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使用非洲爪蟾（Xenopus laesvis）的共聚焦分析研究Wnt与Shh形态发生素梯度的调控因子

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DOI：

10.3791/53162

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2015年12月14日

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1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

本文内容

摘要

本文提供了一套简单的方法，用于分析荧光标记配体在非洲爪蟾（Xenopus）中的分泌与扩散。该方法可用于检测其他蛋白质对配体分布的调控能力，并支持开展有助于揭示形态发生素梯度调控机制的实验。

摘要

本方案描述了一种用于可视化配体在细胞群体中分布的方法。由于非洲爪蟾（Xenopus laevis）在早期胚胎中细胞体积较大，且易于表达外源蛋白，因此是可视化GFP标记配体的有用模型。合成的mRNA在注射到早期Xenopus胚胎后可被高效翻译，并且注射可靶向单个细胞。当与细胞膜锚定的RFP等谱系示踪剂联合使用时，可方便地追踪表达过量蛋白的注射细胞及其子代细胞。本方案描述了通过注射mRNA产生荧光标记的Wnt和Shh配体的方法。该方法包括外胚层组织外植体（动物极帽）的显微解剖，以及对多个样本中配体扩散情况的分析。通过共聚焦成像，可以获得关于配体分泌及其在细胞群体中扩散的信息。对共聚焦图像进行统计学分析，可获得配体浓度梯度形态的定量数据。这些方法可能对希望研究可能调控形态发生素梯度形态因素的研究人员具有帮助。

引言

在早期胚胎发育过程中，细胞逐步被决定走向特定的分化谱系：这意味着一群全能性（或 pluripotent）细胞逐渐受限，最终形成决定分化为某一特定细胞类型的前体细胞群体。细胞间的信号传递在胚胎发育过程中谱系特化的调控中起核心作用。为了支持新型医学治疗，需要对这些信号进行调控，以引导干细胞向特定命运分化。

在发育过程中，仅有少数信号通路被反复使用，包括响应TGF超家族（如nodal和BMPs）1-2、FGFs3、Wnts4 和 Hedgehogs5 的通路。这些分泌型蛋白与细胞膜上的受体结合，从而激活信号转导，改变基因表达和/或细胞行为。细胞信号的精确调控对于细胞谱系特化和正常发育至关重要。尽管这些通路之间的相互串扰在决定细胞命运中具有重要作用，但单一配体本身在不同浓度下即可引发不同的反应。形态发生素梯度理论早在100多年前就被提出，用以解释不同类型的细胞如何从一群相同的细胞中产生6。由某一细胞群产生的信号分子可扩散至一定范围，其浓度随距离信号源越远而逐渐降低。暴露于该信号的细胞会根据其在细胞群中的位置感知局部浓度，并对信号的不同浓度水平作出差异性响应。形态发生素存在的证据来自对早期果蝇胚胎7 和翅盘8 的研究，以及脊椎动物肢体9 和神经管10 的研究。

需要开发方法来研究形态发生素梯度的建立机制，并鉴定在调控这些梯度过程中起重要作用的其他分子。利用免疫组织化学技术对内源性蛋白质进行可视化观察的精巧实验 体内 在不同遗传背景下已被用于研究形态发生素浓度梯度11-12然而，优质的抗体和特异性突变体并不总是可获得，因此本文介绍一种在非洲爪蟾（Xenopus）中过表达荧光标记配体的实验方案，以提供一种替代性的简便方法，用于解析外源基因产物如何影响配体在细胞群体中的分布。 非洲爪蟾 为开展此类实验提供了极佳的体系，因为其胚胎在体外发育，便于在最早期阶段进行操作。其较大的体积（直径约1-1.5 mm）使显微注射和手术操作更为简便；至囊胚期时，细胞仍相对较大（约20 µm），易于成像观察。在非洲爪蟾中进行过表达研究十分简便：将mRNA注射至早期胚胎后，可靶向特定细胞，并能高效翻译。

