蛋白质磷酸化是细胞解读和响应胞外环境信息的核心机制。本文介绍一种高通量筛选方案，利用从哺乳动物细胞中纯化的激酶，快速鉴定能够磷酸化特定底物（或底物群）的激酶。
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本文内容
摘要
摘要
我们开发了一种筛选平台，用于鉴定特异性作用于磷酸化底物的人源蛋白激酶，该平台可用于阐明新的信号转导通路。本方法采用包含纯化的GST标签人源蛋白激酶文库以及目标重组蛋白底物。我们已利用该技术鉴定出MAP/微管亲和力调节激酶2（MARK2）是CREB调节转录共激活因子2（CRTC2）上一个受葡萄糖调控位点的激酶，CRTC2是β细胞增殖所必需的蛋白；同时还鉴定出Axl家族酪氨酸激酶通过磷酸化衔接蛋白ELMO来调控细胞转移。本文描述了该技术，并讨论其如何帮助建立细胞响应环境刺激的全面图谱。
引言
蛋白质翻译后修饰（PTM）对于细胞内通讯至关重要。在所有已知的翻译后修饰中，研究最为深入的是由蛋白激酶催化的磷酸化修饰，该修饰可调控多种蛋白质功能，包括其生物化学活性、亚细胞定位、构象以及稳定性。靶蛋白上磷酸化位点的鉴定可通过胰蛋白酶磷酸肽图谱法，或目前标准的蛋白质组学技术实现，后者使用富集了磷酸化肽段的样品进行分析1,2。尽管预计四分之三的表达蛋白组可能发生磷酸化3，目前已鉴定的磷酸化位点达20万个5，甚至估计可达100万个6，但其中许多位点尚未明确其生物学功能、信号通路或对应的蛋白激酶。
尽管鉴定磷酸化位点相对直接，但更具挑战性的是鉴定靶向这些位点的对应激酶，这一过程我们称之为激酶：底物配对关系的映射。已有多种方法用于鉴定激酶：底物配对关系，这些方法要么从感兴趣的激酶出发寻找其底物，要么从感兴趣的底物出发，通过实验7-11或计算方法12寻找修饰该底物的激酶。为了鉴定已知磷酸化底物对应的激酶，可利用生物信息学方法识别包含磷酸化残基侧翼短保守氨基酸序列（即共有序列位点）的蛋白质，也可识别能与该底物形成可沉淀复合物的激酶。然而，这些方法耗时较长，且常常难以成功。
我们开发了一种系统的功能方法，以快速鉴定能够磷酸化特定底物的激酶 13该筛选实验具有优异的特异性，能够清晰地筛选出潜在的对应激酶。鉴于磷酸化在生物信号传导中的核心作用，该筛选方法几乎适用于所有细胞信号通路中的新发现。 14-16该筛选涉及使用人蛋白激酶文库进行大规模激酶活性检测。这些激酶带有细菌谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签，并从哺乳动物细胞提取物中纯化获得，因此这些重组酶——与从细菌表达系统制备的重组酶不同——是在上游蛋白激酶存在的条件下生成的，而这些上游激酶通常对于重组酶获得活性至关重要。 体外确实，尽管酵母中存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸激酶活性，这些活性对于下游激酶的激活是必需的 10，酵母基因组编码122种蛋白激酶，表明哺乳动物激酶组包含500多个基因 17，为了调控高等生物特有的生命过程，其复杂性已显著增加。此外，细胞生物学和人类疾病相关不同刺激物（如小分子、生长因子、激素）的影响 等等。) 可用于 14,15在适当的情境下调节激酶活性。
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方案
1. 试剂、培养板和细胞的准备
- 配制500 ml裂解缓冲液：25 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、50 mM NaF、0.5 mM EDTA（pH 8.0）、0.5% Triton X-100、5 mM β-甘油磷酸钠、5%甘油。4 °C保存。使用前立即加入1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和1 mM钒酸钠。此步骤后，任何洗涤缓冲液中均无需再添加PMSF。
- 配制20 ml 10×激酶缓冲液：200 mM Tris（pH 7.5）、50 mM β-甘油磷酸钠（分子量216）、2 mM钒酸钠。分装至1 ml离心管中，-20 °C保存。使用前立即加入5 mM DTT。
- 配制20 ml 10× M-ATP缓冲液：300 µM三磷酸腺苷（ATP）、66 mM MgCl2、33 mM MnCl2。分装至1 ml离心管中，-20 °C保存。
