将连续切片按上述方法合并后，在4 °C下用裂解缓冲液孵育20分钟，每份样本可获得200–250 µg蛋白。随后对样本进行SDS-PAGE分析（图2M）15。如图2M所示，表面细胞群体中的KLF4蛋白水平显著高于隐窝细胞。上述结果表明，本方案能够从鼠结肠黏膜中有效分离出大量表面和隐窝上皮细胞。

结肠黏膜示意图与图表；组织学切片及隐窝高度测量。
图 1：（A）小鼠结肠黏膜及外层肌层的示意图。本方法旨在通过连续冷冻切片（每片 10 μm）分别收集表面细胞和隐窝基底部细胞群体，外层肌层被弃去。（B）隐窝高度沿结肠长度方向存在差异（隐窝基底部与表面层之间的距离）。数据点代表单个隐窝的测量值，符号代表生物学重复（n = 4）。（C）采集的结肠节段被纵向剖开，并固定在硅胶解剖盘上。（D）距肛门约 3 cm 处的组织段被夹在两片刀片之间，并在干冰上速冻。（E）随后将组织固定于预先调平的 OCT 包埋块上。（F）切取冷冻切片并进行肉眼检查。

肠道切片的组织学与免疫荧光；隐窝至表面；KLF4 RNA及蛋白分析。
图 2：代表性数据。（A）结肠组织横切面的苏木精-伊红染色，显示环形肌层（c.m.）、黏膜肌层（m.m.）、隐窝基底细胞、过渡细胞和表面细胞。（B–C）结肠肌层。（D）隐窝基底细胞，注意无中央管腔。（E）过渡细胞。（F）表面细胞。（G）分离的结肠隐窝免疫荧光染色，横切面中可见ZO-1（绿色）和细胞核（蓝色）。（H–I）过渡细胞和表面细胞中ZO-1与细胞核的染色。（J）ZO-1染色的放大视图。（K）KLF4（绿色）在表面细胞群体中富集。（L）三个区室中KLF4 mRNA水平的实时PCR检测。（M）这些细胞群体中KLF4蛋白水平的蛋白质印迹分析。

讨论

结肠上皮细胞增殖与分化的分子机制目前尚不明确，其中包括对位于结肠上皮隐窝基底部的干细胞区室中细胞信号微环境的认识仍存在空白。此外，人们对肠上皮细胞分化的潜在过程也日益关注。例如，为了建立体外原代肠道系统的研究提供参照基准，迫切需要更深入地理解体内（in vivo）的细胞分化过程16。

上述步骤包含若干需要特别注意的环节。首先，必须去除冷冻组织片段周围的边缘部分（如第3.2节所述），因为在解剖和冷冻过程中组织边缘会发生卷曲。若未去除这些边缘，将导致表面细胞与隐窝基底细胞混合。将组织固定在预冷且水平的OCT包埋块上也至关重要。本方案可通过调整每组切片的数量，适用于远端结肠的其他区域。例如，如图1B所示，黏膜隐窝长度在150–300 μm之间。因此，在研究距肛门4 cm–6 cm区域时，应将切片数量从15片增加至30片。需要注意的是，由于近端结肠（7 cm–9 cm）存在伸入管腔的皱褶（斜褶，plicae obliquae），无法通过连续切片分离表面细胞与隐窝基底细胞，因此本方案不适用于该区域。

连续切片技术已被用于研究人类隐窝基底部和表面上皮细胞群体。然而，由于小鼠组织体积较小，本方案增加了若干必要步骤。我们提出，上述方案可用于在遗传学上易于操作的小鼠系统中研究隐窝基底部和表面上皮细胞群体。事实上，合并的切片可获得高质量的蛋白质和RNA，适用于后续分析。未来应用可能包括细胞信号通路研究或染色质免疫共沉淀实验。但需要注意的是，与上述若干替代方法类似，所得切片包含上皮细胞与间质固有层细胞的混合物。总之，本文所述方案为分析小鼠结肠黏膜不同空间区域的分子过程提供了一种快速且高产量的方法。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

由美国国立卫生研究院（DK55679 和 DK59888，授予 A.N.）及埃默里大学支持 温希普癌症研究所综合细胞成像显微技术中心 综合癌症中心资助项目 P30CA138292，克罗恩病与结肠炎基金会美国职业发展奖授予 C.T.C.，以及博士后奖学金授予 A.E.F.

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
切片机Leica Biosystems, Nussloch GermanyCM 1510-3
MyiQ 实时荧光定量 PCR 检测仪BioRad
LSM 510 Carl Zeiss共聚焦显微镜
OCT 包埋剂Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA4583
冷冻模具Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA455725mm×20mm×5mm
高轮廓切片机刀片Leica Biosystems, Nussloch Germany818
GEM 工业刀片American Safety Razor Blades62-0314
Sylgard 硅橡胶基底Dow Corning, Midland MI3097358
27½ 号针头Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ305109解剖用针
TRizolLife Technologies15596018
RNeasyQiagen74104
DNaseQiagen79254
ZO-1 抗体Invitrogen 187430
KLF4 抗体Cell Signaling4038S
mGAPDH 抗体SigmaG8795
Alexa 荧光标记二抗InvitrogenA11034488 标记抗兔抗体
HRP 标记二抗Jackson111/115-001-003兔/鼠 
Topro-3InvitrogenT3605
Hanks 平衡盐缓冲液Life Technologies14025092
RIPA 裂解缓冲液50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.25% 脱氧胆酸钠
TBP 3' 引物GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA
TBP 5' 引物GATGACTGCAGCAAATCGCTT
KLF4 3' 引物TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA
KLF4 5' 引物ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT

参考文献

  1. Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).
  2. Humphries, A., Wright, N. A. Colonic crypt organization and tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).
  3. Weber, C. R., Turner, J. R. Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall. Gut. 56, 6-8 (2007).
  4. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  6. Rand, M. D., et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors. Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).
  7. Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).
  8. Lechner, S., et al. Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia. Gut. 52, 1148-1153 (2003).
  9. Reizel, Y., et al. Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction. PLoS Genet. 7, e1002192(2011).
  10. Kosinski, C., et al. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).
  11. Tamura, S., et al. Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm. J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).
  12. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine. Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040(2012).
  13. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
  14. Neumann, P. A., et al. Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon. Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).
  15. Capaldo, C. T., et al. Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins. Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).
  16. Wells, J. M., Spence, J. R. How to make an intestine. Development. 141, 752-760 (2014).

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