使用 pCS2 Wnt8a-HA13、pCS2 Wnt11b-HA14 和 eGFP 构建了荧光标记的 Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP 载体。HA 肽段的引入至关重要，不仅可作为额外的分子标签，还被认为可充当间隔序列，将 Wnt 蛋白与 eGFP 蛋白分离开来，从而使两种基因产物均能正常发挥功能。用于可视化 Shh 的载体此前已被用于构建表达 Shh-eGFP 融合蛋白的转基因小鼠15；该载体由 Andy McMahon 惠赠。重要的是，所有载体中的 GFP 标签均克隆在信号序列的 3’ 端，以确保在蛋白加工后仍被保留。此外，必须确保最终表达的蛋白包含实现翻译后修饰所必需的序列，例如 Shh 和 Wnt 配体所需的脂质修饰。cDNA 被亚克隆至 pCS2+ 表达载体中，该载体专为合成 mRNA 的制备而优化，含有 SP6 启动子和多聚腺苷酸化信号（http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors）。

本文所述工作提供了一种简单的实验方案，用于比较荧光标记的Wnt和Shh配体的分泌与扩散。通过注射定量合成的mRNA，该方案避免了使用不同启动子载体导致表达水平不一致所带来的问题。这些方法近期已被应用于研究硫酸乙酰肝素内切硫酸酯酶Sulf1对非洲爪蟾（Xenopus）中Shh-eGFP以及Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP分泌与扩散的影响16-17。

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方案

伦理声明：动物实验是在 MEP 持有的英国国内事务部许可证下进行的，并已获得约克大学伦理委员会的批准，符合 ARRIVE（动物研究：In Vivo 实验报告）指南的要求。（https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines）。

1. 生成荧光标记配体的策略

以下是将 Wnt8a-HA 和 eGFP 亚克隆至 pCS2 载体以生成同框融合构建体 Wnta-HA-eGFP 的示例实验方案：

  1. 设置并进行 Wnt8a-HA 和 eGFP 的 PCR 反应。使用表1中显示的引物信息，以及表2中显示的示例 PCR 反应体系和示例 PCR 反应条件。注意：模板 DNA 将根据所构建的质粒而有所不同，本示例中使用 Wnt8a-HA 作为模板 DNA。
  2. 使用凝胶回收试剂盒纯化 PCR 反应产物，最终用 30 µl 分子生物学级水洗脱。
  3. 取 2 µl PCR 产物，在 TAE 缓冲液配制的 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
  4. 使用相应的限制性内切酶对 Wnt8a-HA 和 eGFP 的 PCR 产物以及 pCS2 载体进行酶切消化（参见表1），反应体系设置见表2（示例 PCR 产物酶切）。
  5. 37°C 孵育 3 小时，随后将 Wnt8a-HA 和 GFP 的 PCR 产物置于冰上保存。
  6. 向 pCS2 酶切产物中加入 1 µl 小牛碱性磷酸酶（CAIP），37°C 孵育 6 分钟。
  7. 65°C 孵育 15 分钟以热失活 CAIP。
  8. 将 pCS2 和 PCR 产物的酶切反应物在 TAE 缓冲液配制的 1% 超纯琼脂糖凝胶上进行电泳。
  9. 使用凝胶回收试剂盒对 pCS2 和 PCR 产物进行凝胶回收和纯化，最终用 30 µl 分子生物学级水洗脱。
  10. 按照表2中所述条件设置连接反应（示例 T4 DNA 连接酶反应），12°C 孵育 16 小时。

2. mRNA 合成：模板的制备

  1. 使用限制性内切酶消化以下质粒（均位于表达载体 pCS2 中）来制备模板：膜定位 Cerulean（memCerulean）、膜定位 RFP（memRFP）、Shh-GFP、Wnt8a/Wnt11b-HA-eGFP。
    1. 按照表 2（模板酶切示例）所述设置酶切反应体系。
    2. 轻轻混匀，于 37°C 孵育反应 2 小时。 
  2. 取 2.5 µl 酶切后的质粒样品在 1% 琼脂糖凝胶（TAE 缓冲液）上电泳，以确认酶切反应是否完全。
  3. 使用凝胶回收试剂盒纯化酶切产物，最终用 50 µl 分子生物学级水洗脱。

