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方法文章

前列腺癌临床组织中的miRNA表达分析

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DOI：

10.3791/53123

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2015年9月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

本文内容

摘要

本文介绍一种简化的微小RNA（miRNA）表达分析方案，适用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌（PCa）临床组织样本，采用定量实时聚合酶链式反应（RT-PCR）进行检测。 原位 杂交（ISH）

摘要

前列腺癌（PCa）临床管理中的一个关键挑战在于目前所用生物标志物在疾病筛查、诊断、预后及治疗方面的不足。近年来，微小RNA（miRNAs）作为前列腺癌诊断与预后潜在替代性生物标志物展现出良好前景。然而，miRNA能否成为有效的前列腺癌生物标志物，在很大程度上依赖于其在临床组织样本中被准确检测的能力。由于肿瘤异质性、取样误差以及间质污染等因素，前列腺癌临床标本中的miRNA分析常常面临困难。 等。 本文旨在介绍一种简化的工作流程，用于对存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌临床样本进行miRNA分析，该流程结合了定量实时PCR（RT-PCR）与 原位 杂交（ISH）。在该工作流程中，我们优化了从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）及冷冻前列腺组织中提取miRNA的现有方法，并采用基于TaqMan探针的miRNA逆转录PCR进行表达分析。此外，我们描述了一种利用锁核酸（LNA）探针检测前列腺组织中miRNA的优化ISH方法。我们优化后的miRNA ISH方案可应用于前列腺癌组织切片或前列腺癌组织微阵列（TMA）。

引言

前列腺癌是一种常见的男性恶性肿瘤，也是导致男性癌症相关死亡的主要原因之一。在美国，预计2015年将报告约220,800例新发病例和27,540例死亡病例1。

前列腺癌是一种异质性疾病，其病程差异极大——肿瘤可能表现为惰性，也可能极具侵袭性。在前列腺癌的临床管理中，一个关键挑战在于目前用于疾病筛查、诊断、预后和治疗的方法或生物标志物尚不充分2。当前的筛查方法包括前列腺特异性抗原（PSA）检测和直肠指检（DRE），随后进行前列腺活检3。前列腺特异性抗原（PSA）是目前应用最广泛的前列腺癌生物标志物，已显著革新了临床管理并提高了患者的生存率4。然而，由于PSA本身存在特异性不足等固有局限性，基于PSA的筛查已导致疾病的过度诊断和过度治疗。鉴于此，目前正大力开展研究，以寻找可替代的前列腺癌生物标志物，特别是那些能够预测疾病侵袭性并有助于优化治疗决策的标志物4,5。近年来，微小RNA（miRNA）已成为极具前景的替代性前列腺癌生物标志物。

microRNA（miRNA）是一类在进化上保守的小分子非编码RNA，可通过与靶mRNA的3’-非翻译区（UTR）进行序列特异性相互作用，在转录后水平抑制基因表达。据估计，超过>60%的mRNA是miRNA的保守靶标6。miRNA基因位于基因间区域，或存在于蛋白质/非蛋白质编码基因的内含子或外显子中7。这些基因主要由RNA聚合酶II转录生成初级miRNA（pri-miRNA，长度达数千碱基），其可形成发夹状的茎环二级结构。pri-miRNA随后被加工为前体miRNA（pre-miRNA，长约60–75个核苷酸），转运至细胞质后进一步加工生成成熟miRNA（长约18–25个核苷酸）8-10。miRNA调控多种关键细胞过程，包括增殖、发育、分化和凋亡11。研究表明，在包括前列腺癌在内的多种人类恶性肿瘤中，miRNA的表达谱存在广泛失调12-15。已有报道显示，原发性和转移性前列腺癌中的miRNA表达谱均显著失调。miRNA表达的异常与前列腺癌的进展、侵袭性及复发密切相关，凸显了miRNA在预后评估中的潜力12,14,16-19。越来越多的证据表明，miRNA在前列腺癌的发生、发展、进展及转移过程中发挥重要的机制性作用。总体而言，miRNA正成为极具前景的前列腺癌诊断与预后替代生物标志物，能够区分正常组织与癌组织，并有助于前列腺肿瘤的分层12。此外，miRNA也是开发针对前列腺癌有效治疗手段的重要靶点20。

