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方法文章

木质纤维素生物质抗降解性变异的高通量筛选：总木质素、木质素单体及酶解糖释放

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DOI：

10.3791/53163

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2015年9月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

本文内容

摘要

植物细胞壁的结构和化学特性被用于评估生物燃料和生物材料的理想原料。传统方法在处理大规模数据集时存在局限性。这些高通量的预处理、酶解糖化以及热解-分子束质谱分析方法，能够在减少实验时间和成本的同时，对大量生物质样品进行比较分析。

摘要

将木质纤维素生物质转化为燃料、化学品及其他产品，已被视为减少非可再生能源使用的一种可能途径。为了从大量不同的植物中筛选出具有理想化学特性的种类以用于后续应用，必须对诸如纤维素和木质素含量，或酶解糖化后单糖释放量等性状进行比较。传统分析方法的实验及数据分析流程可能耗时较长，从而限制了可检测样品的数量。高通量（HTP）方法能够克服传统方法的不足，实现对大量样品的快速筛选，从而分离出具有目标性状的材料。本研究展示了美国国家可再生能源实验室（NREL）所采用的高通量糖释放及热解-分子束质谱分析流程。这些分析流程已实现了对数千种植物材料的高效评估，同时通过减少人力和耗材消耗，显著降低了实验时间和成本。

引言

随着全球不可再生能源及其相关产品的供应日益减少，科学家们面临着从植物来源中开发类似燃料和化学品的挑战1。这项工作的关键环节之一是确定哪些植物种类适合用于生物燃料和生物材料的生产2,3。通常，这些原料需评估其木质素、纤维素和半纤维素的含量，以及其在热、机械和/或化学预处理（无论是否后续进行酶解糖化）过程中被分解的难易程度（即抗降解性）。更深入的分析可用于确定木质素和半纤维素组分的具体构成，以及所需的最优酶活性。通过对本身不具备理想性状的植物进行转基因改造，使其适用于生化或热化学转化以生产目标产品，研究人员因此获得了更为广泛的潜在原料来源4。尽管现有的植物化学性状定量分析标准方法在处理少量样本时非常有效，却不适用于对数百乃至数千个样本进行快速筛选5-7。本文所述的高通量（HTP）方法旨在快速高效地评估大量生物质变异体在细胞壁对抗热化学和/或酶降解抗性方面的变化。

必须明确的是，本文所述的高通量筛选实验并非旨在最大化转化率或产率。其目的是确定相关生物质样品在内在抗降解性方面的相对差异。因此，许多分析步骤与以获得最大转化速率或转化程度为目标的“典型”生物质转化实验有所不同。例如，采用较低强度的预处理和较短的酶水解时间，以最大化样品间的差异。在大多数情况下，使用相对较高的酶添加量，以减少因酶活性实验变异所导致的差异，从而避免对结果产生显著偏差。

用于快速测定植物细胞壁组成及酶解糖化后释放的单体糖的先进技术，包括机器人技术、定制的耐热耐化学96孔板以及对标准实验室方法的改进8-11 以及仪器分析方法，例如振动光谱（红外光谱（IR）、近红外光谱（NIR）或拉曼光谱）和核磁共振（NMR）12-17这些方法对于分离出高纤维素或低木质素含量的原料，或预期可产生最高葡萄糖、木糖、乙醇的原料至关重要， 等等。 这些方法实现了使用较少生物量和消耗品的缩小规模分析，从而降低了实验成本18该方法学的另一个特点是能够快速评估各种实验条件，在某些情况下还可同时进行评估。例如，可测试多种不同的预处理策略或酶组合，从而快速确定并采用最优的实验参数。常见的原料，如玉米秸秆9，杨树8,10，甘蔗渣8，以及柳枝稷8 已使用这些高通量方法成功评估。

总木质素含量及木质素单体组成也是常见的生物质性状指标。研究表明，降低木质素含量可提高多糖的酶解消化率19,20。木质素单体比例（通常以紫丁香基/愈创木基（S/G）含量表示）在植物细胞壁降解过程中的作用仍在研究中。一些报道指出，S/G 比例降低会促进水解后葡萄糖产率的提高21，而其他研究则揭示出相反的趋势19,22。用于评估木质素及其单体的高通量方法包括振动光谱法（红外、近红外和拉曼23–26）结合多元分析，以及热解分子束质谱法（pyMBMS）27,28。