- 配制100 ml 2×十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液：1.5 g TRIS碱、20 ml甘油、30 ml H2O。溶解后用HCl调节pH至6.8。加入40 ml 10% SDS，定容至100 ml。加入25 mg溴酚蓝。
- 在96孔板中每孔点样4 µl浓度为25 ng/µl的编码GST-激酶的哺乳动物表达质粒14，每块板标记清楚。密封后于-20 °C冷冻保存，直至使用。
- 转染前1-2天，在含10%胎牛血清（FBS）和抗生素的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞，置于37 °C、含CO2（终浓度5%）的培养箱中。用胰酶传代，扩增过程中避免细胞融合度超过>80%。筛选实验至少需要6 × 107个细胞（约相当于3个15 cm培养皿中80%融合度的HEK293T细胞）。
2. 转染
注意：整个实验方案的流程图见图1。
- 若含有激酶质粒的培养板已被冷冻，请在室温下解冻，并以 1,900 × g 离心 3 分钟，使孔底部的冷凝液聚集到底部。
- 将 8.6 ml 的低血清培养基（例如，OPTI-MEM）与 312.7 µl 脂质转染试剂混合。静置 5 分钟。
- 使用配备小体积卡匣的自动液体分配器，向每孔加入 10 µl 低血清培养基。
- 使用配备小体积卡匣的自动液体分配器，向每孔加入 10 µl 步骤 2.2 中的低血清培养基/转染试剂混合液。静置 20 至 45 分钟。
- 将 293T 细胞以 7.5 × 105 个细胞/ml 的浓度重悬于 80 ml 完全 DMEM 培养基中。使用配备标准体积卡匣的自动液体分配器，每孔加入 100 µl 细胞悬液（即 7.5 × 104 个细胞）。
- 在显微镜下检查各孔细胞分布是否均匀，并将培养板放回培养箱中孵育 24 小时。
3. GST-激酶下拉实验
- 现配：将60 µl的0.2 M钒酸钠与540 µl的H2O混合，制备4 mM过钒酸盐溶液。在另一管中，将2.7 µl的30%过氧化氢与1.4 ml PBS混合。将两种溶液混合后，室温静置15分钟后再使用。
- 使用多通道移液器（请勿使用自动液体分配器，因其会在孔中产生过多湍流）向每孔加入2 µl的0.25 M CaCl2，随后加入2.5 µl步骤3.1中制备的过钒酸盐溶液。将每块板在37 °C孵育10分钟，然后置于冰上。
- 按照第1节（试剂制备）中的说明，加入DTT、PMSF和钒酸钠，制备35 ml裂解缓冲液。
- 保持板在冰上，使用真空抽吸装置从每孔中移除培养基。立即使用配备标准卡匣的自动液体分配器向每孔加入50 µl预冷的裂解缓冲液。在冰上静置30分钟以完成裂解（可选：如需暂停，可密封板并储存于-80 °C；继续实验时，在冰上解冻）。
- 在4 °C下以1,900 × g离心3分钟。
- 使用多通道移液器刮下每孔中的细胞，并将全部内容物转移至相应标记的V型底96孔板中。在4 °C下以1,900 × g离心10分钟。
- 在离心过程中，向谷胱甘肽包被的板（每块96孔板对应一块）中每孔加入100 µl预冷的裂解缓冲液（不含PMSF）进行冲洗。保持板在冰上。
- 将V型底板从离心机中取出。逐块将谷胱甘肽板倒置在水槽上方，轻轻摇晃以去除裂解缓冲液，并在纸巾上轻拍吸干。通过倾斜V型底板，使用多通道移液器将裂解液转移至谷胱甘肽板中，注意不要扰动底部的沉淀。盖上板盖，置于冰上至少2小时以完成结合。
- 在2小时结合步骤接近结束时，准备放射性工作站，确保已采取必要的放射性操作安全防护措施。将杂交炉温度设定为30 °C。
- 按照第1节中的说明，加入DTT和钒酸钠，制备200 ml裂解缓冲液。此阶段无需添加PMSF。
- 将谷胱甘肽板倒置在水槽上方，摇晃去除裂解缓冲液，并在纸巾上轻拍吸干。用100 µl裂解缓冲液（不含PMSF）清洗各孔3次。切勿让孔干燥——应保持在冲洗液中直至下一步操作。
- 按照第1节中的说明，通过稀释10倍储存液并加入DTT，制备55 ml 1×激酶缓冲液（KB）。使用配备标准体积卡匣的自动液体分配器，用50 µl 1× KB清洗板一次。将1× KB保留在孔中，直至溶液A准备就绪：
- 通过加入500至530 µg目标底物、500 µg髓鞘碱性蛋白（MBP）、2.65 ml 10× KB、13.25 µl 1 M DTT，并加H2O至总体积15.9 ml，制备溶液A。
- 逐块将板倒置在水槽上方，去除1× KB冲洗液，在纸巾上轻拍吸干，立即使用配备小体积卡匣的自动液体分配器向每孔加入30 µl溶液A。保持板在冰上。
- 在放射性工作区中，通过加入2.5 ml 10× M-ATP、500 µCi γ-32P ATP，并加H2O至10 ml，制备溶液B。
