激酶底物对鉴定使用高通量筛选

Summary

蛋白质磷酸化是细胞如何解释和响应其细胞外环境中信息的核心特征。在这里，我们提出了一种高通量筛选方案，使用从哺乳动物细胞中纯化的激酶来快速识别磷酸化目标底物的激酶。

Abstract

我们已经开发出一种筛选平台，以确定专用人蛋白激酶磷酸化的底物，可用于阐明新的信号转导途径。我们的方法的特征是使用纯化的GST标记的人蛋白激酶的文库和感兴趣的重组蛋白衬底。我们已经用这种技术来识别的MAP /微管亲合性 - 调节激酶2（MARK2）作为激酶的葡萄糖调节站点上CREB稳压转录辅激活2（CRTC2），所需的β细胞增殖的蛋白质，以及AXL家族酪氨酸激酶的作为细胞转移的磷酸化的衔接蛋白ELMO的调节剂。我们描述这种技术，并讨论如何帮助建立细胞对环境刺激如何应对一个全面的地图。

Introduction

蛋白质的翻译后修饰（翻译后修饰）是细胞内的通信是必不可少的。也许最好的研究了所有翻译后修饰是磷酸化，由蛋白激酶，从而调节的蛋白质的功能，包括它们的生化活性，亚细胞定位，构象和稳定性无数催化。关于靶蛋白磷酸化位点的鉴定可以通过胰蛋白酶磷酸肽映射或通过使用富含磷酸化肽^1,2-样品现在标准蛋白质组技术来完成。而四分之三的表达蛋白质组预计被磷酸和³所识别200000磷酸化位点^5，据估计高达1 ^亿 6，许多这些没有分配的生物学，信号传导途径，或蛋白激酶。

虽然识别磷酸化位点是相对简单的，相对更大的挑战是，鉴定同源激酶（s）表示，针对这些网站，我们称为映射激酶的方法:基片对。几种方法用于鉴定激酶:基板对已经描述，无论是在开始用感兴趣的激酶和寻找其底物或开始与感兴趣的基板，并试图找到改性激酶实验^7-11或计算^12。为了鉴定激酶为已知的磷酸化底物，生物信息学可以用来识别包含氨基酸侧翼磷酸化残基（共识位点），以及识别形成沉淀络合物与基板激酶短保守序列的蛋白质。然而，这些方法是耗时，经常不与成功。

我们开发了一个系统功能的方法来迅速查明激酶磷酸化可以在给定基片^13。屏幕试验产生优良的比性，具有非常明确的选择潜在的同源激酶。鉴于磷酸化生物信号的中心地位，画面中几乎所有的细胞信号通路^14-16用于发现有用的。屏幕包括与人蛋白激酶的文库进行大规模激酶测定。所述激酶已被标记为细菌谷胱甘肽-S-转移酶（GST）蛋白和从哺乳动物细胞提取物纯化的，这意味着该重组酶 - 不同于那些来自细菌制备 - 将在上游蛋白激酶经常所需的存在而产生重组酶具有体外活性。实际上，虽然所需的下游激酶活化丝氨酸，苏氨酸，和酪氨酸激酶活性是存在于酵母^10中，酵母基因组编码122蛋白激酶，指示所述哺乳动物激酶组，有超过500个基因^17，已成为显著更加复杂，以边条忒独特高阶生物体的过程。此外，相关的细胞生物学和人类疾病（如小分子，生长因子，激素， 等等）不同的刺激的效果可以用来^14,15调节激酶活性在一个适当的范围内。

