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测量TCR-pMHC结合 原位 使用基于FRET的显微镜检测法

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DOI：

10.3791/53157

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2015年10月30日

 ,  , 
1Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

本文内容

摘要

本文描述了如何开展基于（单分子）荧光共振能量转移（FRET）的检测方法，用于测量T细胞抗原受体（TCR）与负载抗原肽的主要组织相容性复合物（MHC）分子之间的结合动力学过程，该过程发生在T细胞与功能化的平面支撑脂双层接触时所形成的免疫突触内。

摘要

T细胞在识别抗原呈递细胞（APC）表面主要组织相容性复合物（MHC）分子中嵌入的肽段抗原（pMHC）时，表现出极高的特异性和有效性。尽管如此，在体外（in vitro）测量时，T细胞抗原受体（TCR）与抗原结合的亲和力通常仅为中等水平（µM级）1。鉴于影响T细胞抗原敏感性的分子与细胞参数，已开发出一种基于显微镜的方法，用于原位（in situ）监测TCR与pMHC的结合，即在活T细胞与模拟抗原呈递细胞（APC）细胞膜的人工功能性玻璃支撑平面脂双层（SLB）之间形成的免疫突触内发生的结合过程2。该方法基于连接在TCR和pMHC上的蓝移和红移荧光染料之间的荧光共振能量转移（FRET）。由于FRET效率与染料间距离的六次方成反比，因此可利用FRET信号来可视化突触内TCR-pMHC的结合情况。该显微镜技术的高灵敏度支持单分子FRET事件的检测，从而能够测定突触内TCR-pMHC相互作用的亲和力和解离速率，并进一步推算出结合的结合速率。类似的方法也可用于在天然环境中测量其他受体-配体相互作用。

引言

要更深入地理解T细胞如何识别抗原，必须观察正确的位置，即T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间形成的免疫突触。在此处，分子结合动力学不仅取决于相互作用分子固有的生化特性，还在很大程度上受到细胞参数的影响，包括细胞受力、膜结构、膜蛋白之间的侧向相互作用以及免疫突触特有的几何约束3。生化方法的解析能力有限，因其至少需要破坏参与突触的一个膜结构。因此，研究人员开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的成像方法，用于监测T细胞受体（TCR）与抗原性肽段-MHC复合物（pMHC）的结合2。在该方法中，T细胞被修饰上一种重组的、位点特异性标记的TCRβ反应性单链抗体片段（scFV），并与平面玻璃支撑的脂双层（SLB）相互作用；该脂双层含有负载了荧光标记抗原肽的MHC II类分子、共刺激分子以及黏附蛋白。染料标记的TCR与染料标记的pMHC在突触内的结合会产生FRET信号，可通过全内反射荧光显微镜（TIRF）在群体水平和单分子水平上进行监测。

本文详细介绍了如何利用支持性脂双层（SLB）检测T细胞免疫突触，通过功能性T细胞钙流实验验证其完整性，进行体相及单分子灵敏度的FRET测量，并分析所获得的数据。文中提供了制备用于脂双层功能化的正确构象蛋白的建议。有关脂双层形成以及全内反射荧光（TIRF）显微镜系统设置的更具体信息，请参阅同期发表的另一篇公开JoVE出版物4。

SLB 的性质

可功能化的支持性脂双层（SLB）可由含有两种脂质的单层囊泡（SUVs） readily 制备，这两种脂质分别为 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（简称：POPC，90–99%）和 1,2-二油酰-sn-甘油-3-{[N(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸]琥珀酰}（简称：DGS NTA-Ni，1-10%）。将SUVs铺展于洁净的玻璃载片上，以形成连续的平面双层膜 4DGS-NTA-Ni 通过其合成的含 NTA-Ni 头基与多聚组氨酸标签介导的复合物形成，实现对多聚组氨酸标记蛋白的锚定图1A）。为了实现稳定结合，通常将黏附蛋白ICAM-1和共刺激分子B7-1的天然跨膜区及胞内尾部替换为包含十二个组氨酸的标签（ICAM-1-12H，B7-1-12H）（图1B）。肽段负载的II类分子I-Ek 包含两个嵌入膜内的（α和β）多肽链。两条链的跨膜区/胞内区必须替换为各含六个组氨酸的标签（I-Ekα6H β6H 或 I-Ek-2x6H)。作为替代方案，可将α链延伸并添加十二个组氨酸标签，同时使β链的胞外域不带标签（从而产生I-Ekα12H β0H 或 I-Ek-12H）可得到满意的结果（图1B).

pMHC 的位点特异性标记

为了能够将测得的FRET产率转化为有意义的平衡结合常数，必须对pMHC进行化学计量比和位点特异性的标记。这可以通过化学标记合成肽来实现，该合成肽被加载到重组组氨酸标签MHC II类分子的肽结合裂隙中2,5。该肽包含T细胞表位的所有残基，以及一个短的C端连接子（GGS），其后接一个半胱氨酸（例如，在飞蛾细胞色素c（MCC）肽ANERADLIAYLKQATK-GGSC中，连接子以粗体标出）。该半胱氨酸可用于与马来酰亚胺染料衍生物进行化学计量比标记。在此过程中，应特别注意验证染料与含半胱氨酸肽的偶联是否完全。建议对肽-染料加合物进行HPLC纯化，并随后进行电喷雾电离质谱分析。任何记录到的与未标记肽（无染料）相对应的质量均表明标记不完全。若确实如此，则应对HPLC纯化的肽重复进行多轮染料标记，直至标记达到完全定量。请注意，应避免使用MALDI-TOF质谱分析，因为该方法采用激光辐射进行样品离子化，会导致在读取肽质量之前，所连接的敏感荧光团发生解离，从而低估染料偶联程度。

利用单价单链FV片段对细胞表面结合的TCR进行间接但位点特异性的标记

目前，仍难以以位点特异性的方式将染料连接到活细胞表面相关蛋白上。为克服这一针对表面暴露的TCR的难题，已从TCRβ特异性单克隆抗体H57-197的基因中构建出其单价单链形式（scFV）2。该抗体与TCR形成复合物的晶体结构使得研究人员能够合理设计一种突变形式，即在靠近MHC结合肽C末端（对应FRET伴侣染料的连接位点）附近的一个丝氨酸残基被替换为半胱氨酸残基。该突变产生的半胱氨酸即可作为染料偶联的受体（图2）。

