高分辨率 离体 7T MR成像方案用于对死后人脑组织中的微血管病理进行MR引导下的组织病理学验证。此外，还提供了评估皮层微梗死的指南 体内 7T 以及 3T 磁共振图像。
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本文内容
摘要
摘要
脑微梗死在人脑尸检中常见，且与认知功能下降和痴呆相关。由于其体积微小，在临床磁共振成像（MRI）扫描中难以对其进行研究。最近研究表明，利用高场强（7T）MRI扫描仪可显示皮层微梗死。基于该研究经验，部分此类病灶在分辨率较低的3T MRI上亦可见。这些发现已得到验证 离体 死后人脑组织成像，结合可能的皮质微梗死组织病理学验证。
本文介绍了一种ex vivo成像方案，用于通过组织学评估验证磁共振成像所观察到的脑微血管病变。此外，还提供了在in vivo 7T和3T磁共振图像上评估皮质微梗死的指导原则。这些指导原则为研究人员提供了一种工具，可在更大样本量患者的活体图像上对皮质微梗死进行评级，从而进一步揭示其在认知功能下降和痴呆中的临床意义，并将这些病灶确立为脑小血管病的一种新型生物标志物。
引言
超高场强7特斯拉（T）磁共振成像（MRI）在患者研究中的应用正在迅速发展1。本文介绍了一项7T MRI在人类老年大脑脑血管疾病研究中的代表性应用。脑血管疾病是认知功能下降和痴呆的主要原因。这种血管性因素导致的痴呆通常涉及脑内的小血管，例如小动脉、小静脉和毛细血管，因此被称为脑小血管病（cerebral small vessel disease, SVD）2。由于脑小血管过于微小，常规MRI难以直接显示，因此目前仅能观察到SVD所引起的组织损伤后果i.e.，即继发性组织损害。这些表现包括白质高信号、脑微出血和腔隙性脑梗死3。
SVD 的其他重要表现为脑微梗死（CMIs）4。尸检研究显示，脑微梗死在血管性痴呆和阿尔茨海默病中具有较高的患病率5。然而，由于其体积较小（范围为 50 µm 至数毫米），在常规 MRI 上难以被检测到4,5。7T MRI 能够提供高分辨率图像，并具有更高的信噪比和对比度，从而可检测到某些超出常规 MRI 检测极限的结构和病灶。因此，该技术被应用于检测脑微梗死。为识别可能的脑微梗死病灶，先前已对大量 in vivo 的 7T MRI 扫描图像进行了筛查，寻找大小<5 mm 且影像特征符合缺血性病变的病灶。这类病灶在皮层中可被可靠识别。这些局灶性条状病灶在 7T FLAIR 图像上呈高信号（0.8 mm 各向同性体素），局限于皮层并似乎从皮层表面延伸，在 T2 加权像上呈高信号（0.7 mm 各向同性体素），在 T1 加权像上呈低信号（1.0 mm 各向同性体素）。通过在死后人脑组织中采用磁共振引导下的组织病理学方法，已证实这些病灶为皮层脑微梗死6,7。
本文介绍了先前研究中用于皮层脑微梗死（CMIs）组织病理学验证的离体（ex vivo）MRI 检测方案。其次，提供了在活体（in vivo）7T MRI 上评估皮层 CMIs 的指导原则。最后，已将 7T MRI 上皮层 CMIs 的评估方法转化为更广泛应用的 3T MRI，本文同时提供了在 3T MRI 上识别皮层 CMIs 的操作指南。
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方案
