使用非洲爪蟾（Xenopus laesvis）的共聚焦分析研究Wnt与Shh形态发生素梯度的调控因子

摘要

本文提供了一套简单的方法，用于分析荧光标记配体在非洲爪蟾（Xenopus）中的分泌与扩散。该方法可用于检测其他蛋白质对配体分布的调控能力，并支持开展有助于揭示形态发生素梯度调控机制的实验。

摘要

本方案描述了一种用于可视化配体在细胞群体中分布的方法。由于非洲爪蟾（Xenopus laevis）在早期胚胎中细胞体积较大，且易于表达外源蛋白，因此是可视化GFP标记配体的有用模型。合成的mRNA在注射到早期Xenopus胚胎后可被高效翻译，并且注射可靶向单个细胞。当与细胞膜锚定的RFP等谱系示踪剂联合使用时，可方便地追踪表达过量蛋白的注射细胞及其子代细胞。本方案描述了通过注射mRNA产生荧光标记的Wnt和Shh配体的方法。该方法包括外胚层组织外植体（动物极帽）的显微解剖，以及对多个样本中配体扩散情况的分析。通过共聚焦成像，可以获得关于配体分泌及其在细胞群体中扩散的信息。对共聚焦图像进行统计学分析，可获得配体浓度梯度形态的定量数据。这些方法可能对希望研究可能调控形态发生素梯度形态因素的研究人员具有帮助。

引言

在早期胚胎发育过程中，细胞逐步被决定走向特定的分化谱系：这意味着一群全能性（或 pluripotent）细胞逐渐受限，最终形成决定分化为某一特定细胞类型的前体细胞群体。细胞间的信号传递在胚胎发育过程中谱系特化的调控中起核心作用。为了支持新型医学治疗，需要对这些信号进行调控，以引导干细胞向特定命运分化。

在发育过程中，仅有少数信号通路被反复使用，包括响应TGF超家族（如nodal和BMPs）^1-2、FGFs³、Wnts⁴ 和 Hedgehogs⁵ 的通路。这些分泌型蛋白与细胞膜上的受体结合，从而激活信号转导，改变基因表达和/或细胞行为。细胞信号的精确调控对于细胞谱系特化和正常发育至关重要。尽管这些通路之间的相互串扰在决定细胞命运中具有重要作用，但单一配体本身在不同浓度下即可引发不同的反应。形态发生素梯度理论早在100多年前就被提出，用以解释不同类型的细胞如何从一群相同的细胞中产生⁶。由某一细胞群产生的信号分子可扩散至一定范围，其浓度随距离信号源越远而逐渐降低。暴露于该信号的细胞会根据其在细胞群中的位置感知局部浓度，并对信号的不同浓度水平作出差异性响应。形态发生素存在的证据来自对早期果蝇胚胎⁷ 和翅盘⁸ 的研究，以及脊椎动物肢体⁹ 和神经管¹⁰ 的研究。

方案

伦理声明：动物实验是在 MEP 持有的英国国内事务部许可证下进行的，并已获得约克大学伦理委员会的批准，符合 ARRIVE（动物研究：In Vivo 实验报告）指南的要求。（https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines）。

1. 生成荧光标记配体的策略

以下是将 Wnt8a-HA 和 eGFP 亚克隆至 pCS2 载体以生成同框融合构建体 Wnta-HA-eGFP 的示例实验方案：

1. 设置并进行 Wnt8a-HA 和 eGFP 的 PCR 反应。使用表1中显示的引物信息，以及表2中显示的示例 PCR 反应体系和示例 PCR 反应条件。注意：模板 DNA 将根据所构建的质粒而有所不同，本示例中使用 Wnt8a-HA 作为模板 DNA。
2. 使用凝胶回收试剂盒纯化 PCR 反应产物，最终用 30 µl 分子生物学级水洗脱。
3. 取 2 µl PCR 产物，在 TAE 缓冲液配制的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
4. 使用相应的限制性内切酶对 Wnt8a-HA 和 eGFP 的 PCR 产物以及 pCS2 载体进行酶切消化（参见表1），反应体系设置见表2（示例 PCR 产物酶切）。
5. 37°C 孵育 3 小时，随后将 Wnt8a-HA 和 GFP 的 PCR 产物置....