记录FRET的方法

整体FRET值最适合用于验证所选染料间距离与在此TCR-pMHC结合系统中测得的FRET效率之间的关系2。此外，整体FRET测量可揭示突触TCR-pMHC亲和力在定性和定量上的差异（见下文及实验方案第3.2节）。文献中已提出多种量化FRET效率的方法6。本文中FRET通过

（a）受体漂白后供体恢复，以及通过

（b）敏化的FRET受体发射。

第一种方法（a）需要使用易于光漂白的FRET受体以及光稳定性较强的供体。此外，必须确保光漂白后的受体不再具有淬灭供体荧光的能力。由于定量分析使用的是同一检测通道（供体），因此无需考虑校正因子和色差问题，使该方法简单且可靠。然而，无法在同一标本区域重复进行定量测量，也无法记录FRET随时间的变化。为避免分子扩散或细胞运动造成的影响，应尽可能快速完成光漂白步骤，以最大限度缩短FRET供体初次成像（受体光漂白前）与第二次成像（FRET受体光漂白后）之间的时间间隔。建议采用强功率的激光光源，其波长对应于FRET受体的激发波长，以尽量减少照射和漂白所需时间。

相比之下，在敏化FRET发射测量方法（b）中，激发FRET供体，并在FRET受体通道中检测FRET受体的发射信号。FRET受体信号的变化可随时间记录，但必须准确测定并从记录的FRET受体通道信号中扣除FRET供体在红移后的受体通道中的发射（称为串色）以及供体激发导致的FRET受体的交叉激发。为此，相应的FRET供体和FRET受体图像必须进行空间对齐。

单分子FRET事件的检测

利用激光作为激发光源、高灵敏度相机以及降噪的全内反射荧光显微镜（TIRF），可轻松实现对单个荧光分子随时间变化的荧光信号进行追踪。同样，分子间单分子荧光共振能量转移（smFRET）事件的检测也可实现。然而，FRET供体的串扰以及FRET受体的交叉激发可能会带来干扰，因此在调整smFRET实验中荧光分子密度时需格外谨慎。

在下文提供的方案（方案第4节）中，选择TCR作为高丰度的FRET供体，pMHC作为低丰度的FRET受体。为了充分减弱FRET供体的串扰，将10-30%的TCR标记荧光scFV，其余90-70%的TCR标记非荧光scFV。此处选择FRET受体通道作为单分子通道，因其与单分子FRET通道共焦。这有助于将smFRET事件与单分子FRET受体对齐，是smFRET验证的基础。

通过单分子FRET测量提取突触解离速率

从单分子FRET轨迹中提取相互作用的半衰期时，必须考虑FRET供体和FRET受体的光漂白效应。在单个供体-受体对刚出现时可观察到的FRET信号数量 N(0)，会随着时间推移因受体-配体复合物的解离以及光漂白而减少。在给定时间仍存留的复合物数量 N(t) 可用以下数学公式表示：

种群衰减公式；N(t) = N(0)exp(-t/τ_bleach)exp(-t/τ_off)；解释光漂白现象。

在光漂白过程中 exp(-t/τ漂白) 时间 t 由观测次数的乘积描述 n 以及光照时间 t疾病 由于非连续、离散的观测模式（即，漂白仅在光照期间发生）。在动力学项中 exp(-t/τ关闭) 时间 t 是观测次数的乘积 n 以及时间 t滞后期 用于一次FRET观察（即，解离动力学持续进行）。方程1可表示为：

蛋白质荧光衰减方程，N(t)=N(0)exp(-ntfit/tbleach)exp(-ntflag/toff)。

τbleach/τill 表示发生漂白前可进行观测的次数，定义为其指数函数的期望值 bleach>。方程 2 可简化如下：

衰变过程方程、指数函数、时间依赖性、符号公式、科学分析。

在实验中直接测定时间 t 后可观测到 FRET 事件的帧数 N(t) 的期望值 lag)>。该期望值取决于实验中设定的观测时间间隔 (tlag)，以及未知的 τoff 值（即解离速率 koff 的倒数）和 bleach>（发生漂白前的观测次数的期望值）。

因此，通过计算至少两个 tlag 值对应的期望值 lag)>，可实验测定 bleach> 和 τoff。

通过基于FRET的测量提取突触2D-KD值

测量TCR占据率a 即结合的TCR与总TCR的比值是决定突触形成的关键因素 2D-KD 值。根据公式4，只要TCR作为FRET供体，pMHC作为FRET受体，该术语就与测得的FRET产率成正比。

FRET 产率公式 a=FRET 产率·c；与 Förster 共振能量转移分析相关。

其中 a = TCR 占有率，C = 转换系数

C 是一个常数，取决于所使用的FRET系统和荧光团，可通过以下实验方法确定。当已知T细胞加入双层膜前TCR配体的初始密度时，a 可根据公式5转换为 2D-KD。这归因于SLB结合蛋白的高度流动性，以及SLB能够提供几乎无限的配体储备2。

涉及pMHC浓度和变量'a'的二维平衡解离常数方程。

其中 [pMHC 初始] 表示在加入T细胞前pMHC的初始密度

利用公式4和公式5，现在可以轻松确定TCR与pMHC之间的突触二维解离常数（2D-KD）。最可靠的方法是基于受体漂白后供体荧光恢复的FRET测量（见实验方案第3.1节）。

然而，为了测量 C，必须确定FRET强度 IFRET（已校正背景、FRET供体渗漏和FRET受体交叉激发）与TCR占据率a之间的关系。为此，需要知道单个TCR相关FRET供体荧光分子（例如Cy3或AF555）的平均荧光强度sm IFRET donor 与单分子FRET事件的平均强度sm IFRET 之间的比值R。R取决于所用的FRET系统、发射滤光片以及用于荧光检测的相机。

