蛋白质磷酸化是细胞解读和响应胞外环境信息的核心机制。本文介绍一种高通量筛选方案，利用从哺乳动物细胞中纯化的激酶，快速鉴定能够磷酸化特定底物（或底物群）的激酶。
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本文内容
摘要
摘要
我们开发了一种筛选平台，用于鉴定特异性作用于磷酸化底物的人源蛋白激酶，该平台可用于阐明新的信号转导通路。本方法采用包含纯化的GST标签人源蛋白激酶文库以及目标重组蛋白底物。我们已利用该技术鉴定出MAP/微管亲和力调节激酶2（MARK2）是CREB调节转录共激活因子2（CRTC2）上一个受葡萄糖调控位点的激酶，CRTC2是β细胞增殖所必需的蛋白；同时还鉴定出Axl家族酪氨酸激酶通过磷酸化衔接蛋白ELMO来调控细胞转移。本文描述了该技术，并讨论其如何帮助建立细胞响应环境刺激的全面图谱。
引言
蛋白质翻译后修饰（PTM）对于细胞内通讯至关重要。在所有已知的翻译后修饰中，研究最为深入的是由蛋白激酶催化的磷酸化修饰，该修饰可调控多种蛋白质功能，包括其生物化学活性、亚细胞定位、构象以及稳定性。靶蛋白上磷酸化位点的鉴定可通过胰蛋白酶磷酸肽图谱法，或目前标准的蛋白质组学技术实现，后者使用富集了磷酸化肽段的样品进行分析1,2。尽管预计四分之三的表达蛋白组可能发生磷酸化3，目前已鉴定的磷酸化位点达20万个5，甚至估计可达100万个6，但其中许多位点尚未明确其生物学功能、信号通路或对应的蛋白激酶。
尽管鉴定磷酸化位点相对直接，但更具挑战性的是鉴定靶向这些位点的对应激酶，这一过程我们称之为激酶：底物配对关系的映射。已有多种方法用于鉴定激酶：底物配对关系，这些方法要么从感兴趣的激酶出发寻找其底物，要么从感兴趣的底物出发，通过实验7-11或计算方法12寻找修饰该底物的激酶。为了鉴定已知磷酸化底物对应的激酶，可利用生物信息学方法识别包含磷酸化残基侧翼短保守氨基酸序列（即共有序列位点）的蛋白质，也可识别能与该底物形成可沉淀复合物的激酶。然而，这些方法耗时较长，且常常难以成功。
我们开发了一种系统的功能方法，以快速鉴定能够磷酸化特定底物的激酶 13该筛选实验具有优异的特异....
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方案
1. 试剂、培养板和细胞的准备
- 配制500 ml裂解缓冲液：25 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、50 mM NaF、0.5 mM EDTA（pH 8.0）、0.5% Triton X-100、5 mM β-甘油磷酸钠、5%甘油。4 °C保存。使用前立即加入1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和1 mM钒酸钠。此步骤后，任何洗涤缓冲液中均无需再添加PMSF。
- 配制20 ml 10×激酶缓冲液：200 mM Tris（pH 7.5）、50 mM β-甘油磷酸钠（分子量216）、2 mM钒酸钠。分装至1 ml离心管中，-20 °C保存。使用前立即加入5 mM DTT。
- 配制20 ml 10× M-ATP缓冲液：300 µM三磷酸腺苷（ATP）、66 mM MgCl2、33 mM MnCl2。分装至1 ml离心管中，-20 °C保存。
- 配制100 ml 2×十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液：1.5 g TRIS碱、20 ml甘油、30 ml H2O。溶解后用HCl调节pH至6.8。加入40 ml 10% SDS，定容至100 ml。加入25 mg溴酚蓝。
- 在96孔板中每孔点样4 µl浓度为25 ng/µl的编码GST-激酶的哺乳动物表达质粒14，每块板标记清楚。密封后于-20 °C冷冻保存，直至使....