3. mRNA 合成：体外转录

  1. 使用 SP6 mRNA 转录试剂盒合成功能性 mRNA。在 1.5 ml 无 DNA 酶/RNA 酶的微量离心管中配制反应体系。
  2. 按照表 2（mRNA 合成示例）所述设置 mRNA 转录反应。
  3. 用移液器轻轻混匀反应液，然后在 37°C 下孵育 4 小时。
  4. 取 1 µl 反应产物在 2% 琼脂糖凝胶（TAE 缓冲液）上进行电泳检测。
  5. 向反应体系中加入 1 µl DNA 酶，用 P20 移液器轻轻混匀，再于 37°C 下继续孵育 15 分钟。
  6. 向反应体系中加入 340 µl 分子级水、40 µl 乙酸铵和 400 µl 苯酚-氯仿溶液。涡旋振荡反应液 30 秒。
  7. 在 4°C 下以 14,000 x g 离心 5 分钟。
  8. 用移液器吸取上层（水相）液体，转移至新的 1.5 ml 螺口微量离心管中。
  9. 向每个转移后的反应液中加入等体积的氯仿，涡旋振荡样品 30 秒。
  10. 在 4°C 下以 14,000 x g 离心 5 分钟。
  11. 用移液器吸取上层水相液体，转移至新的 1.5 ml 螺口微量离心管中。
  12. 向每个反应液中加入等体积的异丙醇，并在 -80°C 下沉淀 mRNA 30 分钟。
  13. 在 4°C 下以 14,000 x g 离心 15 分钟，使 mRNA 沉淀成团。
  14. 小心移除上清液，注意不要扰动沉淀的 mRNA。
  15. 向每个反应管中加入 200 µl 70% 乙醇，混匀后在 4°C 下以 14,000 x g 离心 10 分钟 。
  16. 小心吸除乙醇，避免扰动 mRNA 沉淀，然后使用真空干燥器或快速浓缩仪在室温下干燥沉淀。
  17. 将 mRNA 重悬于 10–20 µl 分子级水中。短暂离心后置于冰上保存。注意：将样品加热至 80°C 1 分钟有助于溶解。
  18. 取 1 µl mRNA 在 2% 琼脂糖凝胶（TAE 缓冲液）上电泳，并用分光光度计分析 1.2 µl 样品以准确测定浓度。
    关键步骤：后续实验需要合成 mRNA 的浓度达到 400 ng/µl。
    关键步骤：若 260/280 比值不在 2.00–2.20 范围内，或总 mRNA 量超过 12 µg，需进行氯化锂沉淀纯化。
  19. 将 mRNA 分装为每管 1 µl，于 -80°C 保存。使用时取单次分装量，用后即弃；禁止重复冻融。

4. 生成Xenopus laevis 胚胎

  1. 启动 非洲爪蟾 实验前一周，通过皮下注射向雌性动物给予50单位人绒毛膜促性腺激素（HCG；Chorulon）。
  2. 诱导 非洲爪蟾 实验前夜通过注射250单位HCG并置于19℃黑暗条件下过夜孵育雌性个体 °C.
  3. 从安乐死的雄性青蛙中解剖出睾丸，并在 4℃ 下用 1xNAM 保存°C. 注意：雄性青蛙依据《1986年动物（科学程序）法案》附表1规定，通过终末麻醉实施安乐死（https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia）。
  4. 按摩雌性 非洲爪蟾 为诱导排卵，将产出的卵收集至直径为55 mm的圆形培养皿中。
  5. 通过研磨制备精子悬液 ¼ 在1 ml去离子水中制备非洲爪蟾（Xenopus laevis）睾丸组织悬液。
  6. 用巴斯德吸管和吸球将破碎的精子悬浮液刷在非洲爪蟾卵母细胞上。 关键步骤：在实验当天约16:30进行受精反应。
  7. 在21℃下培养胚胎°C 在 NAM/10 中（溶液配制见表 3），置于经 1% 琼脂糖（溶于水中）包被的 55 mm 培养皿内。
  8. 孵育45分钟后去除胶状膜胚胎 使用半胱氨酸/盐酸（表3）。注意：在21°C，胚胎将在90分钟后发育至2细胞阶段 每20分钟裂解一次 之后。