随后可根据公式6直接确定TCR占据率a。

TCR-pMHC 结合计算；FRET 分析方程；生物相互作用研究。

其中 R = sm IFRET donor / sm IFRET

对于 H57 scFv-Cy3/pMHC-Cy5 体系，测得的 R 值为 1.45，导致：

a = 大体积 IFRET / 大体积 ITCR-cy3 • 1.45

通过受体漂白后供体荧光恢复实验，可以确定TCR占有率a与FRET效率之间的关系。为此，将多个TCR微簇的这两个参数相互对应作图，如图4A所示。线性拟合的斜率表示转换因子C（来自公式4）。

如图4A所示，C在（a）H57 scFV-Cy3/pMHC-Cy5 FRET系统和（b）所用显微镜系统配置中的值为1.995。TCR占据率a可直接推导如下：

TCR 占有率 a = FRET 产率 • 1.995

方案

1. 蛋白质生产

1.1. 双层膜驻留蛋白：B7-1、ICAM-1、pMHC例如，I-Ek/肽段

  1. B7-1 -12H, ICAM-1-12H
    1. 利用杆状病毒表达系统，将B7-1-12H和ICAM-1-12H构建体以高产量表达为分泌型天然蛋白。
    2. 通过Ni-NTA亲和层析从培养上清液中纯化蛋白，随后进行MonoQ阴离子交换层析和S200分子筛排阻层析。
    3. 使用胺反应性染料（如Alexa Fluor 488（或FITC）、Alexa Fluor 555（或Cy3）、Alexa Fluor 647（或Cy5）的NHS琥珀酰亚胺酯制剂）对一份纯化蛋白等分试样进行标记。
    4. 在S200分子筛排阻层析后，根据染料生产商的说明，通过比较蛋白在280 nm处的吸光度与染料在488 nm（Alexa Fluor 488、FITC）、555或552 nm（Alexa Fluor 555或Cy3）或647 nm（Alexa Fluor 647或Cy5）处的吸光度，测定单体蛋白的标记程度。
      注意：该比值后续将用于根据染料标记蛋白的整体荧光信号确定SLB上蛋白的密度。
    5. 将未标记及荧光标记的蛋白储存在含50%甘油的PBS中，置于-20°C保存。
  2. pMHC（此处为：I-Ek -2x6H 或 I-Ek-12H）
    1. 在大肠杆菌（E.coli）中表达包含体形式的MHC II类分子，并在复性过程中使用一种成本更低的可被紫外光裂解的肽段替代物，之后可定量置换为所需荧光标记的肽段5,7。
    2. 采用标准技术纯化复性的pMHC复合物（Ni-NTA亲和层析、MonoQ阴离子交换层析、S200凝胶过滤）。
    3. 用荧光标记的肽段置换可被紫外光裂解的肽段5,7。
    4. 最后通过S200凝胶过滤纯化单体形式的荧光pMHC复合物。代表性层析图谱见图3。
    5. 通过分光光度法验证肽段负载的定量完成情况。
    6. 将蛋白储存在PBS/50%甘油中，置于-20°C保存。 

1.2. 单链抗体片段（scFVs）的制备及用于位点特异性标记的半胱氨酸引入

  1. 复性 scFV来自包涵体表达的 大肠杆菌 此处为Tsumoto及其同事设计的一种实验方案 8 随后进行的操作是：首先在6 M盐酸胍中使包涵体完全变性并充分还原，然后在一周的时间内通过逐步降低变性剂盐酸胍的浓度，使蛋白质重新折叠。
  2. 浓缩正确折叠的scFV 使用截留分子量为10 KDa的分子滤过装置。
  3. 通过S200凝胶过滤纯化浓缩液。
  4. 标记单体 scFV 在含有 0.05 mM 三(2-羧乙基)膦的条件下 (TCEP）纯化后立即与Alexa Fluor 647进行标记。标记反应的最佳摩尔比为蛋白：染料不超过1:2，在室温下反应时间不超过2小时。
    注意：TCEP 是一种基于磷的还原剂，在此浓度下不与马来酰亚胺发生反应 9因此，它可以在标记反应过程中存在，以保持未配对的巯基处于还原状态，直至其与染料-马来酰亚胺衍生物发生反应。
  5. 纯化标记的单体scFV 最后通过S75凝胶过滤层析。图中显示了一个代表性色谱图 图3.
  6. 分光光度法测定染料：蛋白质比率。
  7. 将蛋白质在 -20°C 在 PBS/50% 甘油中。

2. 钙流测定

  1. 取一支含有新鲜的西林瓶 50 µg fura-2-AM 并将其溶解于 50 µl 无水DMSO
  2. 离心106 在250-400 g离心力下，于5 ml聚丙烯圆底管中离心T细胞2分钟。
  3. 将T细胞重悬于 200 µl 含钙/镁的 Hank's 平衡盐溶液，加入 1% 卵白蛋白，室温 1 µl 加入fura-2-AM储存液（1:200稀释），混匀细胞悬液，室温孵育30分钟。
  4. 用成像缓冲液洗涤T细胞一次。具体操作为：在室温下，将含有细胞的离心管加满成像缓冲液，按照步骤2所述方法离心收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 µl 成像缓冲液（即， 最终细胞密度为 5 x 106 细胞/毫升-1细胞可立即用于钙离子检测，或在冰上保存最多3小时。
  5. 将细胞置于成像缓冲液中的功能化SLB上（37° C)。一旦T细胞开始接触SLB，立即每隔15至30秒采集一次以下图像，持续30分钟：
    激发波长 340 ± 5 nm，发射检测波长 510 ± 40 nm
    激发波长 380 ± 5 nm，发射检测波长 510 ± 40 nm
    DIC（可选）
    注意：各自的曝光时间取决于激发光源的强度。当340 nm（380 nm）通道的像素强度达到最大可能强度值的约四分之一（二分之一）时，可获得满意的结果。需注意，T细胞激活后，340 nm激发的fura-2信号值会升高，而380 nm激发的信号值会降低。
  6. 运行20-25分钟时，加入50-100 µl 预热的抗pMHC阻断抗体，终浓度为20-50 µg ml-1抗体饱和所有pMHC复合物，导致T细胞不再识别抗原，钙离子流随之停止。继续采集图像5至10分钟，以获取细胞内钙离子浓度的基线水平，该水平对应于T细胞的非活化状态。
  7. 在至少包含 1,000 个像素且无细胞的感兴趣区域内，测定 340 nm 和 380 nm 激发下的平均背景荧光信号。对所有在 340 nm 和 380 nm 激发下测得的 fura-2 图像进行背景扣除，并计算单个细胞或细胞群的 340 nm/380 nm 荧光强度比值。通过将所有比值除以最后五个时间帧的比值，对强度比值进行归一化处理。即，通过完全抗体阻断pMHC。
  8. 将归一化的fura-2比值对时间作图。注意：当细胞和双层膜状态良好时，细胞与双层膜接触后15–45秒内，fura-2在340 nm/380 nm处的荧光强度比值通常介于2至5之间。随后比值下降至1.6至2之间，并在此水平保持稳定至少20分钟或更长时间。仅在加入抗pMHC抗体后，比值应下降至1。典型示例如下所示 图5.