由于其分子量小且对内源性RNase活性具有抗性，miRNA是稳定的生物标志物，可在福尔马林固定组织中被 readily 检测到21 以及前列腺活检中22此外，已对冷冻组织和福尔马林固定组织中的miRNA表达谱进行了比较，发现两者之间具有高度相关性21然而，由于肿瘤异质性、取样误差、间质污染等因素，前列腺癌临床组织中的miRNA表达谱分析常常面临挑战。miRNA能否成为前列腺癌有效的生物标志物，在很大程度上依赖于其在临床组织中被准确检测的能力。本文介绍了我们实验室用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌临床样本中miRNA表达谱分析的简化工作流程。我们采用定量实时PCR与 原位 用于临床样本miRNA分析的杂交技术，前者可提供更定量的信息，后者则用于可视化多种组织中潜在miRNA生物标志物的差异表达。在此工作流程中，我们优化了从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和冷冻前列腺组织中提取miRNA的现有方法，并采用基于TaqMan探针的miRNA逆转录PCR及miRNA表达分析 原位 使用锁核酸（LNA）探针的杂交技术23LNA探针相比DNA或RNA探针具有更高的灵敏度和特异性，能够稳定检测所有miRNA序列，不受其GC含量影响，同时可实现miRNA家族成员的区分。我们优化的miRNA原位杂交（ISH）方案适用于前列腺癌组织切片或前列腺癌组织微阵列（TMA），后者有助于加快miRNA生物标志物的发现进程。

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方案

前列腺癌样本（包括福尔马林固定石蜡包埋样本或新鲜冷冻样本）来自旧金山退伍军人医疗中心（SFVAMC），样本取自曾在该中心接受根治性前列腺切除术的前列腺癌患者。所有患者均签署书面知情同意书，研究经加州大学旧金山分校（UCSF）人类研究委员会批准。此外，前列腺癌组织微阵列购自商业来源，并用于通过原位杂交（ISH）进行miRNA分析。同时收集了所分析前列腺癌患者的临床病理学资料及随访信息。

1. 组织样本

  1. 使用切片机将前列腺癌组织样本切成10 µm的切片，并按照制造商的说明书进行H&E染色。
  2. 观察染色后的切片，以识别前列腺癌病灶以及邻近的正常腺上皮组织。
    注意：应由经委员会认证的病理学家审查H&E染色切片，并标记肿瘤区域和正常区域。在后续用于miRNA分析的切片中，以这些已标记的切片作为肿瘤区域与正常区域取材的参考指南。

2. 通过定量实时 PCR 进行 miRNA 表达分析

注意：该实验流程包括以下步骤：激光捕获显微切割、总RNA（包括miRNA和mRNA）的提取，以及使用TaqMan MicroRNA表达检测试剂盒对成熟miRNA进行检测，具体方法详见下文各节。