Protocol

1.准备试剂，板，和细胞

1. 制成500 ml的裂解缓冲液:25毫摩尔Tris pH值7.5，150mM的氯化钠，50mM的氟化钠，0.5mM EDTA的pH为8.0，0.5％的TritonX-100，5mM的β-内甘油，5％甘油。保存在4℃。使用，添加1mM的二硫苏糖醇（DTT），1mM的苯甲基磺酰氟（PMSF），和1mM钒酸钠之前立即。在该步骤之后，PMSF中不需要任何漂洗缓冲液中。
2. 使将20ml 10×激酶缓冲液:200毫摩尔Tris pH为7.5，50mM的β-内甘油（FW 216），2mM的钒酸钠。分装在1ml试管并储存在-20℃。使用，加上5 mm DTT前夕。
3. 使20ml中10倍的M-ATP的缓冲液:300μM三磷酸腺苷（ATP）的66mM的MgCl _2，33毫摩尔的MnCl _2，分装在1ml试管并储存在-20℃。
4. 使100个毫升2×十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液:1.5克的TRIS碱，将20ml甘油，加入30ml _的 H 2 O.溶解并调整pH至6.8，用HCl。添加40毫升10％SDS中，音量调节至100毫升。加入25毫克的溴酚蓝。
5. 现货4微升25毫微克/微升哺乳动物表达质粒套96孔板和标签板相应的编码每一个GST激酶^14家 。密封和冷冻板在-20℃下直到使用。
6. 1-2天前，转染，培养HEK293T细胞中完整的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）+ 10％胎牛血清（FBS）和抗生素在37℃培养箱中补充有_二氧化碳 （最终5％）。通道与胰蛋白酶和不允许的股票成为> 80％汇合膨胀的过程中。至少^6×10 7个细胞的所需屏幕（约3×15厘米，在80％汇合HEK293T细胞的碗碟）。

2.转染

注: 图 1所示为整个协议的流程图。

1. 如果包含激酶质粒板已被冻结，在室温下解冻一次离心在1900×g离心3分钟以收集任何湿气在孔的底部。
2. 拌8.6 ml的低血清培养基（例如，OPTI-MEM）与312.7微升基于脂质的转染试剂的。让我们坐5分钟。
3. 加10微升减少血清的培养基，每孔使用自动化液体分配器装配有小体积盒。
4. 添加每降低血清培养基/转染试剂混合物从步骤2.2的井10微升用自动液体分配器装配有小体积盒。让我们坐20〜45分钟。
5. 重悬293T细胞在在80ml完全DMEM的^7.5×10 5个细胞/ ml。加入100微升细胞悬浮液（即^7.5×10 4个细胞）的每使用自动化液体分配器装有标准量盒式良好。
6. 检查井显微镜均匀细胞分布下并返回到培养箱24小时。

3. GST激酶下拉

1. 让˚FRESH:4mM的通过混合60微升的0.2M钒酸钠与540微升_H 2 O过钒酸盐溶液在第二管混合2.7微升过氧化氢的30％和1.4毫升的PBS。添加两种方法结合，让坐在使用前15分钟。
2. 使用多道移液器（因为它在井产生太多的湍流不使用自动化液体分配器）分配2微升0.25M的_氯化钙 2在各孔中，接着2.5微升在步骤3.1中制备的过钒酸盐的。孵育各板在37℃下进行10分钟，然后放置在冰上。
3. 通过添加DTT，PMSF，和钒酸钠如第1（试剂的配制）所示制备的35ml裂解缓冲液。
4. 保持板置于冰上，利用真空抽吸每孔删除网上平台。立即用自动液体分配器装有标准盒式添加50μl/孔的冰冷的裂解缓冲液。让我们坐30分钟，在冰上裂解（可选:可以在这里如果有必要通过密封高原停止e和储存在-80℃。要继续，解冻板冰）。
5. 旋板在1900×g离心3分钟，在4℃。
6. 使用多道移液器向各孔刮去细胞和转移所有内容以适当标记的V型底96孔板中。旋板在1900 xg离心在4℃下10分钟。
7. 期间的旋转，填充谷胱甘肽包被的板（每个96孔板）用100μl/孔的冰冷裂解缓冲液（无PMSF），为漂洗。置于冰上板。
8. 从离心机中取出V形底平板。一次一个，反转谷胱甘肽板在水槽上方，以摇出的纸巾裂解液和印迹。通过倾斜板，并使用多道移液器，小心不要在底部打扰颗粒移植自V-底板的谷胱甘肽板裂解液。盖板和置于冰上至少2小时进行绑定。
9. 接近2小时的结合步骤的结束时，准备一个放射性工作站，确保吨他必要的安全防范措施到位放射性工作。设置杂交炉至30℃。
10. 如在第1节PMSF表明不需要在该阶段制得200毫升裂解缓冲液加入DTT和钒酸钠。
11. 反转的谷胱甘肽板在水槽上方，以摇出裂解液涂抹在纸巾上。冲洗孔3倍用100μl裂解缓冲液（无PMSF）。不要让井坐干 - 让他们在漂洗，直到准备进行。
12. 通过稀释10倍的库存和添加DTT作为用自动液体分配器装有标准体积盒在第1指示的冲洗板一次用50μl的1×KB的制备55毫升1×激酶缓冲液（KB）。留1个KB的井，直到溶液中的准备:
    1. 通过添加500至530微克的兴趣将基片，500微克的髓鞘碱性蛋白（MBP），2.65毫升10×KB，13.25微升的1M DTT和_H 2 O的高达15.9 ml的制备溶液A。
13. 一次一个，翻转板在水槽上方，除去1个KB冲洗，涂抹在纸巾上，并立即使用自动液体分配器配有体积小纸盒加30微升溶液A。置于冰上板。
14. 制备溶液B在放射性工作区域通过加入2.5 ml的10倍的M-ATP，500微居里的^{γ-32 p} ATP和_H 2 O的至10ml。
    1. 加入20微升溶液B每使用中继器吸管，它有助于混合，由于喷射力很好。盖上盖子进行培养在30℃杂交炉30分钟。
15. 30分钟后，回转板，以冰。加入50微升2×SDS裂解缓冲液，使用多道移液器每个孔中。可以进行在这个点到下一个步骤，或密封用铝箔和存储所述板在-20℃直至方便。