5. 非洲爪蟾胚胎的显微注射

  1. 使用 1 X 90 mm 玻璃毛细管和 Narishige PC-10 双级玻璃微电极拉制仪制备用于注射的微电极。通过经验调整参数，以获得尖端极细（直径小于一微米）的微电极。
  2. 将微电极（针头）连接至气体微注射仪（例如 Harvard Apparatus PLI-100 PICO-INJECTOR），通过施加经调节的气压并在数字设定的时间内保持该压力，实现液体的精确重复递送。调节气压，使每次注射体积为 1.25 至 10 纳升，该体积需使用网格目镜或校准载玻片测定。
  3. 在直径 55 mm 的培养皿中加入 5 ml 1% 琼脂糖（水溶液）进行包被。从培养皿中切出一块 35×35 mm 的琼脂糖块，用作稳定表面以进行胚胎显微注射。
  4. 将胚胎转移至 NAM/3 + Ficoll（见表 3）中，并移至注射用培养皿。
  5. 当胚胎发育至实验所需阶段后，在动物极半球进行注射。
    1. 为分析 GFP 标记配体在细胞表面的分布情况，于两细胞期对胚胎进行双侧注射，每细胞注射 10 nl。以下为 Wnt8a-HA-eGFP 的示例 mRNA 稀释方案。关键步骤：确保所有 mRNA 起始浓度均为 400 ng/µl。
      注意：所需注射的 mRNA 量需通过浓度梯度实验经验性确定，找到可观察到荧光配体的最低有效剂量。使用抗 HA 抗体进行 Western blot 是必要步骤，以确认不同荧光标记配体的 mRNA 翻译水平相近，从而实现可比性；我们在 Fellgett et al., 2015 中已对 Wnt8a-HA-eGFP 和 Wnt11b-HA-eGFP 完成此验证。
      注意：在评估某种注射 mRNA（例如编码候选调控因子的 mRNA）效应时，典型对照是向同胞胚胎中注射非活性 RNA（如 LacZ），以排除额外转录本对胚胎可能产生的非特异性影响。
      1. 用分子级水将 memRFP mRNA 按 1:4 比例稀释（1 µl mRNA + 3 µl dH2O），使终浓度降至 100 ng/µl。
      2. 用分子级水将 Wnt8a-HA-eGFP mRNA 按 1:4 比例稀释（1 µl mRNA + 3 µl dH2O），使终浓度降至 100 ng/µl。
      3. 将 memRFP mRNA 与 Wnt8a-HA-eGFP mRNA 按 1:1 比例混合。
      4. 将步骤 5.5.1.3 中的 mRNA 与对照 mRNA LacZ 或调节因子（如 Sulf1）mRNA 按 1:1 比例混合。
      5. 在两细胞期对胚胎进行双侧注射，每细胞注射 10 nl mRNA（总计 20 nl）。注意：此操作使每细胞注射 250 pg memRFP、250 pg Wnt8a-HA-eGFP、500 pg Wnt11b-HA-eGFP 以及 2 ng LacZ 或 Sulf1 mRNA。
    2. 为分析 GFP 标记配体的扩散情况，在 16–32 细胞期向每细胞注射编码配体-GFP 的 mRNA 及谱系标记物（如 memRFP），每细胞注射 1.25 nl。
    3. 为分析任何潜在配体扩散调节因子的作用，可共注射编码该调节因子的 mRNA 与配体及谱系示踪剂。或者，可分别注射相邻细胞：一个细胞注射编码 GFP 标记配体和谱系示踪剂（memRFP）的 mRNA，另一个细胞注射编码调节因子和另一种谱系示踪剂（memCerulean）的 mRNA。
  6. 将胚胎转移至 12.5°C 培养箱中继续培养至次日，达到 Nieuwkoop 和 Faber（NF）发育阶段 8 期。