3. 大规模FRET测量

3.1. 使用 H57scFV 对 TCR 进行标记

  1. 离心106 在250-400 g离心力下，于5 ml聚丙烯圆底管中离心T细胞2分钟。
  2. 弃去培养基，轻轻弹动细胞沉淀，加入 0.3 µl scF的V （浓度约为 1 mg/ml）加入细胞悬液中。进行群体 FRET 测量时，仅使用染料标记的 scFv；进行单分子 FRET 测量时，使用未标记 scFv（5 至 9 份，不含未配对半胱氨酸）与染料标记 scFv（1 份，含一个未配对的染料偶联半胱氨酸）的混合物。
  3. 将细胞置于冰上孵育15分钟，随后使用预冷的成像缓冲液通过连续离心洗涤细胞两次。
    注意：细胞可在冰上保存，而不会显著丧失结合的scFV (t1/2 scF的V 解离于 0°C 约 4 小时 2）。从TCR转基因（以及可选的Rag-1/2缺陷型小鼠）中分离并经刺激获得的原代T细胞的纯度 体外 高于98%，因为只有T细胞在肽段刺激下发生增殖（最多可达7次细胞分裂），而该肽段是添加至T细胞培养物中用于刺激的。B细胞经历凋亡，在培养7-10天后不再存活。少数树突状细胞虽可存活，但不仅可通过其独特的形态学特征轻易区分，还可因其不结合H57抗TCRβ scFv片段而被鉴别。

3.2. 通过受体漂白后供体恢复进行FRET测量

注意：TCR-H57 scFV 复合物的半衰期在冰上为 4 小时，在 22.5°C 时为 50 分钟，在 37°C 时为 6.8 分钟（在冰上约为 4 小时）2。只要 H57 scFV 作为 FRET 供体，所测得的 FRET 产率对 H57 scFV 的解离不敏感，然而，随着 H57 解离程度的增加，信噪比会升高。

  1. 根据 Axmann 的方法，制备含有 AF647/Cy5 标记的 pMHC 以及未标记的 ICAM-1 和 B7 的 SLB 等. 4.
  2. 将成像腔室中的 PBS 换成含有钙/镁的 Hank's 平衡盐溶液并添加 1% 卵白蛋白的成像培养基。此步骤使用移液器操作 400 µl 将成像缓冲液加入孔中，轻轻混匀并移除 400 µl 从孔中取出。重复此操作3-4次。切勿将SLB暴露于空气中。
  3. 将成像腔置于显微镜载物台上，调节焦距，直至荧光（AF647，Cy5）支持性脂双层清晰可见。
  4. 通过移动潜望镜的平移台，将聚焦光束沿光轴方向平移至物镜焦平面的边缘，以建立全内反射荧光（TIRF）照明。
  5. 为了在TIRF模式下精细调节激发激光束，加入用AF555/Cy3标记的scF修饰的T细胞V 让细胞沉降到SLB上。注意：当基底细胞膜与SLB同时处于焦平面，且向上调焦时无细胞其他部分出现时，即达到TIRF照明条件。然而，若TIRF未正确调整，则未与SLB接触的荧光T细胞质膜部分将呈现为环状结构。若出现此情况，需通过潜望镜的平移平台调节激光光束，直至实现TIRF照明。
  6. 按指定顺序快速连续获取以下六幅图像（图6):
    （i1，可选）白光，用于拍摄细胞图像，
    （可选）647 nm 激发（低功率）以在淬灭脉冲前拍摄FRET受体（pMHC）的图像
    (i3) 使用514 nm激发光（低功率）在淬灭脉冲前拍摄FRET供体（TCR）的图像，
    (i4) 647 nm 激发（高功率）以光漂白FRET受体，
    (i5) 使用514 nm激发光（低功率）在淬灭脉冲后拍摄FRET供体（TCR）的图像，
    (i6) 647 nm 激发（低功率）以验证FRET受体完全漂白。
  7. 尽量缩短图像 (i3) 与 (i5) 之间的时间间隔，以便后续分析时能够准确关联各图像。通过使用尽可能低的激发光功率（仍能实现对T细胞的清晰成像）来将FRET供体的漂白效应降至最低。
  8. 选择一个感兴趣区域（ROI）， 例如，整个突触或单个TCR微簇，确定其在(i3)中的平均强度（= I(3)）以及在（i5）（= I(5)）。为进行背景扣除，选择（3）或（5）中照明光斑外相同尺寸的感兴趣区域（ROI），并测定其平均强度（I（背景））。为确定FRET效率，请执行以下操作：
    FRET yield formula; percentage calculation in fluorescence resonance energy transfer experiment. （公式 7）
    注意：需要注意的是，针对绝对FRET水平，可能需要对图像（i5）和（i3）之间的供体漂白进行校正。