在开发用于生物质筛选的高通量方法时，需牢记若干关键因素。其中一个关键方面是方法的复杂性：该技术需要何种技能水平？例如，化学计量学分析需要具备构建、评估和维护预测模型的专门技能。标准方法往往存在不理想的样品前处理或数据分析步骤，或使用有毒试剂。模型的开发是一个持续过程，需随时间推移不断将新数据纳入模型，以增强其稳健性。另一个考虑因素是所提出高通量方法在成本节约和实验分析时间缩短方面的优势。如果方法虽然非常快速，但成本过高，则许多实验室可能难以采用。本文所展示的方法是对标准化技术的改进变体，旨在提升通量能力。这些方案能够定量测定目标生物质性状，而无需建立预测模型。这是这些技术的一个关键优势，因为尽管预测方法与用于模型开发的标准分析方法之间具有较强相关性，但其准确性仍不及直接测量样品中目标物质的实际含量。尽管所用方法本质上是标准台式分析方法的微型化版本，但其以准确性和精密度为代价换取了速度和通量。这种结果主要源于小体积移液和称量过程中更高的误差，以及样品量减少导致的样品异质性增加。虽然可以对大量样品进行筛选和比较，但在不同实验批次之间以及与台式规模结果进行比较时，必须格外谨慎。

最耗时的步骤涉及生物质的物理操作。研磨样品每份可能需要数分钟，包括样品间清理研磨仪的时间。手动装载、卸载和清理料斗，以及填充和清空茶包与样品袋，也极为耗费人力。尽管每个步骤可能仅需一分钟或更长时间，但处理数千个样品可能需要数小时甚至数天。机器人可在约3至4小时内将生物质装入一个典型的反应板，即每天可处理6至8块板。-1 机器人-1这种情况取决于所使用的精度参数以及待测生物质的类型和数量。使用液体处理机器人可快速向反应板中加入水、稀酸或酶。一组反应板（1至20块）的预处理过程（包括组装、冷却和拆卸）耗时1至3小时。酶水解过程需要3天，糖分分析则需约1小时的准备时间，外加每块反应板10分钟完成检测和读取结果。通过每周设定固定的预处理和分析日程，可实现合理的工作安排，尽量减少人工在非工作时段或周末的操作，从而持续实现每周处理约800至1,000个样品的能力。最大通量取决于多个因素，主要为硬件设备（机器人、反应板）的数量。 等。）以及有多少“软件”（即，人员配备）可用于完成手工操作。实际的上限为每周 2,500 至 3,000 个样品；然而，达到该通量需要每周 7 天连续运行，并配备多名学生实习生和技术人员。相比之下，采用 HPLC 分析 3,000 个样品将需要约 125 天的样品分析时间，此外还需额外投入人工将样品称量至反应器以及在分析前对样品进行过滤。