  1. RNA 提取
    1. 从前列腺癌 FFPE 组织中分离 miRNA
      1. 激光捕获显微切割（LCM）
        注意：步骤 2.1.1.1.1–2.1.1.1.4 需在化学通风橱中进行。
        1. 准备用于 LCM 的组织切片（10 µm 厚度）。将组织切片浸入二甲苯中脱蜡（两次），每次 10 分钟，然后依次在梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）中各孵育 5 分钟，最后用蒸馏水处理 5 分钟以完成再水化。
        2. 再水化后，用苏木精染色 30 秒，随后用水冲洗。
        3. 将组织依次置于梯度乙醇（70%、95%、90%、80%、70%）中（每步 5 分钟）及二甲苯中（5 分钟）。
        4. 在通风橱中干燥切片，随后将其放入 LCM 仪器中进行显微切割。
        5. 按照制造商说明书24操作 LCM 系统进行显微切割。以经病理学家标记的切片为参考，识别前列腺癌病灶及相邻正常组织。使用直径为 10–20 µm 的激光脉冲，功率设置为 70–90 mW。
        6. 利用红外激光脉冲将目标区域捕获至 LCM 收集帽上。每个样本合并 2–5 个收集帽中的细胞用于 miRNA 提取。为确保所提取 RNA 的完整性，应立即对捕获的细胞进行 miRNA 提取处理。
        7. 或者，可将细胞直接裂解于 miRNA 提取缓冲液中（按照制造商方案），并将裂解液储存于 -80 ºC。
      2. LCM 显微切割组织中 miRNA 的提取与分析
        1. 使用商业试剂盒，按照制造商说明书从显微切割的 FFPE 组织中提取总 RNA。
          注意：激光捕获显微切割所得 RNA 产量通常较低。因此，建议将 RNA 洗脱至较小体积（20–30 µl），并用于后续 TaqMan microRNA 表达检测（按制造商说明书操作，详见第 2.2 节）。为优化成熟 miRNA 实时 PCR 检测的 RNA 输入量，建议每个 miRNA 特异性逆转录反应使用 5 µl 洗脱 RNA。以内源性对照 RNU48/RNU24 进行标准化。对照反应中，每个逆转录反应使用 2 µl 洗脱 RNA。
    2. 从前列腺癌冷冻组织中分离 miRNA
      1. 使用研钵和研杵在液氮中研磨冷冻的前列腺切除组织，使其匀浆化。用预冷的刮勺将匀浆组织转移至微量离心管中。通过将研钵/研杵和刮勺反复浸入液氮中以维持低温，确保组织匀浆可顺利转移。
      2. 向匀浆组织中加入商用异硫氰酸胍-苯酚试剂（每 0.1 g 组织加 1 ml），室温孵育 5 分钟。
        注意：匀浆组织在商用异硫氰酸胍-苯酚试剂中可在 -80 ºC 下保存数月。
      3. 向匀浆液中加入氯仿（每毫升匀浆液加 0.2 ml），剧烈振荡 30 秒。室温孵育 3–5 分钟后，在 4 ºC 下以 10,000 × g 离心 20 分钟。
      4. 将上层水相转移至新的无菌无 RNase 的 1.5 ml 离心管中。
      5. 加入等体积异丙醇，混匀后室温孵育 10 分钟，随后在 4 ºC 下以 12,000 × g 离心 20 分钟以沉淀 RNA。
      6. 吸除上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。在 4 ºC 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
      7. 小心吸除上清液，在室温下干燥 RNA 沉淀 5–10 分钟。将 RNA 溶解于 50–100 µl 无核酸酶水中。
      8. 使用 Nanodrop 分光光度计测定 RNA 浓度，并通过生物分析仪评估 RNA 完整性。将 RNA 浓度调整至 10 ng/µl。每个 miRNA 特异性 cDNA 反应使用 10–50 ng RNA，随后进行实时 PCR 分析（见第 2.2 节）。
  2. miRNA 表达分析的定量实时 PCR
    注意：采用以下所述的两步 RT-PCR 方案检测成熟 miRNA。
    1. 逆转录（RT）
      1. 使用 miRNA 逆转录试剂盒，按照制造商说明书将 RNA 逆转录为 cDNA。每个反应使用 10–50 ng 总 RNA 及 MicroRNA Assays 和 RT 试剂盒中的 miRNA 特异性引物。以 RNU48/RNU24/RNU6B 作为对照。将 cDNA 稀释 5–10 倍（根据待测 miRNA 的丰度而定），用于下一步所述的实时 PCR 检测。
    2. 成熟 miRNA 检测的实时 PCR
      1. 使用 MicroRNA 检测试剂和 Fast Universal 预混液，按照制造商说明书对 cDNA 样本进行 PCR 扩增。以 RNU48/RNU24/RNU6B 作为内参对照进行样本标准化。在 Fast Real-Time PCR 系统上采用相对 Ct（阈值循环）法计算基因表达的相对变化。每个样本设三个重复。

3. 通过miRNA表达分析 原位 杂交（原位杂交，ISH）

  1. 组织预处理
    1. 使用切片机从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的前列腺癌组织块中切下5 µm厚的切片。
    2. 将载玻片在56 °C下孵育1小时以固定组织切片。
      注意：用于miRNA分析的载玻片可在室温下保存数周。
    3. 用二甲苯浸泡载玻片（2次），每次15分钟，以脱去石蜡。
    4. 依次将载玻片在梯度乙醇（100%（2次）、95%、90%、80%、70%）中各孵育5分钟进行再水化，最后在蒸馏水中孵育5分钟。
    5. 在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定载玻片20分钟。
    6. 在室温下用PBS洗涤载玻片（2次），每次5分钟。
    7. 在预热的蛋白酶K缓冲液（5 mM Tris-HCl pH 7.4，1 mM EDTA，1 mM NaCl）中，于37 ºC下用10 µg/ml蛋白酶K处理载玻片10分钟。
    8. 蛋白酶K处理后，用含0.2%甘氨酸的PBS冲洗载玻片30秒。
    9. 在室温下用PBS（1次）洗涤载玻片5分钟。
    10. 用含4%多聚甲醛的PBS在室温下固定载玻片15分钟。
    11. 用PBS冲洗载玻片5分钟。
  2. 杂交
    1. 在湿化 chamber 中，于55 ºC下用预杂交液对载玻片进行预杂交3–4小时。使用浸有50%甲酰胺/50% 5x SSC的组织实验擦拭纸保持 chamber 内湿度。
    2. 在杂交缓冲液中使用5’端地高辛标记的探针，浓度为20–50 nM。将特异性miRNA探针（20–50 nM）和小核RNA U6对照探针（20 nM）稀释后，在90 ºC加热4分钟，立即置于冰上冷却，然后加入冰冻的杂交缓冲液（2–4 ng/µl）中。
    3. 去除预杂交液，加入杂交液（探针+杂交缓冲液，每张载玻片100 µl），在探针特异性的杂交温度下孵育12–16小时（杂交温度 = 探针Tm值 - 21 ºC）。在湿化 chamber（含50%甲酰胺/50% 5x SSC）中进行杂交反应。
  3. 洗涤步骤
    1. 在45 ºC下用2x SSC洗涤载玻片10分钟。
    2. 在45 ºC下用1.5x SSC洗涤载玻片10分钟。
    3. 在37 ºC下用0.2x SSC（2次）洗涤载玻片，每次20分钟。
    4. 在室温下用1x封闭液孵育载玻片1–2小时。
  4. 检测
    1. 在室温下用PBS按1:100稀释的碱性磷酸酶（AP）偶联抗地高辛抗体孵育载玻片1–4小时，或在4 ºC下孵育过夜。
    2. 在室温下用PBS（3次）洗涤载玻片，每次10分钟。
    3. 在室温下用碱性磷酸酶缓冲液（100 mM Tris pH 9.5，50 mM MgCl2，100 mM NaCl，0.1% Tween-20）洗涤载玻片（2次），每次5分钟。
    4. 在避光条件下，于室温下用BM Purple AP底物孵育载玻片1–20小时。
    5. 用含0.1% Tween-20的PBS冲洗载玻片，并在水中洗涤（2次）。
    6. 使用水溶性封片介质封片，并在显微镜下观察。