3.3. 通过敏化发射进行FRET测量

  1. 使用多色荧光微珠进行供体和受体通道的空间对齐，这些微珠可在所有发射通道中产生荧光。由于色差导致的两个通道之间的空间偏移可通过叠加单个微珠来确定，并需将该偏移量应用于后续所有双色图像对中其中一个通道的校正 10.
  2. 使用仅含FRET供体荧光团的SLB来确定供体串扰程度。也可在未标记pMHC的脂质双层上使用FRET供体标记的T细胞。首先在照明视野外测定背景信号，然后从两个通道中均减去该背景值。由此获得两个对应ROI经背景校正后的平均荧光强度（I 供体通道 我 受体通道) 进行测定。按如下方法计算串色系数（BTC）：
    BTC ratio formula for 647 nm and 514 nm excitation; fluorescence measurement diagram. （公式 8）
    注意：该 BTC 是特定染料与滤光片组合的常数。
  3. 按如下方法计算FRET供体串扰图像：
    Fluorescence bleedthrough formula: image_bleedthrough = BTC • image_donor, background-subtracted equation. （公式 9）
  4. 通过单独激发含有FRET受体荧光染料的SLB，测定受体的交叉激发例如，I-Ek/MCC-Alexa Fluor 647) 首先用FRET供体激发光（例如，514 nm）然后用受体激发光（例如， 647 nm）。使用在FRET受体通道中扣除背景后的图像，按如下方法计算交叉激发系数（CEC）：
    CEC equation for excitation ratio analysis in spectroscopic study, using 514nm and 647nm channels. （公式 10）
  5. 由于CEC取决于用于供体激发的激光强度，因此需在每次测量当天测定CEC。利用测得的CEC计算仅通过交叉激发产生的图像。
    Cross-excitation equation diagram, CEC, 561 nm excitation, receptor channel analysis. （公式 11）
  6. 根据以下方法计算已校正渗漏和交叉激发的FRET图像：
    FRET imaging formula; equation for corrected image with background subtraction and cross-excitation. （公式 12）
    注意：绝对FRET信号（而非相对FRET产率）对H57 scF的解离敏感V 从T细胞膜结合的TCR上。为避免TCR-FRET探针过度丢失，应尽量在 37°C 在将T细胞加入双层膜后的前2分钟内。只有在T细胞受体标记率达到或低于95%（定量）时，才可能进行测量 22.5°C 在将T细胞加入双层膜后的前3分钟内。

4. 单分子FRET测量

  1. 调节两束激光的功率，使强度达到1-5 kW/µm2 观察标本。欲了解更多信息，请参阅 Axmann 等 4.
  2. 按照上述方法，使用未标记的scF与T细胞混合进行标记V （5-9 个部分）和 Cy3/AF555 标记的 scFV （1 部分）。注意：通过这种方法，只有一小部分 TCR 被标记上 FRET 供体。这会减少可检测到的相互作用数量，但同时也显著降低了供体串扰所产生的噪声（约降低 51/2 至 101/2），这在解析单个单分子FRET事件时至关重要。
    注意：H57 scFV探针从TCR上的解离不会影响测量结果，因为其解离发生的时间尺度（数分钟至数小时）远长于TCR与SLB结合的pMHC解离的时间尺度（亚秒至秒级）。
  3. 将含有AF647标记的pMHC、ICAM和B7的SLB置于显微镜载物台上，调节焦距，使双层膜清晰可见。
  4. 可选：将狭缝光阑插入激发光路中（如 Axmann 所示） 等 4）以遮蔽大部分照明区域，仅保留突触部位暴露于光照下。通过这种方式，未漂白的I-Ek/MCC (C)-Alexa Fluor 647 FRET 受体分子可移动至照明区域。
  5. 加入 H57 scFV 将标记的T细胞加入双层膜（含成像缓冲液），并等待免疫突触出现在视野中。
  6. 连续快速采集10到20组图像，采用双色检测：
    i1) 激发波长 514 nm
    i2) 激发波长 647 nm
  7. 曝光时间为1至5毫秒，并以图像集形式采集。
  8. 为了评估单分子FRET事件的真实性，需对供体串扰和受体交叉激发进行相同的校正。此外，单分子FRET事件必须与单个受体分子相对应，并应以单步方式出现和消失（另见 图7).
  9. 解离速率测定
    1. 记录多个采集时间帧内的单分子FRET事件轨迹。
      注意：在此示例（斜体）中，5c.c7 TCR 与 I-E 之间的解离速率kK3 在……处测量 25 °C 42毫秒、490毫秒、1,007毫秒、1,989毫秒
    2. 根据表1所示，按FRET轨迹的长度列出FRET轨迹。
    3. 将表1转换为逆累积衰减函数（表2），如图所示（带颜色的数字取自表1）。
    4. 为标准化所得的衰减函数，将表2中各组的轨迹数除以该组所有轨迹数的总和。将标准化后的数值对时间帧数作图。当省略包含零值的最后一个时间帧时，衰减曲线可方便地用单指数函数进行拟合图8A).
    5. 如图所示 图8B，绘制期望值 滞后期)> , 即延迟时间对应的衰减函数指数的负倒数 t滞后期 使用（在此示例中：x = t滞后期 = 0.042 s 且 y= 滞后期)> = 1/0.662 = 1.511，x = 0.49 s 且 y = 1/0.902 = 1.101，x = 1.007 s 且 y = 1/1.131 = 0.884，x = 1.989 s 且 y = 1/1.591 = 0.629).
    6. 适配 τ关闭 和 漂白> 根据公式3进行计算。此步骤可使用Origin等科学数据分析软件中的非线性拟合功能完成。
      注意：本示例中显示的最佳拟合结果产生了一个 τ关闭 2.12 ± 0.23 秒 漂白> 1.53 ± 0.06 秒
    7. 计算相互作用的半衰期 t1/2 折扣 与 t1/2 折扣 = τ关闭 • ln(2) （在此示例中：1.47 s）。
  10. 2D-KD 测定
    1. 确定转换系数 C 对于上述使用的FRET染料对，采用公式6进行计算（图4A).
    2. 测定单个TCR微簇或整个免疫突触的FRET效率（图3B和图5).
    3. 使用公式4将所有单个FRET产率转换为TCR占据率（图4C).
    4. 应用公式11将所有TCR占有率转换为2D-KDs. 如下所示，突触结合具有异质性。突触K的一个有意义的度量Ds 是所有测量到的微簇（microclusters）的中位数（以红色表示）图 4D).
  11. 2D-k 的计算在s
    1. 计算 k在 质量作用定律，其中 k开启 = k关闭/D 以及实验测定的k关闭 和 KD 值。
      注意：突触k关闭 在所示实验中 图4 (I-EkMCC 与 5c.c7 TCR 相互作用 25 °C) 为 0.41 秒-1因此，KD 绘图（图 4D) 可被转化为一个 k在 如图所示绘制曲线图 图4E.