6. 切除动物帽外植体

  1. 将胚胎转移至已加入5 ml 1%琼脂糖（水溶液）的55 mm培养皿中，再向培养皿中加入NAM/2培养基（表3）。
  2. 使用钨针切取圆形动物极帽。关键步骤：此阶段应切取较大的动物极帽，因其愈合效果更好且更易于成像；同时保留对照组的动物极帽，以确保未发生 convergent extension（汇聚延伸）现象。
  3. 将动物极外植体转移至涂有1%琼脂糖（水溶液）的55 mm培养皿中，在21°C条件下培养4小时。关键步骤：需孵育4小时，以使荧光蛋白充分成熟。
  4. 通过将两层PVC绝缘胶带粘贴在载玻片上制备凹槽载片，在胶带上切割出一个14 mm × 10 mm的矩形孔洞，形成用于装载动物极帽的腔室。关键步骤：在切割矩形前，务必彻底压平胶带的两层，使其牢固贴附于载玻片表面。
  5. 用移液器将两滴NAM/2培养基（表3）分别加入凹槽载片中，每滴约30 µl。
  6. 使用剪去尖端的P20枪头将动物极外植体转移至凹槽载片中，并调整方向，使顶面朝上。注意：每张载片可容纳10–15个动物极帽。关键步骤：此时动物极帽应已部分愈合，因此结构不再脆弱，可使用镊子进行定向操作。
  7. 轻轻将玻璃盖玻片盖在凹槽载片上，静置干燥20分钟。关键步骤：动物极帽的尺寸至关重要；需确保其足够大，以便当盖玻片压下时，能充分压缩动物极帽细胞的顶层，从而形成平整的成像表面。若动物极帽仍偏小，可将PVC胶带减为单层。
  8. 用指甲油密封载片。关键步骤：密封凹槽载片时切勿使用过多指甲油，否则若PVC胶带过湿，会导致胶带翘起，破坏载片结构。
  9. 将凹槽载片在避光条件下干燥20分钟 ，即可进行成像；通常情况下，密封后的动物极帽可在载片中保持健康状态4–6小时。

7. 成像

注意：使用倒置共聚焦显微镜进行成像。选择Lambda模式进行成像，因为该模式允许使用具有重叠光谱特征的多种荧光染料，并避免了扫描之间样品可能移动的问题。

  1. 先使用低倍物镜找到外植体，然后切换至63倍/1.4油镜，以实现更高分辨率的成像。
  2. 开启所需的激光器；本示例中，使用405 nm激光激发memCerulean，488 nm激光激发GFP，561 nm激光激发memRFP，并采用405 nm和488/561 nm二向色镜。
  3. 使用lambda模式（在Zen 2011软件中，选择lambda模式——32通道）。
  4. 选择405 nm、488 nm和561 nm激光器。为获得更宽的视野，将图像缩小（至0.6倍）。
  5. 将帧尺寸设置为所需的图像大小（本数据集采用1024 × 1024像素，像素尺寸为220 nm）。
  6. 将平均扫描次数设为通常的4至8次，以提高信噪比。
  7. 优化针孔大小（本数据集根据561 nm激光设定为1个艾里单位）。
  8. 优化激光功率。关键步骤：平衡405 nm、488 nm和561 nm激光，使所有荧光染料均可通过32通道探测器阵列检测到，同时尽量减少所需电压和增益。
  9. 采集memCerulean、GFP和memRFP发射的荧光信号。本研究中，从415–720 nm范围内每约10 nm采集一次光信号，但也可采用更大的采集间隔（例如，每约20 nm）。