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方案

1. 酶解糖化后葡萄糖和木糖产率的高通量测定9,29

  1. 样品制备（研磨、脱淀粉、提取、预处理）
    1. 使用 Wiley 磨将每种生物质样品至少 300 mg 进行研磨，使颗粒能通过 20 目（850 µm）筛网。转移至防静电自封袋（通常带有条形码），并将样品信息记录到条形码数据库中。
    2. 从防静电袋中取出约 250 mg 或更多的研磨后生物质，放入编号的（用铅笔编号，切勿使用墨水或记号笔）茶袋中，小心卷起茶袋，确保将末端折叠覆盖在生物质上，以防止在脱淀粉和提取过程中样品损失。
    3. 使用镀锡铜线将茶袋封口。记录每个条码样品对应的茶袋编号。
    4. 使用商用酶配制脱淀粉酶溶液（通常为 0.25% (v/v) 葡糖淀粉酶（~1,600 AGU/L）和 1.5% (v/v) α-淀粉酶（~2,900 KNU-S/L）溶于 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 5.0）中）。每克散装生物质准备 16 ml，或每 120 个茶袋样品准备 500 ml。注意：应通过测试一系列酶添加量和比例消化后的淀粉残留情况，经验性地确定能够完全去除研磨生物质中淀粉的酶用量。
    5. 在塑料容器中，每 1 g 散装研磨生物质加入 16 ml 脱淀粉酶溶液。对于批量脱淀粉操作，将 120 个茶袋加入 500 ml 缓冲液-酶混合溶液中。
    6. 在 55 °C 下于摇床中孵育 24 (± 4) 小时，转速为 120 rpm，以去除可能存在的淀粉。
    7. 脱淀粉孵育结束后，用数升去离子水冲洗并浸泡生物质 30 分钟。重复此过程额外两次，以去除可能引起暴沸（溶液中形成气泡，导致液位突然剧烈上升，使热乙醇从反应容器中喷涌而出）的缓冲盐。
    8. 在对脱淀粉生物质进行彻底冲洗后，将茶袋放入索氏提取柱中进行提取。此步骤无需使用滤纸套管。
    9. 设置索氏回流装置，使用 95% 乙醇对样品提取 24 小时。
    10. 从索氏提取器中取出茶袋，并在平坦托盘上单层铺开。
    11. 让样品在通风橱中室温下过夜干燥。
    12. 展开茶袋，将干燥后的生物质重新放回原始的条码防静电袋中。
      注意：防静电袋能有效减少生物质中的静电，改善操作性能。若使用其他储存方式，由于生物质会粘附在容器壁上，可能需要额外的样品量。
    13. 将至少 50 mg 干燥生物质转移至条码料斗中（使用更多材料有助于提高分装精度）。扫描防静电袋和接收料斗的条形码，以确保样品追踪准确无误。
    14. 将料斗装载到固体称重机器人上，注意样品在支架中的顺序。装载足够数量的反应板以容纳所有样品，并根据所用板数选择相应的分装程序。
    15. 由机器人将 5 mg（± 0.3 mg）干燥样品称量至耐酸不锈钢 96 孔板中。每个样品在板上分布三个重复，以最小化局部差异。
    16. 加入 8 个已充分表征的标准生物质材料作为对照样品，以监控检测性能。对于多块板，使用多个标准生物质料斗可减少因多次分装循环中料斗筛分导致的粒径漂移。
      注意：每块板应包含 24 个样品（每个 3 个重复），4 个空白（去离子水和酶），以及 8 个使用先前已表征标准生物质的对照。每块板四个角的 3 个角落孔位保留用于糖标准品。
    17. 检查空白孔和糖标准品孔中是否存在误入的生物质颗粒，如有则去除。
    18. 向每个孔中加入 250 µl 去离子水，并用带硅胶背衬的聚四氟乙烯（PTFE）密封膜密封板。