本方案中使用尸体解剖样本和体内磁共振图像均符合当地法规，并已获得乌得勒支大学医学中心（UMCU）当地机构审查委员会的批准。
1. 磁共振引导下的皮层微梗死组织病理学验证
- 离体 MRI
- 处理脑组织时，务必佩戴手套并穿着适当的防护服。
- 根据研究问题，选择合适的、 preferably 10 mm 厚的福尔马林固定脑片。本文所用脑片来源于乌得勒支大学医学中心（UMCU）和荷兰VU大学医学中心（VUMC）的神经病理学部门，基于已知的阿尔茨海默病病理特征。
- 在切片前，将完整脑组织浸入10%福尔马林中固定至少3–4周。将脑组织切成包含双侧半球的冠状切片。
- 对于死后扫描，可选择每例脑组织三个脑片，分别取自额叶、颞顶叶和枕叶区域。本方案优化了单次扫描中同时使用三个包含双侧半球的冠状脑片的成像流程。
- 对脑片的两侧（背侧和尾侧）进行拍照，并仔细记录（或绘制示意图）脑片在容器及扫描仪中的方向，以便后续将组织学结果与MRI图像进行共定位分析。
- 将专用容器（图1）——本例中为可放入MR头部线圈的容器——在室温下装满10%新鲜福尔马林。若不希望液体产生MRI信号，可使用适当密度的全氟聚醚（PFPE）润滑剂替代福尔马林（例如Fomblin或Galden PFPE）。操作福尔马林时务必使用通风柜。
- 将脑片放入容器时，应避免产生气泡。可通过手动轻轻摇晃组织，或使用摇床或超声波清洗仪，尽可能去除大部分气泡。
- 使用较小的辅助容器固定脑片位置，防止其在主容器内移动，同时减少所需液体用量（图1）。
- 用塑料膜或Parafilm密封容器，以防止液体蒸发，并保护MR（头部）线圈免受潜在污染（图2）。
- 使用配备适当线圈的全身7T MRI扫描仪。本方案采用双通道发射、32通道接收的头部线圈。
- 将容器放入头部线圈中，并用毛巾或手术垫包裹，以防液体泄漏。确保容器不会移动，且脑片保持水平位置（图2）。
- 运行定位扫描，用于规划高分辨率扫描序列；使用适当的匀场工具校正B0不均匀性；根据制造商的操作指南校准射频功率，以获得正确的翻转角（由于仅扫描少数脑片，所需功率低于对完整头部进行活体扫描时的需求）。
- 在定位图像上规划高分辨率扫描序列，确保脑片完全包含在视野范围内。使用表1所示的高分辨率序列对脑片进行过夜扫描，这些序列已针对离体成像进行了优化。本方案包括各向同性分辨率为0.4 mm的三维FLAIR、T2加权和T1加权图像，以及各向同性分辨率为0.18 mm的T2*加权图像。
- 识别可能中断扫描的自动软件进程，例如过夜运行的自动更新程序或外周神经刺激警告，确保这些因素不会干扰扫描过程。
- 通过例如VPN连接等方式，对扫描仪进行过夜监控，及时处理可能出现的确认弹窗，避免扫描中断。
- 次日早晨返回（当前方案总扫描时间约为12小时）。将脑片存回福尔马林中，并清理现场。
- 将图像保存至外置硬盘。
图1. 用于死后7T MRI扫描的福尔马林固定脑片制备。 使用特制的有机玻璃容器，其中装入10%福尔马林或全氟聚醚（PFPE）润滑剂（若不希望液体产生MRI信号）。将三块厚度为10 mm的福尔马林固定冠状脑片放入容器中。使用一个较小的容器固定脑片位置，并用胶带将第二个容器固定在第一个容器上，以防止移动。
图 2. 专用容器在7T头部线圈中的放置。用塑料膜或封口膜覆盖容器，以防止福尔马林蒸发。将容器包裹在毛巾或手术垫巾内，置于7T磁共振成像仪的头部线圈中。确保容器固定不动，且组织样本保持水平位置。
