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细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

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DOI：

10.3791/53164

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2015年12月29日

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1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种构建感染性细菌人工染色体的实验方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组RNA的全长cDNA。该方案可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，因此是研究病毒生物学的有力基因组学工具。

摘要

反向遗传学是一种完全从克隆的cDNA拯救感染性病毒的技术，该技术已彻底改变了正链RNA病毒领域的研究，因为这类病毒的基因组与细胞mRNA具有相同的极性。基于cDNA的反向遗传系统是一种开创性方法，可直接操控病毒基因组RNA，从而生成重组病毒，用于研究病毒RNA元件及其基因产物在病毒复制和致病过程中的分子与遗传特性。该系统还提供了一个宝贵的平台，可用于开发基因定义明确的疫苗以及用于递送外源基因的病毒载体。然而，对于许多正链RNA病毒（如日本脑炎病毒（JEV））而言，克隆的cDNA往往不稳定，这为功能性cDNA的构建与扩增带来了主要障碍。本文报告介绍了构建和扩增遗传稳定的全长感染性JEV cDNA并将其作为细菌人工染色体（BAC）进行操作时所需的战略考量，所采用的通用实验流程包括：病毒RNA提取、cDNA合成、cDNA亚克隆与修饰、全长cDNA的组装、cDNA线性化、体外 RNA合成以及病毒恢复。本方案提供了一种通用的方法，适用于将多种正链RNA病毒（特别是基因组长度>10 kb者）的全长cDNA克隆至BAC载体中，从而可通过噬菌体RNA聚合酶在体外转录产生具有感染性的RNA。

引言

对于RNA病毒学家而言，20世纪70年代末重组DNA技术的出现使得将病毒RNA基因组转化为cDNA克隆成为可能，这些克隆随后可在细菌中以质粒形式扩增，从而实现对RNA病毒的遗传操作。1 首个被分子克隆的RNA病毒是噬菌体Qβ，一种感染细菌的正链RNA病毒 大肠杆菌含有Qβ基因组RNA完整cDNA拷贝的质粒在导入后可产生具有感染性的Qβ噬菌体 E. coli.2 此后不久，该技术被应用于脊髓灰质炎病毒——一种感染人类和动物的正义链RNA病毒。含有脊髓灰质炎病毒基因组RNA全长cDNA的质粒在转染哺乳动物细胞后具有感染性，并能产生具有感染性的病毒颗粒。3 在此 "DNA启动的" 方法中，克隆的cDNA应在细胞内转录以启动病毒RNA复制；然而，转录如何起始以及转录产物如何加工成正确的病毒序列尚不清楚。这一问题促使了另一种替代方法的开发 "RNA启动的" 方法，即将病毒RNA基因组的完整cDNA拷贝克隆至可被某种聚合酶识别的启动子下游 E. coli 或噬菌体RNA聚合酶用于合成RNA的制备 体外 具有明确的5'和3'末端，在导入宿主细胞后可完成完整的病毒复制周期。4,5 该方法首次成功应用于雀麦花叶病毒，6,7 一种植物正链RNA病毒。此后，RNA启动法已被开发用于多种正链RNA病毒，包括杯状病毒、甲病毒、黄病毒、动脉炎病毒和冠状病毒。1,4,5,8

在基于DNA和基于RNA的反向遗传学系统中，全长cDNA克隆的构建是产生正链RNA病毒的感染性DNA或RNA的关键，但随着病毒基因组长度的增加，这一过程会面临显著的技术挑战。9-17 特别是，长度约为10-32 kb的大RNA基因组给全长功能性cDNA的克隆带来了三个主要障碍。18 第一个难点是合成忠实地cDNA拷贝，因为逆转录PCR的保真度与病毒RNA的长度成反比。第二个障碍是可能存在潜在毒性序列，因为较长的RNA分子更可能含有意外序列，导致cDNA片段在质粒中不稳定 E. coli第三个也是最关键的问题是合适载体的可获得性，因为很难找到能够容纳病毒cDNA插入片段的克隆载体 >10 kb。在过去的三十年中，这些障碍已通过酶学、方法学和载体学的多项进展得以克服。1,4,5,8 在这些技术中，最具前景和创新性的进展是将大型正链RNA病毒克隆为具有感染性的细菌人工染色体（BAC）。BAC载体是一种基于F质粒的低拷贝克隆质粒（每细胞1-2个拷贝）， E. coli 生育力因子，平均DNA插入片段大小约为~120-350 kb。19-21 DNA片段以类似于克隆至通用克隆载体的方式插入BAC载体中；所获得的BAC克隆在多代培养中保持稳定 E. coli22,23 迄今为止，BAC 技术已被用于构建感染性 cDNA 克隆 >三个正义链RNA病毒科的10个成员 即, 黄病毒科,24-29动脉炎病毒科,30 和 冠状病毒科.9,16,17,31,32