    19. 使用 1/8” 焊接烙铁头，在每块板的每个蒸汽孔（共 117 个）处刺穿 PTFE 密封膜。使用一个空板叠放在已密封的反应板上作为引导，并限制 PTFE 膜移动。
    20. 用厚度为 0.031” 的玻璃纤维增强 PTFE 垫片（预先打孔以匹配蒸汽孔）夹紧反应板，垫片置于板之间，上下各加一块空板。使用设定为 180 °C、持续 17.5 分钟的蒸汽反应器对样品进行预处理，或根据所需严重度选择其他温度/时间组合。
    21. 通过注入去离子水将反应板冷却至 50 °C。
  2. 酶解糖化
    1. 配制酶解糖化溶液，包含 8% (v/v) 酶溶液溶于 1.0 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）。每块反应板准备 5 ml。注意：稀释比例应根据特定储备酶溶液的活性和蛋白含量确定。
    2. 当板冷却后，在摆动转子离心机中以 1,500 x g 离心 20 分钟。移除密封膜。注意：这些板较重，应检查离心机规格是否兼容。
    3. 向每个孔中加入 40 µl 的 8% 酶储备溶液（每克生物质 70 mg 酶）。
    4. 用新的 PTFE 密封膜重新密封，并将密封后的板放入磁力板夹中。
    5. 通过倒置轻轻混合样品（至少 15 次），并在 50 °C 下孵育 70 小时。
    6. 糖化完成后，通过倒置混合，然后在 1,500 x g 下离心 20 分钟。
  3. 糖测定
    1. 在 0.014 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0）中配制一组 6 个葡萄糖和木糖联合校准标准品，浓度范围分别为 0 至 0.750 mg/ml（推荐：0、0.2、0.3、0.45、0.65 和 0.75 mg/ml）和 0 至 0.600 mg/ml（推荐：0、0.1、0.2、0.35、0.45 和 0.6 mg/ml）。
    2. 根据试剂盒说明书配制葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）和木糖脱氢酶（XDH）试剂。
    3. 使用移液器从反应板的 4 个角落孔及相邻边缘孔（共 12 个孔）中取出 200 µl 液体。
    4. 使用移液器向 96 孔聚苯乙烯平底稀释板的每个孔中加入 180 µl 去离子水。切勿向 12 个糖标准品孔和角落孔加水（若使用 96 通道移液头，请移除这些吸头）。
    5. 使用移液器向葡萄糖测定板的每个孔中加入 180 µl GOPOD 试剂。
    6. 使用移液器向木糖测定板的每个孔中加入 180 µl XDH 试剂。
    7. 使用移液器将 20 µl 水解液等分试样从 96 孔反应板转移至稀释板。从孔的上部取样，避免生物质固体及角落孔中的残留液体。通过反复吹吸混合至少 10 次。
    8. 使用移液器将 110 µl 糖标准品（双份）转移至稀释板的角落孔中。
    9. 使用移液器将 20 µl 等分试样从稀释板转移至葡萄糖和木糖测定板。通过反复吹吸混合。
    10. 将葡萄糖和木糖测定板在室温下孵育 30 分钟。读数前小心消除表面气泡。使用热风枪短暂吹扫板表面效果良好。
    11. 使用紫外/可见光 96 孔板读数仪，将检测波长设为 510 nm，以试剂空白为对照记录吸光度。该测量监测醌亚胺的生成，其与葡萄糖浓度成正比。葡萄糖浓度根据 1.3.1 步骤中制备的校准标准品绘制的校准曲线计算。
    12. 使用紫外/可见光 96 孔板读数仪，将检测波长设为 340 nm，记录吸光度。该测量监测 NAD+ 还原为 NADH，其与木糖浓度成正比。木糖浓度根据 1.3.1 步骤中制备的校准标准品绘制的校准曲线计算。

