线粒体在调节代谢和稳态中发挥核心作用。在线粒体代谢中可能影响生物体生理功能的细微变化，在整体生物体代谢组学研究中往往难以被检测到。本文介绍一种分离方法，可增强对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中细微代谢变化的检测能力。
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摘要
摘要
由于线粒体参与氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及脂肪酸氧化，线粒体功能缺陷常常严重影响患有这些复杂疾病的患者的生命。检测线粒体代谢变化对于理解线粒体疾病以及线粒体对药物干预的反应至关重要。尽管线粒体代谢处于代谢调控的核心地位，但在利用完整生物体或完整组织提取物进行分析时，细胞质代谢物的过度丰度可能会掩盖线粒体代谢的细微变化，从而阻碍对这些变化的检测。
在此，我们描述了一种分离方法，该方法检测到线粒体代谢发生了显著变化 果蝇 在完整果蝇样品与线粒体富集样品之间存在差异。为说明该方法的灵敏度，我们使用了一组 果蝇 携带遗传多样性线粒体DNA（mtDNA）的细胞经雷帕霉素处理后，我们利用该方法发现雷帕霉素以依赖于线粒体基因型的方式调控线粒体代谢。然而，在代谢组学研究中，当代谢物提取自线粒体富集组分时，这些变化表现得更为显著。相比之下，全组织提取物仅能检测到由雷帕霉素介导的代谢改变，且该改变与mtDNA无关。
引言
本实验的目的是制备富含线粒体的组分，以获得足量的线粒体代谢物用于代谢组学研究 黑腹果蝇在我们的经验中，使用全细胞提取方法进行代谢组学分析无法检测到线粒体代谢物的细微变化 果蝇然而，在代谢组学分析之前进行线粒体分级分离可提高检测线粒体代谢物变化的灵敏度。
线粒体是细胞器，负责为细胞正常功能提供所需90%的能量1。近年来人们认识到，线粒体在细胞和有机体功能中的作用远比仅生成三磷酸腺苷（ATP）更为动态，现已被视为调节代谢稳态的核心枢纽2,3。线粒体是内共生过程的产物，大约15亿年前不同的微生物谱系融合而形成4。随着线粒体进化为真正的细胞器，内共生体的基因被整合到逐渐形成的细胞核基因组中。目前在动物中，约有1500种线粒体蛋白由细胞核基因编码，而37个基因仍保留在线粒体DNA（mtDNA）中，其中13个基因编码氧化磷酸化酶复合物的亚基蛋白5。为维持线粒体正常功能，需要线粒体与细胞核之间进行协调。
利用此处所述方法，我们能够检测线粒体代谢的变化 果蝇 线粒体与细胞核基因组之间协调性被操控后所产生的结果。我们使用了一种菌株 果蝇 其姐妹物种的线粒体DNA D. simulans 置于单个 D. melanogaster 细胞核背景6. 将这种“紊乱的”线粒体-核基因型与“天然的”或共同进化的线粒体-核基因型进行比较 D. melanogaster 携带与其原生个体相同的细胞核基因组 D. melanogaster 线粒体DNA。该 D. melanogaster 和 D. simulans mtDNA 在约 100 个氨基酸上存在差异 >影响线粒体-细胞核通讯的500个同义突变7,8我们制备了完整果蝇提取物及线粒体富集提取物，以研究代谢物在药物应激下的变化情况。本文结果显示，在使用线粒体富集组分时，可检测到携带天然共进化基因型的样本中线粒体代谢物发生显著变化 D. melanogaster 线粒体DNA和携带断裂基因型 D. simulans 线粒体DNA。相比之下，使用常规的全果蝇提取物方法检测时，这两种基因型之间的代谢物变化较为细微。因此，该方法为理解线粒体DNA如何介导线粒体对不同药物的响应变化提供了途径。
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方案
1. 试剂与溶液
- 果蝇食物与培养基的制备
- 将果蝇食物成分（11% 蔗糖、2% 自溶酵母、5.2% 玉米粉、0.79% w/v 琼脂）加入水中，在设定为 90 °C 的加热板上加热。持续搅拌，直至形成均匀且略稠的混合物。最终配制 550 ml 果蝇食物，用于填充 100 个试剂瓶，每瓶含 5 ml 果蝇食物。
- 从热源移开，间歇搅拌，待食物冷却至 80 °C 后，加入溶解于 95% 乙醇中的 0.2% 对羟基苯甲酸甲酯（Tegosept）。
- 将食物均分为两份。向其中一份加入 1.1 ml 溶于乙醇的 50 mM 雷帕霉素，向另一份加入 1.1 ml 乙醇。将雷帕霉素和乙醇溶液充分搅拌混入食物中。注意：添加药物前，确保温度已降至 50 °C。
- 分离缓冲液
- 在水中配制 500 ml 分离缓冲液 [225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、10 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)、1 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)、2.5 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)]。
- 使用氢氧化钠调节 pH 至 7.2。初始 pH 呈酸性。
- 使用孔径为 0.22 µm 的无菌滤膜过滤瓶对溶液进行灭菌，并于 4 °C 保存。
- 洗涤缓冲液
- 在水中配制 500 ml 洗涤缓冲液 [225 mM 甘露醇、75 mM 蔗糖、10 mM KCl、10 mM Tris HCl、5 mM KH2PO4]。
- 使用氢氧化钠调节 pH 至 7.2。初始 pH 呈酸性。
- 使用孔径为 0.22 µm 的无菌滤膜过滤瓶对溶液进行灭菌，并于 4 °C 保存。
2. 饲养 果蝇 菌株
- 为控制幼虫发育期间的密度，将25对亲代果蝇放入一个培养瓶中，让其产卵48小时。
- 48小时后移除亲代果蝇，以调控卵的密度。
- 使用新羽化的F1子代重复步骤2.1和2.2，以实现连续两代的密度控制。
- 收集成虫时，使用二氧化碳（CO2）麻醉果蝇，并按性别分离。
- 使用单级调节器将高压气罐中的纯CO2以5 psi的恒定流速输出。为避免静电，使用塑料管将CO2导入装有水的500 ml抽滤瓶中进行催化。
- 用带一个孔的橡胶塞密封抽滤瓶，再用塑料管将抽滤瓶的侧口连接至CO2麻醉垫。
- 将果蝇置于麻醉垫中不超过10–15分钟。麻醉后需恢复24小时，再将其置于实验条件下。