- 使用重复移液器每孔加入20 µl溶液B（其喷出力有助于混合）。盖上板盖，在30 °C杂交炉中孵育30分钟。
- 30分钟后，将板移回冰上。使用多通道移液器向每孔加入50 µl 2× SDS裂解缓冲液。此时可继续下一步操作，或用铝箔密封板后于-20 °C保存至方便时再处理。
4. 凝胶的电泳、染色与干燥
注意：所有操作均应在指定的放射性工作区域进行。
- 打开杂交炉并设置温度为 85 °C。将样品板在室温下解冻。待炉温达到设定值后，将样品板转移至炉中，孵育 10 分钟以使样品变性。
- 使用多通道移液器将每个反应的 15 µl 产物同时加入 26 孔预制胶中，以填充多个孔。加样前必须确保所有吸头与对应的加样孔对齐。在 150 V 条件下电泳运行凝胶。切勿让示踪染料（蓝色条带）跑出凝胶底部，因为其中含有未掺入的 ATP。
- 拆卸凝胶后，用手术刀或直边工具切去含有未掺入 ATP 的部分（蓝色条带），以避免过度曝光胶片。将凝胶放入标记好的容器中，加入考马斯亮蓝染色液，染色 15 分钟。
- 移除考马斯亮蓝染色液，用清水短暂漂洗凝胶，然后加入脱色液。脱色至蛋白质条带清晰可见为止。每个样品应可见 MBP 条带和底物条带。
- 凝胶干燥步骤如下：
- 裁剪一张较大的滤纸，平铺于干燥器上。
- 将一张玻璃纸用蒸馏水润湿至平滑无皱，覆盖在滤纸上。
- 将凝胶置于玻璃纸上，并记录凝胶的排列顺序。用第二张润湿的玻璃纸覆盖在凝胶上方。
- 用滚轮（如封板器滚轮）滚压排出所有气泡，以获得均匀平整的表面。合上盖板，开启真空，于 80 °C 干燥 3 小时。
- 凝胶干燥后，将其置于增感屏上，用 XAR 胶片进行曝光。用保鲜膜或塑料袋包裹暗盒，并用胶带密封，以防霜冻。将暗盒于 -80 °C 保存过夜。
5. 制备XAR薄膜
- 次日，将盒式装置从冷冻箱中取出，在室温下解冻。根据制造商说明书，在暗室中使用胶片处理器显影胶片。
注意：检查胶片上是否存在激酶-底物配对的证据。进行第二次较长时间的曝光也有助于检测较弱的磷酸化事件。
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结果
筛选实验的代表性结果如图2所示。使用GST标签的肽段底物（对应CRTC2蛋白的268-283位氨基酸）以及经典的激酶检测底物髓鞘碱性蛋白（MBP），对180种激酶进行了筛选。仅有两种激酶——MARK2以及与其高度同源的MARK3——能够磷酸化CRTC2肽段。所有实验中均包含MBP作为内参对照，因其含有多个可磷酸化残基，且在凝胶中迁移至约18 kDa位置（靠近凝胶底部）。这有助于判断激酶的特异性：某些激酶可同时高效磷酸化目标底物和MBP。值得注意的是，仅含有GST蛋白的孔（即无激酶对照）总会纯化出一定内源性激酶活性，因此实验中始终存在一定背景磷酸化信号。尽管这并不排除底物磷酸化的真实性，但提示在体外实验条件下，激酶的底物选择性可能较低。为准确判断激酶与底物之间的特异性关系，建议同时使用多个分子量不同的底物进行对照分析。
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讨论
自最初描述该方法的文献发表以来14,15，最初的180种GST激酶文库已扩展至420种，约占人类蛋白激酶组的80%。借助扩展后的文库，本方案的实验周期为4至5天，随后根据需要再用1至4天进行膜显影；若采用磷屏成像和数字信号增强技术，可进一步缩短时间。在多个关键步骤中需格外注意（实验流程概览见图1）。第一步是确保细胞储备状态良好（无支原体污染、扩增过程中从未达到完全汇合状态，且每次传代均使用胰蛋白酶处理），无论是在批量扩增阶段，还是在转染时的96孔板中。细胞接种应均匀，转染时汇合度应达到约80%（步骤1.5）。
其次，在转染过程中最好使用自动液体分液器，以尽量减少体积转移误差，从而降低各孔之间的变异系数（“CVs”）。对于小体积操作，为分液器配备较小体积的加样卡匣可减少死体积导致的试剂损耗，并提高加样准确性。使用钒酸钠（一种广谱酪氨酸磷酸酶抑制剂）处理步骤作为通用刺激手段，以提高目标激酶的磷酸化水平。在此步骤中加入钙离子可增强细胞与基质的黏附，防止因长时间钒酸钠处理引起的细胞变圆而导致细胞脱落。该步骤应严格遵循10分钟的孵育时间...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由NSERC资助项目 386634支持。我们感谢Screaton实验室成员提供的有益讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 裂解缓冲液 | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.1 | |