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结果

通过RT-PCR分析LCM分离的前列腺癌临床标本中miR-203的表达谱（图1）

采用Saini所述方法对LCM分离的前列腺癌原发组织及其配对的相邻正常区域中miR-203的相对表达水平进行RT-PCR分析 等15 RNU48 用作对照。下表总结了前列腺癌肿瘤组织相对于邻近正常组织中 miR-203 的相对表达水平。

通过RT-PCR分析比较显微切割与激光捕获显微切割的PCa组织中miR-383的表达水平（图2）

前列腺癌组织在显微镜下进行显微切割，或经激光捕获显微切割（LCM）后，通过RT-PCR分析肿瘤组织中miR-383的表达水平，并与配对的相邻正常组织进行比较。图中显示了肿瘤样本中miR-383的相对表达水平。以RNU48作为对照。如图2所示，在分析这些组织中的miRNA表达时观察到了差异。...

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讨论

本文介绍了一种简化的微小RNA（miRNA）表达谱分析工作流程，适用于存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或新鲜冷冻的前列腺癌临床组织样本。在前列腺癌研究中，多项研究表明微小RNA在前列腺癌的发生、发展及转移过程中发挥重要作用。然而，由于不同研究中miRNA的提取与分析方法差异较大，针对特定miRNA所得结果常存在矛盾22。鉴于越来越多的证据支持将miRNA作为前列腺癌预后、诊断和治疗的潜在替代性生物标志物，迫切需要对临床组织中的miRNA表达谱进行准确的定量分析。

我们采用定量实时 PCR 与 原位 用于前列腺癌临床样本中miRNA分析的杂交技术。在此实验流程中，我们优化了现有的miRNA提取方法、基于TaqMan引物的RT-PCR表达分析以及利用LNA探针的原位杂交（ISH）分析方法。在整个操作过程中，保持无RNase的环境至关重要。所有使用的试剂/溶液均应为无RNase的，且在处理RNA及其他试剂时需格外小心。所有实时反应均应在冰上进行配制，以最大限度减少RNA降解。

前列腺癌组...

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致谢

感谢 Roger Erickson 博士在手稿准备过程中提供的支持与帮助。

本工作由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助

（资助编号 RO1CA177984；RO1CA138642），退伍军人事务部前列腺癌项目计划（BX001604）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
切片机Leica Biosystems RM2255
Arcturus Autopix 激光显微切割系统Arcturus/Life TechnologiesLCM1621/LCM1110也可使用 Life Technologies 的 Arcturus Xt 系统。 
CapSure Macro LCM 切割帽Life TechnologiesLCM0211
miRNeasy FFPE 试剂盒 Qiagen217504
7500 快速实时荧光定量 PCR 系统 Applied Biosystems/Life Technologies4351106
TaqMan microRNA 反转录试剂盒 Applied Biosystems/Life Technologies4366596
TaqMan 快速通用 PCR 预混液 Applied Biosystems/Life Technologies4352042
地高辛标记的 LNA U6 探针Exiqon99002-01
BM Purple AP 显色底物Roche11442074001
预杂交溶液 BiochainK2191050-1
杂交溶液 BiochainK2191050-2
封闭溶液 BiochainK2191050-8
碱性磷酸酶偶联抗地高辛抗体BiochainK2191050-7
水溶性封片剂 Vector Laboratories H-5501  
Trizol（异硫氰酸胍-苯酚试剂） Life Technologies15596-018
哈里斯苏木精StatlabSL200
伊红 StatlabSL201 

参考文献

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