8. 图像分析

  1. 研究调节剂对GFP标记配体在细胞表面表达的影响
    注意：以下步骤是我们实验室进行分析的详细指南。最终用户可通过编写ImageJ或FIJI脚本，以简化流程并减少部分手动操作。
    关键步骤：最终用户必须在与最终实验相同的条件下，采集所用荧光染料的光谱，以便对最终实验中使用的多种荧光染料进行有效的光谱分离。
    本节将进行两种主要类型的分析：
    1. 计算与细胞膜共定位的Wnt-HA-eGFP像素总数。
      1. 在ZEN软件中使用这些荧光染料单次注射所采集的光谱，对绿色、红色和天蓝色通道进行光谱分离。将这些图像另存为独立的LSM文档，用于后续所有步骤。
      2. 直接在图像编辑软件中打开LSM文件。注：以下说明适用于FIJI Image J。
      3. 将LSM图像另存为图像序列文档，此操作将自动将图像拆分为独立的通道。
      4. 将图像序列保存到将用于数据分析的脚本分析软件的脚本所在文件夹中（参见补充代码文件以获取实际脚本）。注：以下说明适用于Matlab。 
      5. 打开脚本分析软件，并打开编写脚本的目录。
      6. 在“位置分析”下输入文件名，软件将读取该文件名并执行分析。
        注：文件名将显示为ImageA0000和ImageA0001。脚本分析软件将使用标记为0001的图像作为掩膜，并分析0000图像中与该掩膜共定位的像素百分比。
      7. 获取共定位百分比数值（标注为“细胞膜占据”），并将其复制到电子表格中。注：以下说明适用于Excel。
      8. 将共定位百分比数值以绝对值或相对值形式绘制为柱状图。 
    2. 分析Wnt-HA-eGFP斑点的数量、大小和形状。
      1. 直接在图像编辑软件中打开已分离的LSM文件。注：以下说明适用于FIJI Image J。
      2. 将每幅图像拆分为独立通道（图像 > 颜色 > 拆分通道）。
      3. 对Wnt-HA-eGFP和膜标记通道进行阈值处理（图像 > 调整 > 自动阈值）。关键步骤：尝试多种阈值，选择能生成代表性图像且不使通道过曝的阈值。
      4. 将膜标记通道转换为掩膜（处理 > 二值化 > 创建掩膜）。
      5. 反转此掩膜（编辑 > 反转）。
      6. 如上所述，将Wnt-HA-eGFP斑点转换为掩膜。
      7. 从配体-GFP掩膜中减去膜标记掩膜（处理 > 图像计算器 > 将Wnt掩膜置于上方框，膜掩膜置于下方框）。
      8. 使用“分析粒子”功能。在此处选择所需参数并分析数据（分析 > 分析粒子）。
      9. 将粒子数量、平均粒子大小和圆形度数据复制到电子表格中，然后根据这些数据绘制图表。注：本分析仅分析面积在0.1–10µm2之间的粒子，对粒子圆形度未作限制。此说明适用于Excel。  
  2. 分析配体扩散范围
    1. 在共聚焦成像软件中打开所有已分离的图像，然后以TIF格式导出文件，包括原始数据和RGB图像。注：此说明适用于Zen lite 2011。关键步骤：至少在一幅图像上包含比例尺，以便在分析过程中计算距离。
    2. 在图像分析软件中打开待分析图像。注：以下说明适用于Photoshop。8.2.3）右键单击图像背景并选择“从背景创建图层”，以生成新图层。
    3. 将膜标记通道设置为0，仅使配体-GFP通道可见（图层 > 新建调整图层 > 通道混合器）。关键步骤：将新调整图层剪贴至待分析图像，点击通道混合器选项后，可通过复选框选择是否将新图层剪贴至该图像。
    4. 新建一个工作区。将分辨率设置为每英寸300像素，颜色模式设置为RGB颜色（文件 > 新建 > 剪贴板）。