- 组织病理学
- 在获取的图像上识别可能的皮层脑微梗死（CMIs）或其他感兴趣的病灶。这些病灶即为组织学分析的目标。注意识别伪影，例如死后组织损伤（有时因脑组织切片时的切割导致表面出现）或长期福尔马林保存引起的伪影（例如，表现为神经毡改变的粗糙MRI低信号8）。
注：不同组织病理学亚型的皮层CMIs具有不同的磁共振特征。关于CMI亚型的更多细节，读者可参考一项近期的离体研究7。 - 在MR图像上识别出可能的皮层CMIs后，对感兴趣区域进行取样以进行组织病理学验证。确保切除包含解剖标志的区域，以便后续将MRI与组织病理学结果进行匹配。按照以下步骤进行标准组织病理学处理（但其他方法也可能适用）。
- 切除一块约30 × 20 × 5 mm3、包含可能皮层CMI的组织区域。
- 为实现精确取样，根据MR图像的层厚及组织结构估计病灶位置。手动在估计病灶位置略上方切割组织，以减少后续为定位病灶所需的连续切片数量（石蜡包埋后）。
- 确保所取组织能放入组织包埋盒中。将待切面朝下放置于包埋盒内。
- 将所有组织包埋盒保存于10%福尔马林中，直至组织处理。
- 对组织进行石蜡包埋处理。通常包括通过梯度酒精（例如，70%、95%至100%）逐步脱水，并用二甲苯透明化组织的自动化流程。
- 将组织包埋于石蜡块中。确保包埋后待切面朝上。
- 使用切片机连续切取4–6 µm厚的切片，直至获得目标病灶。
- 将切片漂浮于37 °C水浴表面，随后贴附于载玻片上。将载玻片置于加热板上，使组织牢固粘附于玻片。室温下过夜储存载玻片。
- 对首批切片进行适当染色（例如，H&E染色），保留相邻的未染色切片以备后续使用（例如，免疫组织化学染色）。
- 使用适量封片介质对H&E染色切片进行封片。轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。
- 在适当放大倍数下使用光学显微镜观察切片，并与先前获得的MR图像进行比对。
- 在获取的图像上识别可能的皮层脑微梗死（CMIs）或其他感兴趣的病灶。这些病灶即为组织学分析的目标。注意识别伪影，例如死后组织损伤（有时因脑组织切片时的切割导致表面出现）或长期福尔马林保存引起的伪影（例如，表现为神经毡改变的粗糙MRI低信号8）。
2. 评估大脑皮层微梗死 体内 7T MRI
- 在您关注的患者群体中，按照文献6所述的体内 MRI 方案（至少包含三维FLAIR序列），进行7T MRI扫描。
- 根据以下7T CMIs评分标准，在体内 7T MR图像上评估皮层脑微梗死（cortical CMIs）：CMIs在FLAIR序列上呈高信号（可伴有低信号中心），T2序列上呈高信号，T1序列上呈低信号，可在脑部至少两个视图（例如，矢状面和横断面）中检测到，局限于皮层，区别于血管周围间隙，最大径≤4 mm6,7。
- 使用包含三个图像查看器的界面，同时查看FLAIR、T1和T2图像，例如 MeVisLab（图3）。该平台支持整合多个查看器，并可在疑似病灶位置放置标记。
- 首先在矢状面FLAIR图像上评估一侧半球。全面筛查整个皮层是否存在高信号病灶。任何≤4 mm的高信号病灶均为可能的CMI。通过点击每个可能的CMI位置来放置标记。
- 对另一侧半球重复上述步骤。
- 在T1和T2图像上验证所有已标记的位置。若某位置在T1上不呈低信号或在T2上不呈高信号，则予以排除。