| 10x 激酶缓冲液 | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.2 | |
| 10x M-ATP | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.3 | |
| 人源激酶质粒 | Orfeome, Invitrogen, Origene | 实验室中进行 GST 标签修饰 | |
| 96 孔板 | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T 细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | 添加 100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 10% 胎牛血清。 |
| CO2 培养箱 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm 细胞培养皿 | Fisher Scientific | 877224 | |
| 低血清培养基 | Invitrogen | 22600-050 | |
| 脂质转染试剂 | Invitrogen | 11668-019 | |
| 自动液体分配仪 | Thermo Scientific | 5840300 | |
| 小型卡匣附件 | Thermo Scientific | 24073295 | |
| 标准卡匣附件 | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4 mM 过钒酸盐 | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | 实验室自制 | ||
| 多通道移液器（20–200 μl） | Labnet | p4812-200 | |
| 多通道移液器（1–10 μl） | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V 型底 6 孔板 | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| 谷胱甘肽包被的 96 孔板 | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| 杂交炉 | Biostad | 350355 | |
| 带有 GST 标签的底物 | 实验室自制 | ||
| 髓鞘碱性蛋白（MBP） | Sigma | M1891 | |
| 重复移液器（1 ml） | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P γ-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2x SDS 裂解缓冲液（100 ml） | 实验室自制 | 参见实验方案步骤 1.4 | |
| 26 孔预制 TGX 凝胶 | BioRad | 567-1045 | 所需凝胶浓度取决于目标底物的分子量 |
| 考马斯亮蓝染色液 | 实验室自制 | 0.1% 考马斯亮蓝 R250，10% 乙酸，40% 甲醇 | |
| 考马斯亮蓝脱色液 | 实验室自制 | 10% 乙酸，20% 甲醇 | |
| 标记的凝胶容器 | 实验室自制 | 使用空移液枪头盒上的塑料盖，大小刚好可容纳一块凝胶 | |
| Whatman 滤纸 | Fisher Scientific | 57144 | |
| 玻璃纸片（2 张） | BioRad | 165-0963 | |
| 凝胶干燥仪 | Labconco | 4330150 | |
| 双乳胶放射自显影胶片 | VWR | IB1651454 | |
| 胶片暗盒 | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| 增感屏 | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| 板封橡胶滚轮 | Sigma | R1275 |
参考文献
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