结果

通过fura-2钙染料记录细胞内钙离子水平，以及随后进行的细胞分析以验证SLB的刺激效力及其功能性的方法如图4所示。显然，T细胞在接触具有刺激性的SLB后，其钙离子水平立即上升（以归一化的fura-2 340nm/380nm比值表示，基线值为1）。在加入阻断pMHC与TCR结合的抗体、从而终止T细胞活化后，钙离子水平很快恢复至基线水平。

图6 展示了一项典型的FRET供体在受体漂白后的恢复实验，该实验用于测量FRET效率，并可用于计算二维结合常数（2D-K）D 值（如图所示） 图4）。请注意FRET供体强度的增加，该信号代表通过AF555标记的TCR，在FRET受体组分（此处为与pMHC结合的AF647）快速且完全消融后出现。同时可明显观察到FRET通道信号的显著减弱， 即，FRET供体激发下FRET受体通道在FRET受体漂白后的信号。残留的微弱信号对应于FRET供体的渗漏。单个TCR微簇或整个免疫突触的FRET效率根据所示测得的强度值计算（图6B).

图7展示了一个在两个时间帧中可见的单分子FRET事件的轨迹和时间推移。如上文引言所述，这种行为是由突触TCR-pMHC结合的解离以及光漂白共同引起的。为了区分这两种因素的贡献，需要改变实验采集的时间帧持续时间：光漂白效应保持恒定，而FRET事件轨迹长度的变化仅由结合动力学引起。对轨迹长度的定量分析构成了计算图7中所示解离速率和光漂白的基础，相关数据列于表1至表3中。

二维结合常数（2D-K）的测定D需要记录用FRET供体标记的TCR的总体FRET产率。利用实验推导出的常数 C (图4)，可将测得的TCR微簇或整个免疫突触的FRET效率转换为TCR占据率 a, 即pMHC 结合的 TCR 与总 TCR 的比值（图 4C。在添加T细胞之前，SLB上已存在已知的pMHC密度， a 可应用这些值来确定突触二维刚度（2D-K）D 值（图 4D）。结合速率可通过质量作用定律计算（2D-k开启 = 2D-k关闭二维凝胶电泳D根据测定的突触解离速率和二维解离常数（2D-KD）值计算得出。

含POPC、DGS NTA-Ni的脂双层示意图；玻璃基底；蛋白质荧光标记方法。
图1. 平面玻璃支撑脂双层（SLB）系统的示意图。（A） SLB由POPC（90–99%）和合成脂质DGS Ni-NTA（1–10%）组成，当清洁的玻璃表面与由相应脂质构成的小单层囊泡（SUVs）接触时，SLB可自发形成。（B） 形成后，此类SLB可通过可溶性多组氨酸标签化的pMHC胞外区、共刺激分子B7-1蛋白以及ICAM-1黏附蛋白进行功能化修饰，从而作为T细胞的抗原呈递细胞（APC）。有关SLB制备的更多信息，请参见Axmann et al.4。请点击此处查看该图的放大版本。

TCR-pMHC interaction with FRET and TIRF microscopy diagram for protein binding analysis.
图2. 基于荧光共振能量转移的检测方法定量分析TCR-pMHC结合 原位.（A） 由TCR与H57单链片段结合pMHC形成的复合物结构展示了本文所述的基于FRET的方法。注意发生FRET的两个相应荧光团之间约41Å的短距离。荧光团-马来酰亚胺的受体位点以绿色和红色标示。 （B） 检测TCR-pMHC相互作用的原理 原位 如图所示。仅scFV-标记的TCRs和pMHCs（此处为I-Ek），这些分子形成特定复合物，从而产生可测量的FRET信号。 请点击此处以查看此图的放大版本。

色谱图，标注的肽段、Superdex色谱柱、蛋白质纯化分析。
图3. 最终凝胶过滤步骤的色谱图，用于获得单体形式的scFV和肽段负载的I-Ek-2x6H分子。 横轴表示洗脱体积（单位：ml），纵轴表示280 nm处的吸光度（任意单位，AU）。（A） 使用Alexa Fluor 555马来酰亚胺对H57 scFV进行位点特异性标记后，通过S75色谱分离未反应的染料与蛋白质（步骤1.2.5）。洗脱体积在14至15 ml区间内的组分（虚线之间）为标记后的单体H57 scFV。（B） 将与紫外可切割ANP间隔肽结合的I-Ek-2x6H分子进行紫外照射，随后与位点特异性标记Alexa 647马来酰亚胺的肽段孵育，最后通过S200色谱分离蛋白质与游离肽段（步骤1.1.2.4）。虚线之间的洗脱峰包含正确折叠且呈单体形式的pMHC分子。（A, B） 实验开始时（0 ml点）上样体积为0.7 ml。收集的组分经浓缩处理，并在对PBS/50%甘油透析（用于-20°C保存）前，通过分光光度法测定蛋白与染料的摩尔比。请点击此处查看该图的放大版本。