- 在FLAIR、T1和T2图像的横断面上进行评估。若某位置不可见，则予以排除。如有疑问，可检查冠状面图像。
- 注意识别MRI伪影和解剖变异（尤其是脑沟边缘）。
- 保存标记。
图 3. 用于评估皮层微梗死的示例图像浏览平台。该界面集成于 MeVisLab 软件中。该程序支持同时整合多个查看器，可在矢状位、横断位和冠状位之间轻松切换，并可在疑似病灶位置放置并保存标记（可为不同类型的病灶选择不同的标记）。
3. 评估大脑皮层微梗死 体内 3T MRI
- 获取您所关注的患者群体的 3T 磁共振图像。只要磁共振成像方案中至少包含 3D T1 加权像、FLAIR 和 T2 加权像，也可以使用现有数据。
- 根据以下 3T 评分标准，在 in vivo 3T 磁共振图像上评估皮层脑微出血（cortical CMI）：皮层 CMI 在 T1 加权像上呈低信号（与脑脊液信号等同），在脑部至少两个视图（如矢状面和横断面）上可识别，局限于皮层，区别于血管周围间隙，最大径 ≤4 mm。
- 在 FLAIR 和 T2 加权像上观察 T1 加权像上发现的皮层低信号病灶的位置。若该位置在 FLAIR 和 T2 加权像上呈高信号或等信号（与灰质信号一致），则将其评定为可能的皮层 CMI。若在同一位置 T2 加权像上也呈低信号，则排除该病灶，因其可能为出血性病灶、血管或伪影所致。如有疑问，可在 T2* 加权像上进一步核查该位置9。
- 使用与上述相同的界面。
- 首先在矢状面 T1 加权像上评估一侧半球。全面筛查整个皮层是否存在局灶性低信号病灶。任何最大径 ≤4 mm 的低信号病灶均为可能的 CMI。通过点击每个可能的 CMI 来放置标记。
- 对另一侧半球重复上述步骤。
- 评估横断面 T1 加权像，同时在横断面 FLAIR 和 T2 加权像上验证所有已标记的位置。若该位置在 FLAIR 和 T2 加权像上呈高信号或等信号，则视为可能的 CMI。若该位置疑似伪影或解剖变异，则予以排除。若该位置在 T2 加权像上呈低信号，也应排除。
- 注意 T1 加权像上类似 CMI 的伪影，尤其是出现在脑“边缘”区域的振铃伪影，这类伪影常在多个相邻脑回中出现；注意脑沟边缘区域；注意颞叶（尤其是颞极）的大血管。最后，建议排除靠近较大皮层梗死灶的组织中的可能皮层 CMI。
- 保存标记。
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结果
此处提供了一个在7T下采集的离体序列的高分辨率和高图像质量示例（图4）。该图像为三维T2*加权的离体扫描，各向同性分辨率为0.18 mm。组织样本来自一名84岁患有痴呆的女性，经病理证实患有阿尔茨海默病及严重的脑淀粉样血管病（CAA）。图像的细节清晰可辨，能够识别皮层微血管病变。T2*对铁沉积和空气均敏感。该组织样本的皮层内存在大量微血管病变。这些组织切片脑沟内的低信号影是气泡所致，可能干扰皮层微血管病变的评估。为识别皮层 cerebral microinfarcts（CMIs），需采用T2加权序列。
图5 代表在皮层发现的细胞介导免疫反应（cortical CMI） 离体 7T下的图像。这种皮层CMI在一位86岁女性的死后脑组织中被发现，该患者具有中等程度的阿尔茨海默病病理（Braak） & Braak IV期）...