4.运行，染色，干燥凝胶

注:所有工作都应该在一个地区DESIGNA进行泰德放射性。

1. 打开杂交炉和设定为85℃。解冻板在室温下。一旦烘箱达到温度​​，传热板到烤箱并孵育10分钟以变性样品。
2. 负载26孔预制胶与15微升使用多道移液器每一个反应，以填补多口井一次。必须注意，所有的技巧配合以及相对应先加样品。运行凝胶在150五，不要让示踪染料（蓝线）跑出凝胶的底部，因为这包含了未结合的ATP。
3. 拆除凝胶和切断使用手术刀或直边，因为它会曝光过度，影片的未结合的ATP（蓝线）。将凝胶在标签的容器和盖用考马斯染色15分钟。
4. 取出考马斯染色，简单地用清水冲洗凝胶，并添加脱色的解决方案。脱色的凝胶直至蛋白质都清晰可见。 A波段的MBP和基材带应对于每个样品可见。
5. 以干燥的凝胶:
   1. 切滤波器一张大纸，并把它放在烘干机。
   2. 湿蒸馏水玻璃纸片，直到它是光滑，无皱，并将其放置在纸张的顶端。
   3. 躺在玻璃纸片材的顶部的凝胶，使得记凝胶的量级。湿的第二玻璃纸片和放在凝胶的顶部。
   4. 铺开所有的泡沫（一板的密封辊可以很好地用于本）的一个很好的均匀的表面。关闭挡板，打开真空，并在80℃干燥该凝胶3小时。
6. 一旦凝胶干燥，用丝网加紧信号，将其暴露在XAR胶片。用保鲜保鲜膜或塑料袋磁带，并用胶带密封，保持了霜冻。存储盒在-80℃下过夜。

5.制定XAR电影

1. 翌日，从冷冻库取出暗盒，并让在室温下解冻。发展中的膜使用薄膜处理器根据制造商的说明暗室。
   注意:检查薄膜激酶底物对的证据。阿秒更长的曝光也可以是有用的检测更弱的磷酸化事件。

Results

来自屏幕代表性的结果示于图2。180激酶使用来自CRTC2以及经典激酶测定衬底髓鞘碱性蛋白（MBP）相应于氨基酸268-283一个GST-标记的肽底物进行筛选。只有两个激酶MARK2和高度相关激酶磷酸化MARK3的CRTC2肽。 MBP被包括在所有测定中的内部对照，因为它包含了许多可磷酸化的残基，并运行在18 kDa的，朝向所述凝胶的底部。这允许特异性的解释:有些激酶将有力磷酸化底物和MBP。这里注意到的是，包含单独的GST（即无激酶对照）的孔中总是净化一些内源性激酶的活性，因此总是有在测定背景磷酸化。虽然这并不排除该衬底的磷酸化是真实的，但它表明，在体外设置激酶可以是低选择性。它特别信息，包括不同兆瓦得出关于激酶底物特异性结论的多个基板。

图1.流程图显示在协议的...