2. 利用pyMBMS高通量测定总木质素及木质素单体含量28

  1. 样品制备
    1. 使用步骤 1.1.1 以及 1.1.6–1.1.8 中所述方法对生物质进行研磨和提取。其中包括研磨和提取一组标准品，作为实验对照。
      注意：pyMBMS 测量结果不依赖于颗粒尺寸，因此如果仅使用 pyMBMS 方案，生物质样品的制备应确保其能够装入样品 holder，尺寸应小于 <4 mm。
    2. 使用小刮勺将约 4 mg（推荐 3 至 5 mg）制备好的生物质样品装入专为自动进样器设计的 80 µl 不锈钢样品杯中。
    3. 确保所分析的样品中至少有 10% 为对照标准品，例如美国国家标准与技术研究院（NIST）提供的标准品（甘蔗渣-8491；杨树-8492；松树-8493；或小麦秸秆-8494）。该标准品也可以是与待分析样品类似、且已通过标准方法表征过的任何物种。
    4. 使用镊子将样品随机装入自动进样器样品杯中，以避免因质谱仪随时间可能发生漂移而引入偏差。注意：典型的样品随机化方案包括先对所有样品进行一次测量，随后重新随机化样品顺序以进行重复测量。可在网上获取随机化程序。
    5. 使用标准打孔器，从无粘合剂的 A/D 型玻璃纤维滤纸片上手动制备玻璃滤膜圆片。用镊子夹住圆形玻璃纤维滤膜，将其居中置于样品杯上方，并使用 3.5 mm 的六角扳手将其压入样品杯中，以在实验过程中固定每个样品杯中的材料。
  2. 仪器操作流程
    1. 使用已知标准品对质谱仪进行校准，该标准品应在实验样品可能存在的所有化合物质量范围内均具有峰强度。对于典型的生物质样品，使用全氟三丁胺（PFTBA）作为标准品。
    2. 使用气体流量计将氦气载气流速设定为 0.9 L/min。
    3. 使用自动进样器软件将自动进样器炉温设置为 500 °C，接口温度设置为 350 °C。注意：一根 1/8 英寸不锈钢加热传输管线，外包保温带，连接自动进样器与质谱仪，其温度由温控器设定为 250 °C。
    4. 启动质谱仪的数据采集，并至少等待 60 秒，以获取足够的背景谱图数据。
    5. 启动自动进样器的自动化方法，参数依据 2.2.2 设置。注意：自动进样器将每个样品单独送入炉中。总数据采集时间约为 1.5 分钟；然而，典型 4 mg 样品的热解在 30 秒后即已完成。
    6. 使用质谱仪软件以 0.5 秒扫描速率记录每个样品的总离子流（TIC），记录 m/z 30 至 450 范围内的离子强度。
      注意：典型的生物质化合物采用 17 eV 的软电离方式。仪器可记录 m/z 1 至 1,000 的更宽范围；但扫描速率将受限于计算机 CPU 的处理能力。
    7. 使用软件中的手动增强功能从谱图中扣除背景。注意：数据采集初期基线的连续 60 次扫描用于计算平均背景值。该平均背景谱图将在质谱仪软件中自动从实验样品谱图中扣除。
    8. 将质谱仪软件生成的包含各样品谱图数据的单列文本文件导入数据库程序，并将所有样品数据合并为一个数据库。向电子表格中添加所有相关元数据。将格式化后的数据（电子表格/CSV 文件）导入统计分析软件，并对谱图进行均值归一化，以校正热解样品质量差异带来的影响。
    9. 使用统计分析软件，基于谱图数据进行主成分分析（PCA），以分析测量中所用重复标准品的聚类情况，并通过载荷图评估哪些峰对化学组分的分类具有关键作用28。
      注意：PCA 根据谱图相似性对样品进行聚类，可用于检查标准品的聚类情况，以评估运行过程中因仪器漂移导致的实验误差。
    10. 为计算木质素紫丁香基（S）/愈创木基（G）比值，将 S 峰（m/z = 154、167、168、182、194、208 和 210）的峰面积求和，再除以 G 峰（m/z = 124、137、138、150、164 和 178）峰面积的总和。
    11. 为计算总木质素含量，将 m/z = 120、124、137、138、150、152、154、164、167、178、180、182、194 和 210 的木质素相关峰面积求和。
    12. 计算校正因子，以将 pyMBMS 测量结果与标准方法（如 Klason 木质素法）测得的总木质素含量进行标定。将某一标准品的 Klason 木质素值除以其通过 pyMBMS 测得的总木质素含量，即得该校正因子。
    13. 将该校正因子应用于数据集中所有同种类型的样品。对每种分析的生物质类型重复此步骤。注意：校正因子可能因所分析生物质的 S/G 比值不同而显著变化。

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结果

通过测定实验结束时释放的葡萄糖和木糖的质量，来衡量热化学预处理与后续酶解糖化过程的联合作用效果。结果以每克生物质所释放的葡萄糖和木糖的毫克数表示。这与常规小规模实验所报告的数据形成鲜明对比，后者通常基于起始原料的组分分析，以理论得率的百分比形式表示。由于目前尚无法实现在每周数千个样品上开展组分分析，因此以质量为基础报告转化水平是更为可行的方式。只要比较的是组分相近且组成变化不大的生物质样品，该方法即可实现合理的样品评估。

该检测的主要目标是评估一系列不同植株变体的细胞壁在热化学/酶法联合糖化过程中相对抗性差异。需要指出的是，本检测并未尝试优化糖化过程中所使用的任何条件。事实上，预处理的剧烈程度被有意设定为显著低于最优水平，以扩大检测的灵敏度范围，使最终转化率目标控制在理论值的50%至70%之间。若采用最优或接近最优的预处理条件，将导致所有样品的转化率均趋于较高水平，从而大幅缩小检测的动态范围。相反，本方法中所用的酶添加量远高于常规实验室规模消化反应中通常报道的用量。同样，该方法的目的并非寻找最优酶制剂或最小化酶成本，而是测量细胞壁本身对转化的内在抗性，而使用极高的酶添加量有助于消除...