    5. 将所有待分析图像复制到单一工作区中（单击图像及其剪贴的通道混合器，按住Ctrl键，再按住Ctrl和Alt键，将图像拖入工作区）。
    6. 调整所有图像方向，使每幅图像的最大扩散长度沿水平轴测量，并将表达Wnt-HA-eGFP的细胞置于左侧。
    7. 将工作区另存为TIF文件，然后在图像分析软件中打开该文件。注：以下说明适用于FIJI Image J。
    8. 打开ROI管理器窗口（分析 > 工具 > ROI管理器）。
    9. 在第一幅图像上绘制一个矩形，可指定矩形的精确尺寸（选择矩形工具并绘制任意矩形 > 编辑 > 选择 > 指定）。注：本研究中使用的尺寸为650 x 100像素（长×宽）。
    10. 将矩形置于表达Wnt-HA-eGFP的区域边缘。将矩形覆盖在Wnt-HA-eGFP扩散距离最大的区域上。关键步骤：即使没有膜标记，由于背景荧光，表达Wnt-HA-eGFP的区域也应可见；若不可见，请参考原始图像。
    11. 将矩形向右移动10 µm。通过测量其中一幅图像中比例尺的长度来确定微米数（绘制一条线沿比例尺 > 分析 > 设置比例尺）。注：这将提供10 µm对应的像素值。
    12. 通过点击ROI管理器窗口中的“添加”按钮，将该矩形添加至ROI管理器。
    13. 点击矩形工具返回，移动矩形至下一个待测图像。重复步骤8.2.10–11。
    14. 当所有图版测量完成后，从ROI管理器菜单中选择“多图绘制”（ROI管理器 > 更多 > 多图绘制 > 列表）。
      注：数据表示沿水平轴（X，以像素为单位）递增的Wnt像素强度（Y）。Y值是在X点处配体-GFP的平均信号强度，该平均值由每个X值对应的Y轴上所有像素计算得出。因此，矩形越高，用于计算该平均值的像素越多。Y轴上的小矩形噪声较大；高矩形的平均像素强度则非常低。
    15. 将多图绘制框中的数据复制到电子表格中，并相应重命名。注：以下说明适用于Excel。
    16. 舍弃每次分析中前10–20 µm的数据，因其代表配体-GFP表达细胞的背景荧光，会扭曲图表。
    17. 打开科学分析与绘图软件，创建新笔记本。注：以下说明适用于Sigmaplot 13。
    18. 通过双击工作表上的水平数字，为数据标记所需数量的列，并将其标记为“距离（µm）”、“Wnt8a-HA-eGFP”和“Wnt11b-HA-eGFP”。
    19. 将电子表格中的数据复制到科学分析与绘图软件的相应列中。
    20. 创建散点图（创建图表 > 散点图 > 多重散点图 > 选择X对多个Y > 选择距离列为X > 选择Wnt8a-HA-eGFP和Wnt11b-HA-eGFP作为Y值 > 完成）。
    21. 通过左键单击散点图上的Wnt8a-HA-eGFP点，对Wnt8a-HA-eGFP曲线进行回归分析。所有点应高亮显示。点击分析 > 回归向导。
    22. 选择曲线方程类别（指数衰减）和方程名称（单指数，三参数），然后点击下一步。
    23. 选择应拟合曲线的X和Y值（若数据此前已高亮，则应自动完成），然后点击下一步。
    24. 继续执行向导，直至“数值输出选项”页面，确保勾选“生成报告”，然后点击下一步。注：拟合曲线的参数将显示在报告1*中。
    25. 在“图表选项”页面，确保勾选“将方程添加至图表标题”，然后点击完成。注：向导将在笔记本顶部创建“报告1*”和“图表1*”标签页，同时将曲线添加至步骤(8.2.20)生成的图表中。
    26. 重复步骤8.2.21–8.2.25，为Wnt11b-HA-eGFP拟合曲线。关键步骤：尝试将多种方程类别和方程名称拟合至数据。注：最佳拟合曲线应具有最高的R2值和最低的残差平方和。 