TCR 占有率与 FRET 产率分析、直方图、显示簇的图表、结合动力学数据。
图 4. 确定二维解离常数（2D-KD）和二维结合速率常数（2D-kon）. (A) 通过受体漂白后供体恢复所测定的 FRET 产率与 TCR 占有率之间的相关性通过实验测量。TCR 占有率可针对单个 TCR 微簇进行测定，方法如第 4.2 节所述。数据的线性拟合以直线表示，其斜率等于 TCR 占有率与 FRET 产率之间的比值 C。C 是所用 FRET 系统及荧光染料（此处为 Cy3 和 Cy5）特有的常数。在此示例中，该值为 1.988。(B) 通过受体漂白后的供体恢复，测定单个 TCR 微簇的 FRET 产率数据（N = 187，温度 = 24 °C）。直方图下方数字表示该区间内的上限值。(C) 将 (B) 中所示数据乘以 (A) 中确定的常数 C 进行换算。柱状图下方数字表示该区间内的上限值。(D) 直方图（半对数，底数 = 4）显示了对单个 TCR 微簇测得的二维解离常数（2D-KD）分布情况。中位数 2D-KD 值以蓝色标示。柱状图下方数字表示该区间内的上限值。(E) 将 (D) 中所示直方图利用突触解离速率常数 koff（24 °C 时为 0.41 s-1）转换为二维结合速率常数（2D-kon）直方图（半对数，底数 = 4）。所确定的中位数 2D-kon 值以蓝色标示。数据最初发表于 Huppa et al.2，此处以新形式呈现。请点击此处查看该图的放大版本。

Fura-2 钙成像与比率分析；T细胞随时间变化的反应；显微镜图像与图表数据。
图5. 用于T细胞刺激与成像的SLB的功能验证。(A) 用fura-2负载的TCR转基因T细胞母细胞与含有抗原性pMHC、ICAM-1和B-7的刺激性SLB接触。记录在340 nm和380 nm激发下的细胞内fura-2发射信号以及DIC图像。如图所示，右侧图显示了340 nm与380 nm激发下发射强度的比率值。在实验进行至14分钟时加入pMHC阻断抗体，导致细胞内钙水平下降，与静息状态T细胞相当。 (B) 接触刺激性SLB的T细胞中平均fura-2比率的典型时间曲线表现为细胞内钙水平初始上升，其幅度为非激活T细胞或经抗体介导阻断后失去抗原刺激的T细胞的2至4倍。绿色圆圈表示(A)中所示的时间点。请点击此处查看该图的放大版本。

FRET 显微镜结果、DNA 激发/发射、通道示意图、突触 FRET 产率分析。
图 6. 通过 FRET 受体漂白后 FRET 供体信号恢复所测得的总体 FRET 产率。 (A) 图示为典型的突触 FRET 测量示例。如左侧和上方所示，使用发射光束分离器获取了一系列图像，从而生成 FRET 供体通道和 FRET 受体通道（有关光束分离器的更多详细信息，请参见 Axmann et al4）。左侧 DIC 图像中的线条表示 T 细胞突触的边界。注意在 FRET 受体漂白后（步骤 4），FRET 受体通道中的强度降低，同时 FRET 供体通道中的强度增加。(B) FRET 效率可如图所示对单个突触区域或整个突触进行量化。为便于观察，使用两种查找表（LUT，绿色和物理模式）显示 FRET 受体漂白前后的图像。请点击此处查看该图的放大版本。

FRET 分析示意图：随时间变化的单分子 FRET 和 Alexa 647 通道；荧光共振能量转移。
图 7. 单分子 FRET 事件以单步方式出现和消失，并与单个 FRET 受体荧光团完全对应。展示了单分子 FRET 事件的时间过程。图像使用背照式 EMCCD 相机采集。请点击此处查看该图的放大版本。

Exponential decay graph showing time-lag effect on detectable events; data analysis, fitting curves.
图8. 确定τ关闭 = 1/k关闭 从测量得到的单分子FRET轨迹. （A） 可观测FRET信号的归一化累积和（源自H57 scFV-AF555 标记的识别 I-E 的 5c.c7 TCR 转基因 T 细胞母细胞k/K3-AF647 在 24°C对于四种不同时间延迟（42 ms、490 ms、1,007 ms、1,989 ms），将其随观测总数的变化作图。单指数拟合函数得到相应期望值的负倒数 滞后期)>. （B） 期望值随延迟时间的变化关系被绘制为曲线图 t滞后期 并使用方程进行拟合 <n(t滞后期)> = τ关闭 /{(τ关闭 /<n漂白>) + t滞后期以得到τ关闭和 漂白>. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

测量蛋白质-蛋白质相互作用 原位 尤其是在处理低亲和力相互作用（如TCR-pMHC结合）时，这一点尤为理想 11这是因为这些相互作用的结合速率及其稳定性在很大程度上受到结合发生时具体条件的影响。因此，基于FRET的微创成像方法在原理上非常适合此类任务，但仍需克服一系列技术障碍。细胞自发荧光所产生的噪声会限制测量的灵敏度，因此应尽可能降低。TIRF显微镜技术能很好地满足这一需求。 12 但需要对玻片进行功能化处理，理想形式是制备平面玻璃支持的脂双层，并嵌入特定蛋白质 13-15部分重建方法的另一个优势在于，与细胞表面表达的蛋白质相比，可对重组双层膜中定位的FRET配对分子更简便地以定量、位点特异且合理的方式，用更小且更亮的荧光染料进行标记。TCR通过重组单链抗体片段（scF）进行标记。Vs，这些先前已测试过，不影响T细胞识别 2此外，SLB 的蛋白质组成（例如 pMHC 的密度以及辅助因子的选择）可根据具体需求进行调整。我们此前已开展过使用不同密度刺激性 pMHC 的实验，但未检测到 2D-k 的显著差异关闭 和二维KD2.