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讨论

进行高通量筛选实验时，为获得准确且可重复的数据，关键的样品制备步骤如下：

糖释放测定：

通常，样品以每批几十到数千个不等的规模进行制备。为了最大限度地减少样品间制备差异，每个主要步骤通常在所有样品上完成后再进入下一步。脱淀粉最初并非该方案的一部分，在某些情况下可以省略。木材心材样品和已衰老的草本材料中淀粉含量始终较低，因此无需脱淀粉即可降低变异。然而，对于绿色组织植物的样品集，尤其是采收持续数小时的大规模样品集，淀粉是一个主要问题。由于淀粉含量在白天逐渐升高，在夜间被消耗，因此在数小时内可能产生显著差异；且淀粉来源的葡萄糖与纤维素来源的葡萄糖无法区分，因此高淀粉含量可能导致抗降解性测量结果被错误地低估。脱淀粉步骤中的实际酶添加量并不关键，只要在淀粉水解步骤的时间范围内具有足够的过量酶活性以完全去除可及的淀粉即可。所用具体酶的种类、时间、温度、体积以及去淀粉步骤中的振荡速率等因素的变化，确实可能导致淀粉去除程度和速率的差异，应尽可能通过实验经验确定。最后，在用茶袋封装样品进行提取时，应使用镀锡铜丝。裸露的铜丝可能与酶溶液发生不必...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢实习生 Evelyn Von Neida，她在本论文所述的两种高通量流程的生物质样品制备方面提供了极为重要的见解。本研究及论文的开发工作得到了生物能源科学中心（BioEnergy Science Center）的支持。生物能源科学中心是由美国能源部科学办公室下属生物与环境研究办公室资助的美国能源部生物能源研究中心。国家可再生能源实验室（NREL）是美国能源部能源效率与可再生能源办公室的国家实验室，由可持续能源联盟有限责任公司（Alliance for Sustainable Energy, LLC）为美国能源部运营。本研究工作得到了美国能源部与国家可再生能源实验室签订的合同编号为 DE-AC36-08-GO28308 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Biomek FX 自动化工作站Beckman CoulterBiomek FX自动化液体处理仪
Wiley 粉碎机Thomas Scientific3375E15（型号 4）或 3383L20（迷你粉碎机）
防静电袋Minigrip*MGST4P025032.5×3"，多家供应商可提供
镀锡铜线McMaster-Carr8871K84直径 0.016"，可弯曲定型导线
茶包Herbcopress n' brew 茶包3.5×5 英寸
葡糖淀粉酶NovozymesSpirizyme Fuel 
α-淀粉酶NovozymesLiquozyme SC DS
三水合乙酸钠任意化学试剂供应商试剂级
乙酸任意化学试剂供应商试剂级
190 proof（95%）乙醇任意化学试剂供应商试剂级
进料斗Freeslate
96 孔 C-276 哈氏合金板Aspen Machining（科罗拉多州拉斐特）N/A（定制）
1/8” 焊接烙铁头Sears
带硅胶粘合剂的聚四氟乙烯胶带3M51803" 宽（36 码卷）
酶溶液NovozymesCellic CTec2
一水柠檬酸任意化学试剂供应商
二水合柠檬酸三钠任意化学试剂供应商
一次性聚苯乙烯 96 孔板Greiner Bio-One655101或同等产品；多家供应商可提供
葡萄糖氧化酶/过氧化物酶 MegazymeK-GlucMegazyme D-葡萄糖检测试剂盒
木糖脱氢酶MegazymeK-XyloseMegazyme D-木糖检测试剂盒
葡萄糖标准溶液MegazymeK-GlucMegazyme D-葡萄糖检测试剂盒
木糖标准溶液MegazymeK-XyloseMegazyme D-木糖检测试剂盒
不锈钢样品杯Frontier LaboratoriesPY1-EC80F
玻璃纤维片Pall662278×10" 片材；使用标准打孔器打成圆形
甘蔗渣全生物质原料NIST8491
东部棉白杨（杨树）全生物质原料NIST8492
蒙特雷松全生物质原料NIST8493
小麦秸秆全生物质原料NIST8494

参考文献

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