结果

表达荧光标记蛋白的动物帽外植体的共聚焦分析为在不同实验条件下可视化配体分布提供了一个有效的系统。在此示例中，展示了GFP标记的Shh的分布情况（图1）。在2细胞期， 非洲爪蟾 将胚胎的两个细胞分别注射对照mRNA或编码Sulf1的mRNA，Sulf1是一种修饰细胞表面硫酸乙酰肝素并影响Shh形态发生素梯度的酶¹⁶将这些胚胎培养至32细胞期，随后向单个细胞共注射编码Shh-GFP和memRFP（作为谱系示踪剂）的mRNA。由此产生表达Shh-GFP的细胞克隆，其细胞膜上标记有RFP。在囊胚期，取动物极帽组织外植体，用于共聚焦显微镜分析。 图1 结果显示，在对照条件下，Shh-GFP 被分泌并扩散到表达注射mRNA区域之外。然而，在Sulf1存在的情况下，Shh-GFP的分布范围受到限制，在本样本中，其信号未在产生它的细胞克隆外被检测到。Sulf1对Shh-GFP分布的影响已得到更深入的分析¹⁶.

在 Xenopus 胚胎中表达时，荧光标记.......

讨论

本方案的一个关键环节是生成具有生物活性的配体，这些配体即使带有荧光基团，仍能被正常加工、分泌，并在靶细胞中引发相应的生物学反应。必须通过适当的检测方法验证荧光标记的基因产物是否具有生物活性。对于Shh-GFP，其激活ptc1表达的能力已被证实¹⁶。Wnt8a在单个腹侧卵裂球中表达时具有极强的能力诱导次级体轴形成^20-21，而Wnt8a-HA-eGFP也被证明保留了这一生物学活性。Wnt11b可抑制经激活素处理的外胚层组织外植体发生汇聚延伸运动^21-22，而Wnt11b-HA-eGFP同样保持了其生物活性¹⁷。标记配体能够引发与未标记蛋白相当的生物学反应，表明基于荧光配体实验所得出的结论适用于天然蛋白。在配体与荧光蛋白之间插入HA表位提供了一个间隔区域，使得Wnt融合蛋白既具有活性又具备荧光特性。

此类分析的主要局限在于其无法直接反映内源性形态发生素梯度的情况。例如，Shh 在动物帽细胞群中的扩散方式可能并不等同于内源性 Shh 在胚胎柱状神经上皮中实际的移动方式。然而，本实验方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Melford	MB 1200
乙酸铵	Ambion	来自 Megascript SP6 试剂盒 AM 1330
碳酸氢盐	VWR International	RC-091
硝酸钙	Sigma	C13961
帽类似物 (m7G(5'))	Applied Biosystems	AM 8050
氯仿	Sigma	C 2432
盐酸半胱氨酸一水合物	Sigma	C7880
dNTPs	Invitrogen	18427-013
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma	O3690
乙醇	VWR International	20821.33
Ficoll 400	Sigma	F 4375
Fiji image J 软件			免费下载 http://fiji.sc/Fiji
庆大霉素	Melford	G 0124
冰乙酸	Fisher Scientific	A/0400/PB17
玻璃盖玻片，No.1.5	Scientific Laboratory Supplies	22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030
玻璃微电极拉制仪	Narishige	Narishige PC -10
玻璃拉针毛细管	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
人绒毛膜促性腺激素 (HCG)	Intervet
异丙醇	Fisher Scientific	P/7500/PB17
氯化锂 (LiCl)	Sigma	L-7026
LSM710 及 Zen 软件 (2008-2010)	Carl Zeiss
Matlab 软件	Mathworks		http://uk.mathworks.com/
分子生物学级水	Fisher Scientific	BP 2819-10
指甲油	Boots	条形码 3600530 373048
分光光度计	Lab.tech International	ND-1000 / ND8000
培养皿 (55 mm)	VWR International	391-0865
苯酚-氯仿	Sigma	P3803
Photoshop 软件	Adobe		http://www.photoshop.com/products
高保真 DNA 聚合酶及缓冲液	Biolabs	M0530S  缓冲液 - M0531S
氯化钾 (KCl)	Fisher Scientific	P/4280/53
PVC 绝缘胶带	Onecall	SH5006MPK
凝胶回收试剂盒	Qiagen	S28704
限制性内切酶缓冲液	Roche	SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
无 RNase 的 DNase	Promega	ME10A
钢背单刃刀片	Personna	66-0403-0000
氯化钠 (NaCl)	Fisher Scientific	27810.364
SP6 转录试剂盒	Ambion	AM1330
载玻片	Thermo Fisher	SHE 2505
Tris 碱	Invitrogen	15504-020
钨针			自制
Zen lite 软件	Carl Zeiss		免费下载  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html