Discussion

由于原来的出版物描述的方法^14,15，180 GST-激酶原库已扩大到420件，或约80％的人类蛋白质激酶组的。与膨胀的文库，如所描述的协议需要4-5天，然后1-4天来开发薄膜（认为必要），这可以通过使用磷光和数字信号增强的缩短。有些情况必须注意几个关键步骤（ 见图 1协议的概述）。第一，是细胞的股票的健康（无支原体，决不允许在膨胀过程中达到汇合，并用胰蛋白酶在每次传代处理）在批量扩张阶段，并在96孔板在转染时。细胞应是均匀地加入晶种，80％铺满时转染发生（步骤1.5）。

其次，它是转染期间理想使用自动化的液体分配器，以尽量减少体积TRANSF呃错误，因而限制了变化的井之间系数（"CVS"）。对于小体积，配合以较小的体积限制磁带丢失试剂分配器由于减少了死体积并提高分配的准确性。的处理步骤与钠过钒酸盐，泛酪氨酸磷酸酶抑制剂，被用作普通的刺激，以增加靶激酶的磷酸化状态。钙在该步骤中纳入提高细胞基质粘附性，防止细胞损失由于四舍五入引起因长时间过钒酸盐处理。这一步应该严格遵守孵育10分钟的时间内完成。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
裂解缓冲液	制造		参见方案步骤 1.1
10x 激酶缓冲液	制造		参见方案步骤 1.2
10x M-ATP	内部		参见方案步骤 1.3
人激酶质粒	Orfeome、Invitrogen、Origene		GST 标签
96 孔板	Fisher Scientific	CS003595
293T细胞	ATCC	CRL-11268
DMEM	Fisher Scientific	SH3002201	补充剂含100 U/ml 青霉素，100 μg/ml 链霉素，10% 胎牛血清。
CO2 培养箱	Sanyo	MCO-17AIC
15 cm 细胞培养皿	Fisher Scientific	877224
还原血清培养基	Invitrogen	22600-050
基于脂质的转染试剂	Invitrogen	11668-019
自动液体分配器	Thermo Scientific	5840300
小盒附件	Thermo Scientific	24073295
标准盒附件	Thermo Scientific	14072670
4 mM 高钒酸盐	制造		参见方案步骤 3.1
0.25 M CaCl2	自制
多通道移液器（20-200 μl）	Labnet	p4812-200
多通道移液器 （1-10 μl）	Thermo Scientific	4661040
V 型底 6 孔板	Evergreen Scientific	290-8116-01V
谷胱甘肽包被的 96 孔板	Fisher Scientific	PI-15240
杂交炉	Biostad	350355
GST 标签底物
髓鞘碱性蛋白 （MBP）	Sigma	M1891
连续移液管 （1 ml）	Eppendorf	22266209
32P γ-ATP	Perkin Elmer	BLU502Z500UC
2x SDS 裂解缓冲液 （100 ml）	内部		参见方案步骤 1.4
26 孔预制 TGX 凝胶	BioRad	567-1045	所需的凝胶百分比取决于目标底物的分子量
考马斯染色	内部		0.1% 考马斯 R250、10% 乙酸、40% 甲醇
考马斯脱色	内部		10% 乙酸、20% 甲醇
贴有标签的凝胶容器	内部		使用空吸头盒的塑料盖，刚好足够容纳一个凝胶
Whatman 滤纸	Fisher Scientific	57144
玻璃纸 （2）	BioRad	165-0963
凝胶干燥器	Labconco	4330150
剂放射自显影胶片	VWR	IB1651454
胶片盒	Fisher Scientific	FBAC-1417
增压屏	Fisher Scientific	FBIS-1417
印版密封胶辊	Sigma	R1275