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讨论
近年来，脑微梗死（CMIs）受到越来越多的关注。越来越多来自尸检研究的证据表明，CMIs是与年龄相关的认知功能下降和痴呆的重要因素4,5。目前，CMIs已可在7T以及3T磁共振成像（MRI）上被检测到。对这些病变评估方案的优化和标准化，将有助于在全球范围内的队列研究中快速实施可靠且有效的CMIs检测。这将使未来临床研究（包括横断面和纵向研究）能够在衰老、脑血管疾病和痴呆的背景下，广泛评估CMIs的临床相关性9,10。
本研究中描述的方法实际上是一种“元方法”，因为它可被视为一种用于开发（并逐步改进）活体检测脑微梗死（CMI）方法的流程，而此前CMI只能通过神经病理学家进行死后评估。通过新的磁共振成像（MRI）方案和图像处理技术来开发更优的活体CMI检测方法时，最关键的步骤是使用组织病理学进行验证，后者目前仍是金标准。与组织病理学相比，活体检测CMI的一个重要局限性在于分辨率。然而，尽管活体MRI无法检测到较小的CMI，但它能够实现全脑覆盖，这可能在整体效果上等同于仅通过少数几份组织切片寻找显微镜下的CMI。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
获得欧洲研究理事会（ERC）在欧洲联盟第七框架计划[FP7/2007-2013]下的资助[337333号]支持，开展了取得这些成果的研究。SvV和GJB的研究得到了荷兰健康研究与发展组织（ZonMw）VIDI项目[91711384号]的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全氟聚醚（Fomblin / Galden PFPE） | Solvay Solexis, Bollate, Italy | ||
| 7T 磁共振成像系统 | Philips Healthcare, Cleveland, OH, USA | ||
| 32 通道接收式头部线圈 | Nova Medical, Wilmington, MA, USA | ||
| MeVisLab 软件 | MeVis Medical Solutions AG, Bremen, Germany |
参考文献
- Vander Kolk, A. G., Hendrikse, J., Zwanenburg, J. J., Visser, F., Luijten, P. R. Clinical applications of 7 T MRI in the brain. Eur J Radiol. 82 (5), 708-718 (2013).
- Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurol. 9, 689-701 (2010).
- Gouw, A. A., et al. Heterogeneity of small vessel disease: a systematic review of MRI and histopathology correlations. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 82 (2), 126-135 (2011).
- Smith, E. E., Schneider, J. A., Wardlaw, J. M., Greenberg, S. M. Cerebral microinfarcts: the invisible lesions. Lancet Neurol. 11, 272-282 (2012).
- Brundel, M., de Bresser, J., van Dillen, J. J., Kappelle, L. J., Biessels, G. J. Cerebral microinfarcts: a systematic review of neuropathological studies. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (3), 425-436 (2012).
- Van Veluw, S. J., et al. In vivo detection of cerebral cortical microinfarcts with high-resolution 7T MRI. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 322-329 (2013).
- Van Veluw, S. J., et al. The spectrum of MR detectable cortical microinfarcts; a classification study with 7 tesla post-mortem MRI and histopathology. J Cereb Blood Floow Metab. Jan. 21, 10-1038 (2015).
- Van Duijn, S., et al. MRI artifacts in human brain tissue after prolonged formalin storage. Magn Reson Med. 65 (6), 1750-1758 (2011).
- Van Veluw, S. J., et al. Cortical microinfarcts on 3T MRI: clinical correlates in memory-clinic patients. Alzheimers Dement. 5, 10-1016 (2015).
- Van Dalen, J. W., et al. Cortical microinfarcts detected in vivo on 3 Tesla MRI: clinical and radiological correlates. Stroke. 46 (1), 255-257 (2015).
- Vander Kolk, A. G., et al. Imaging the intracranial atherosclerotic vessel wall using 7T MRI: initial comparison with histopathology. AJNR Am J Neuroradiol. 36 (4), 694-701 (2015).
- Visser, F., Zwanenburg, J. J., Hoogduin, J. M., Luijten, P. R. High-resolution magnetization-prepared 3D-FLAIR imaging at 7.0 Tesla. Magn Reson Med. 64 (1), 194-202 (2010).
- Brundel, M., et al. High prevalence of cerebral microbleeds at 7Tesla MRI in patients with early Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 31 (2), 259-263 (2012).
- Kuijf, H. J., et al. Detecting cortical cerebral microinfarcts in 7.0 T MR images. IEEE International Symposium on Biomedical Imaging. , 982-985 (2013).
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