到目前为止，本文仅讨论了MHC II类分子的识别，这主要是由于其肽结合槽在两端均开放，因而能够容纳较大的肽段，包括用于连接荧光染料的接头。在某些情况下，此类方法也可能适用于MHC I类分子的标记 16 但应格外谨慎，以验证其在实验中的使用。T细胞对抗原的敏感性可通过T细胞增殖实验进行检测，同时可通过检测pMHC-TCR结合动力学来评估 体外 通过表面等离子体共振检测时，肽段上添加连接臂和荧光基团不应影响其结合信号。或者，可通过在重链序列中引入一个未配对的半胱氨酸，实现对MHC I类分子本身的位点特异性标记（未发表观察结果）。

通过使用适当的分子探针，原则上可采用本文所述方法研究任何突触蛋白-蛋白相互作用。此类探针 例如， scFV或设计性锚蛋白重复蛋白（DARPins）17，应为单价结合，并能稳定地与其靶标结合，且不影响目标相互作用。当然，结构信息对于合理设计探针非常有利，但并非绝对必需。在建立一对新的FRET伴侣时，建议首先在整体水平上记录和分析FRET。可通过显著改变标记位点以最大化FRET信号，并验证所测得的FRET效率是否随染料间距离的变化而变化。一旦系统优化完成，可通过将高丰度FRET伴侣的标记率限制在10–30%，并漂白低丰度FRET伴侣，直至照明视野中可分辨出单个分子，从而记录单分子FRET信号。

最后但同样重要的是，应注意SLB仅在某些方面而非所有方面模拟了生理质膜的特性。例如膜曲率和柔韧性、结构域区室化、细胞骨架重排以及细胞运动性，还有大量表达于细胞表面的膜蛋白等特性在SLB中均未得到体现，但这些因素可能会影响所研究的过程。要建立能够在生理突触中以单分子分辨率监测蛋白质-蛋白质相互作用的成像方法，仍需投入大量努力，而这类突触无法通过TIRF成像技术进行观察。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

M.A. 获得了奥地利科学基金（FWF, J3086-B11）的薛定谔奖学金支持，并感谢马克斯-普朗克学会提供的资金和行政支持。G.S. 和 J.H. 获得了维也纳科学与技术基金（WWTF, LS13-030）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LB培养基Fisher Scientific10000713用于细菌表达
Sf900 IILife Technologies10227402用于杆状病毒生产的昆虫细胞培养基
Insect-XPRESS（含L-谷氨酰胺，Lonza）Fisher Scientific10564038用于杆状病毒表达的昆虫细胞培养基
Sf9细胞Life Technologies11496-015用于病毒生产与扩增的细胞
High Five细胞Life TechnologiesB855-02用于蛋白表达的细胞
LB培养基Fisher Scientific10000713用于细菌表达
Centramate系统Pall用于大体积样品的蛋白浓缩
Centramate盒式滤器，截留分子量10 kDaPallOS010T12用于大体积样品的蛋白浓缩
Amicon Ultra-15离心滤管EMD MilliporeUFC900308蛋白浓缩
Amicon Ultra-4离心滤管EMD MilliporeUFC800308蛋白浓缩
Amicon搅拌式超滤池，200 mL型号EMD Millipore5123蛋白浓缩
Äkta pure 25LGE Healthcare29-0182-24蛋白纯化
Superdex 200 10/300 GLGE Healthcare17-5175-01蛋白纯化
Superdex 75 10/300 GLGE Healthcare17-5174-01蛋白纯化
Mono Q 5/50GLGE Healthcare17-5166-01蛋白纯化
Ni Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare17-5318-01蛋白纯化
Tricorn 10/20层析柱GE Healthcare28-4064-13蛋白纯化
Gilson HPLC系统Gilson荧光染料偶联肽的纯化
Pursuit XRs C18，5 µm粒径，21.2×250 mm色谱柱尺寸AgilentA6000250X212荧光染料偶联肽的纯化
Pursuit XRs C18，5 µm粒径，21.2×50 mm色谱柱尺寸AgilentA6000050G212荧光染料偶联肽的纯化
Tricorn 10/20层析柱 GE Healthcare28-4064-13蛋白纯化
Gilson HPLC系统Gilson荧光染料偶联肽的纯化
Pursuit XRs C18，5 µm粒径，21.2×250 mm色谱柱尺寸AgilentA6000250X212荧光染料偶联肽的纯化
Pursuit XRs C18，5 µm粒径，21.2×50 mm色谱柱尺寸AgilentA6000050G212荧光染料偶联肽的纯化
Cy3马来酰亚胺GE HealthcarePA23031通过突变的未配对半胱氨酸进行位点特异性蛋白标记
Cy5马来酰亚胺GE HealthcarePA25031通过突变的未配对半胱氨酸进行位点特异性蛋白标记
Alexa Fluor 555 C2马来酰亚胺Life TechnologiesA-20346通过突变的未配对半胱氨酸进行位点特异性蛋白标记
Alexa Fluor 647 C2马来酰亚胺Life TechnologiesA-20347通过突变的未配对半胱氨酸进行位点特异性蛋白标记
Fura-2, AM，细胞渗透性Life TechnologiesF-1221用于细胞标记的钙离子敏感性染料
二甲基亚砜Sigma Aldrich151874用于溶解Fura-2 AM
含钙/镁的Hank's平衡盐溶液Fisher Scientific10225362成像缓冲液
PBSLife Technologies14190-136
牛血清白蛋白冻干粉Sigma AldrichA2153成像缓冲液的补充成分
14-4-4S抗体affimetrix eBioscience14-5980-81阻断H2-I-Ek的抗体（可被5c.c7、2B4和AND TCR识别）
5 mL聚丙烯圆底管Becton DickinsonFALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC离心滤器EMD MilliporeUFC30GV0S
0.2 µm针头式滤器MilliporeGVWP04700
TetraSpeck微球，0.1 µm，荧光蓝色/绿色/橙色/深红色Life technologiesT-7279
用于Fura-2钙离子检测的显微镜 LEICADMI4000B
用于（单分子）FRET检测的显微镜LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS详情请参见Axmann等人在JoVE的并行研究
平面支撑脂双层详情请参见Axmann等人在JoVE的并行研究
RPMI 1640，含L-谷氨酰胺Life Technologies11554416T细胞培养基
非必需氨基酸（100倍浓缩液）HycloneSH30238.01T细胞培养基补充剂
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（100倍浓缩液）Life Technologies12000226T细胞培养基补充剂
2-巯基乙醇Sigma AldrichM6250T细胞培养基补充剂
小鼠白细胞介素-2重组蛋白BPS Bioscience90185-BT细胞培养基补充剂
研究级胎牛血清HycloneSV30160.03T细胞培养基补充剂
Origin（分析软件）OriginLabhttp://www.originlab.com/双参数非线性拟合（tauoff，[ntlag]）

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FRET FRET T MHC

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