- 为获得足量代谢物用于线粒体富集组分的提取，每样本使用300只果蝇。此处使用雌性果蝇，但其他实验中性别可能不同。将150只果蝇转移至自制的1 L种群培养笼中，提供装有5 ml果蝇食物的试管供其取食。
- 将剩余的150只果蝇转移至另一个1 L培养笼中。每个笼子中果蝇数量不得超过150只，避免过度拥挤。
- 每种实验条件设置六个重复样本。由于全动物提取物可获得更多的代谢物，为制备一份全动物提取样本，将50只雌性果蝇转移至一个培养笼中。对于线粒体分离样本，每种实验条件同样需设置六个重复样本。
- 将培养笼置于25 °C环境中，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。
- 每隔2至3天更换一次新鲜食物，每次在试管中提供5 ml食物，以维持食物质量。
- 将果蝇在食物上维持10天。此步骤适用于雷帕霉素处理7，其他处理或条件可能有所不同。
3. 线粒体组分的分离
- 将一个笼子中的果蝇（150只）倒入装有1 ml预冷分离缓冲液的玻璃-聚四氟乙烯Dounce匀浆器中。
- 上下移动研杵进行15次匀浆。将研钵置于冰上，以保持线粒体完整。
- 将匀浆液转移至1.5 ml离心管中，在4 °C下以300 × g离心5分钟。
- 取上清液，在4 °C下以6,000 × g离心10分钟，以富集线粒体。
- 由于上清液含有胞质组分，弃去上清液或用于其他实验。将沉淀重悬于300 µl洗涤缓冲液中。
- 对第二个笼子重复步骤3.1–3.5。将两个笼子的重悬沉淀合并至一个冷冻微量离心管中。
- 在4 °C下以6,000 × g离心10分钟。
- 弃去上清液，将沉淀在液氮中速冻。
- 将富集的线粒体组分储存于-80 °C或更低温度。
- alternatively，对于全动物样品制备，将成虫放入冷冻微量离心管中。将管子在液氮中速冻，并将成虫储存于-80 °C或更低温度。
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结果
根据上述方案，我们对线粒体富集组分和全动物提取物进行了代谢组学分析，以检测药物雷帕霉素对不同线粒体DNA的影响7。通过将药物溶解于果蝇食物中，以200 µM的浓度给予雷帕霉素，果蝇暴露于该药物处理持续10天。采用标准溶剂提取方法，结合气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）和液相色谱-串联质谱技术（LC/MS/MS），分别从全果蝇提取物和线粒体提取物中获取代谢物。
图1 显示膜转运蛋白孔蛋白（porin）的富集，作为线粒体组分中线粒体富集的指标。在胞质组分中未检测到孔蛋白。相反，微管蛋白（tubulin）在线粒体组分中未被检出，表明胞质蛋白污染极少。 图2 和 图3 显示来自“天然”样本的完整代谢物谱的主成分分析（PCA） D. melanogaster 菌株（OreR）以及携带...
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讨论
本方案中最关键的步骤包括：1）在充足空间内饲养足够数量的果蝇。每个种群培养笼中的果蝇数量不得超过150只，避免过度拥挤至关重要；2）频繁更换培养笼中的食物，以防止食物竞争和营养胁迫；3）所有样品均需在4 °C条件下保存，以确保线粒体组分分离过程中的完整性。建议在使用前将分离缓冲液、洗涤缓冲液以及玻璃-聚四氟乙烯研磨器预冷。为减少细胞质对富集线粒体组分的污染，可使用洗涤缓冲液对步骤3.5中获得的线粒体沉淀进行洗涤。
从富集的线粒体组分中提取代谢物需要大量的重复样本（每个实验条件6个重复）。总共需要使用24个笼子用于图1和图2。我们建议在同一天完成所有样本的提取，以降低实验变异性。尽管该方案可行，但仍需提前仔细规划并准备所需材料。需提前对试管进行标记，并制定计划以确保各样本间等待时间的一致性，从而保持样本质量并减少重复样本之间的差异。
提取线粒体通常使用的缓冲液含有糖类10,11；因此，特定糖代谢物的分析可能受到提取方法的影响。尽管我们在分析...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了阿德尔菲大学教师发展基金以及美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）授予EVC的R15GM113156基金、NIGMS授予DMR的R01GM067862基金和美国国家老龄化研究所（NIA）授予DMR的R01AG027849基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2% 对羟基苯甲酸甲酯 | VWR | AAA14289 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| 甘露醇 | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| 用于麻醉果蝇的 CO2 垫片 | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L 培养笼 | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L 培养笼盖 | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| 玻璃-聚四氟乙烯研磨器 | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 雷帕霉素 | LC Laboratories | R-5000 | |
| 抗孔蛋白抗体 | MitoSciences | MSA03 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 垫片 | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| 抽滤瓶 | enasco | SB08184M | |
| 橡胶塞 | enasco | S08512M |
参考文献
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重印与许可
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