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结果
筛选实验的代表性结果如图2所示。使用GST标签的肽段底物（对应CRTC2蛋白的268-283位氨基酸）以及经典的激酶检测底物髓鞘碱性蛋白（MBP），对180种激酶进行了筛选。仅有两种激酶——MARK2以及与其高度同源的MARK3——能够磷酸化CRTC2肽段。所有实验中均包含MBP作为内参对照，因其含有多个可磷酸化残基，且在凝胶中迁移至约18 kDa位置（靠近凝胶底部）。这有助于判断激酶的特异性：某些激酶可同时高效磷酸化目标底物和MBP。值得注意的是，仅含有GST蛋白的孔（即无激酶对照）总会纯化出一定内源性激酶活性，因此实验中始终存在一定背景磷酸化信号。尽管这并不排除底物磷酸化的真实性，但提示在体外实验条件下，激酶的底物选择性可能较低。为准确判断激酶与底物之间的特异性关系，建议同时使用多个分子量不同的底物进行对照分析。
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讨论
自最初描述该方法的文献发表以来14,15，最初的180种GST激酶文库已扩展至420种，约占人类蛋白激酶组的80%。借助扩展后的文库，本方案的实验周期为4至5天，随后根据需要再用1至4天进行膜显影；若采用磷屏成像和数字信号增强技术，可进一步缩短时间。在多个关键步骤中需格外注意（实验流程概览见图1）。第一步是确保细胞储备状态良好（无支原体污染、扩增过程中从未达到完全汇合状态，且每次传代均使用胰蛋白酶处理），无论是在批量扩增阶段，还是在转染时的96孔板中。细胞接种应均匀，转染时汇合度应达到约80%（步骤1.5）。
其次，在转染过程中最好使用自动液体分液器，以尽量减少体积转移误差，从而降低各孔之间的变异系数（“CVs”）。对于小体积操作，为分液器配备较小体积的加样卡匣可减少死体积导致的试剂损耗，并提高加样准确性。使用钒酸钠（一种广谱酪氨酸磷酸酶抑制剂）处理步骤作为通用刺激手段，以提高目标激酶的磷酸化水平。在此步骤中加入钙离子可增强细胞与基质的黏附，防止因长时间钒酸钠处理引起的细胞变圆而导致细胞脱落。该步骤应严格遵循10分钟的孵育时间.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由NSERC资助项目 386634支持。我们感谢Screaton实验室成员提供的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 裂解缓冲液 | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.1 | |
| 10x 激酶缓冲液 | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.2 | |
| 10x M-ATP | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.3 | |
| 人源激酶质粒 | Orfeome, Invitrogen, Origene | 实验室中进行 GST 标签修饰 | |
| 96 孔板 | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T 细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | 添加 100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 10% 胎牛血清。 |
| CO2 培养箱 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm 细胞培养皿 | Fisher Scientific | 877224 | |
| 低血清培养基 | Invitrogen | 22600-050 | |
| 脂质转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 自动液体分配仪 | Thermo Scientific | 5840300 | |
| 小型卡匣附件 | Thermo Scientific | 24073295 | |
| 标准卡匣附件 | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM 过钒酸盐 | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | 实验室自制 | ||
| 多通道移液器（20–200 μl） | Labnet | p4812-200 | |
| 多通道移液器（1–10 μl） | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V 型底 6 孔板 | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| 谷胱甘肽包被的 96 孔板 | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| 杂交炉 | Biostad | 350355 | |
| 带有 GST 标签的底物 | 实验室自制 | ||
| 髓鞘碱性蛋白（MBP） | Sigma | M1891 | |
| 重复移液器（1 ml） | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P γ-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS 裂解缓冲液（100 ml） | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.4 | |
| 26 孔预制 TGX 凝胶 | BioRad | 567-1045 | 所需凝胶浓度取决于目标底物的分子量 |
| 考马斯亮蓝染色液 | 实验室自制 | 0.1% 考马斯亮蓝 R250，10% 乙酸，40% 甲醇 | |
| 考马斯亮蓝脱色液 | 实验室自制 | 10% 乙酸，20% 甲醇 | |
| 标记的凝胶容器 | 实验室自制 | 使用空移液枪头盒上的塑料盖，大小刚好可容纳一块凝胶 | |
| Whatman 滤纸 | Fisher Scientific | 57144 | |
| 玻璃纸片（2 张） | BioRad | 165-0963 | |
| 凝胶干燥仪 | Labconco | 4330150 | |
| 双乳胶放射自显影胶片 | VWR | IB1651454 | |
| 胶片暗盒 | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| 增感屏 | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| 板封橡胶滚轮 | Sigma | R1275 |
参考文献
- Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19(2001).
- Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttrans....
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重印与许可
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