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结果

表达荧光标记蛋白的动物帽外植体的共聚焦分析为在不同实验条件下可视化配体分布提供了一个有效的系统。在此示例中，展示了GFP标记的Shh的分布情况（图1）。在2细胞期， 非洲爪蟾 将胚胎的两个细胞分别注射对照mRNA或编码Sulf1的mRNA，Sulf1是一种修饰细胞表面硫酸乙酰肝素并影响Shh形态发生素梯度的酶16将这些胚胎培养至32细胞期，随后向单个细胞共注射编码Shh-GFP和memRFP（作为谱系示踪剂）的mRNA。由此产生表达Shh-GFP的细胞克隆，其细胞膜上标记有RFP。在囊胚期，取动物极帽组织外植体，用于共聚焦显微镜分析。 图1 结果显示，在对照条件下，Shh-GFP 被分泌并扩散到表达注射mRNA区域之外。然而，在Sulf1存在的情况下，Shh-GFP的分布范围受到限制，在本样本中，其信号未在产生它的细胞克隆外被检测到。Sulf1对Shh-GFP分布的影响已得到更深入的分析16.

在 Xenopus 胚胎中表达时，荧光标记...

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讨论

本方案的一个关键环节是生成具有生物活性的配体，这些配体即使带有荧光基团，仍能被正常加工、分泌，并在靶细胞中引发相应的生物学反应。必须通过适当的检测方法验证荧光标记的基因产物是否具有生物活性。对于Shh-GFP，其激活ptc1表达的能力已被证实16。Wnt8a在单个腹侧卵裂球中表达时具有极强的能力诱导次级体轴形成20-21，而Wnt8a-HA-eGFP也被证明保留了这一生物学活性。Wnt11b可抑制经激活素处理的外胚层组织外植体发生汇聚延伸运动21-22，而Wnt11b-HA-eGFP同样保持了其生物活性17。标记配体能够引发与未标记蛋白相当的生物学反应，表明基于荧光配体实验所得出的结论适用于天然蛋白。在配体与荧光蛋白之间插入HA表位提供了一个间隔区域，使得Wnt融合蛋白既具有活性又具备荧光特性。

此类分析的主要局限在于其无法直接反映内源性形态发生素梯度的情况。例如，Shh 在动物帽细胞群中的扩散方式可能并不等同于内源性 Shh 在胚胎柱状神经上皮中实际的移动方式。然而，本实验方...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

本工作由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）向 MEP 提供的资助（BB/H010297/1）、BBSRC 向 SAR 提供的配额制博士生奖学金以及英国医学研究理事会（MRC）向 SWF 提供的博士生奖学金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖MelfordMB 1200
乙酸铵Ambion来自 Megascript SP6 试剂盒 AM 1330
碳酸氢盐VWR InternationalRC-091
硝酸钙SigmaC13961
帽类似物 (m7G(5'))Applied BiosystemsAM 8050
氯仿SigmaC 2432
盐酸半胱氨酸一水合物SigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
乙二胺四乙酸 (EDTA)SigmaO3690
乙醇VWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J 软件免费下载 http://fiji.sc/Fiji
庆大霉素MelfordG 0124
冰乙酸Fisher ScientificA/0400/PB17
玻璃盖玻片，No.1.5 Scientific Laboratory Supplies22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
玻璃微电极拉制仪NarishigeNarishige PC -10
玻璃拉针毛细管Drummond Scientific3-000-203-G/X
人绒毛膜促性腺激素 (HCG)Intervet
异丙醇Fisher ScientificP/7500/PB17
氯化锂 (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 及 Zen 软件 (2008-2010)Carl Zeiss
Matlab 软件Mathworkshttp://uk.mathworks.com/
分子生物学级水 Fisher ScientificBP 2819-10
指甲油 Boots条形码 3600530 373048
分光光度计Lab.tech InternationalND-1000 / ND8000
培养皿 (55 mm)VWR International391-0865
苯酚-氯仿SigmaP3803
Photoshop 软件Adobehttp://www.photoshop.com/products
高保真 DNA 聚合酶及缓冲液 BiolabsM0530S  缓冲液 - M0531S
氯化钾 (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
PVC 绝缘胶带OnecallSH5006MPK
凝胶回收试剂盒 QiagenS28704
限制性内切酶缓冲液RocheSuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
无 RNase 的 DNasePromegaME10A
钢背单刃刀片Personna66-0403-0000
氯化钠 (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 转录试剂盒AmbionAM1330
载玻片Thermo FisherSHE 2505
Tris 碱Invitrogen15504-020
钨针自制
Zen lite 软件Carl Zeiss免费下载  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

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Wnt Shh

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