以日本脑炎病毒（JEV）为例，本文报道了可用于构建多种正链RNA病毒的遗传稳定全长感染性细菌人工染色体（BAC）的详细操作步骤。JEV是一种人畜共患的黄病毒33，在自然界中通过蚊媒在鸟类、猪及其他脊椎动物宿主之间传播34,35。在人类中，JEV感染可引起严重的、常致死的神经系统疾病——日本脑炎（JE）36，该疾病流行于亚洲及西太平洋部分地区37,38，每年估计发生约50,000至175,000例临床病例39,40。JEV基因组为长约11 kb的单股正链RNA分子，包含一个由5'和3'端两个非编码区（NCRs）包围的单一开放阅读框（ORF）41,42。该ORF编码一种多聚蛋白，由宿主和病毒蛋白酶切割后生成10个独立蛋白，按N端至C端方向依次命名为C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS534,43,44。此外，NS1的一种延长形式（NS1'）通过NS2A基因第8至第9密码子处的-1核糖体移码表达产生45,46。在这11种蛋白中，三种结构蛋白（C、prM和E）对感染性病毒颗粒的形成至关重要47,48，其余八种非结构蛋白（NS1至NS5及NS1'）在病毒RNA复制49-51、病毒粒子组装52-56以及逃逸先天免疫57-59过程中发挥关键作用。5'和3'端NCR均含有保守的一级序列，并可形成RNA二级/三级结构60-62，对调控病毒RNA复制具有重要意义63,64。

本方案描述了构建全长感染性乙型脑炎病毒SA14-14-2 BAC的工具、方法和策略28。该功能性BAC克隆包含乙型脑炎病毒基因组RNA的完整cDNA拷贝65，其5'端上游包含SP6 RNA聚合酶启动子，3'端下游含一个独特的Xba I限制性酶切位点，可用于体外加尾转录。in vitro run-off转录。该BAC技术适用于构建多种正义链RNA病毒的完全功能性cDNA分子克隆。

方案

注：图1 展示了构建全长感染性JEV cDNA作为BAC的策略。28 表1 列出了本方案中使用的寡核苷酸序列。28

1. 从细胞培养上清液中的乙型脑炎病毒颗粒中提取病毒RNA

  1. 从含有 JEV SA 的细胞培养基开始14-14-2，一种需要生物安全二级防护的活体日本脑炎疫苗病毒。
    注意：病毒滴度约为 1-3 × 106 空斑形成单位/毫升
  2. 在使用乙型脑炎病毒SA株（JEV SA）前，需完成所有标准微生物学操作、安全设备和实验室设施所必需的生物安全培训。14-14-2.
  3. 使用苯酚和异硫氰酸胍单相溶液从含有病毒的细胞培养基的等分试样中纯化病毒RNA66 (图1A).
    1. 向1.7 ml微量离心管中的200 µl培养上清液加入600 µl单相试剂，用力振荡混匀30秒，室温孵育5分钟。
    2. 向匀质化的样品中加入 160 µl 氯仿。用力振荡试管 15 秒，充分混匀，室温下静置 2–3 分钟。
    3. 在 4 °C 条件下以 13,400 × g 离心总裂解液 15 分钟，导致分离出两层液体相， 即下层为有机相，上层为水相。将含有RNA的上层水相（少于200 µl）转移至新的微量离心管中。
    4. 加入1 µl浓度为5 µg/µl的糖原和400 µl 100%异丙醇，室温孵育10分钟，使RNA沉淀。
    5. 在 4 °C 条件下，以 13,400 × g 离心 10 分钟，使混合物沉淀。弃去上清液，加入 1 mL 75% 乙醇，通过脉冲式涡旋振荡 3 至 5 次重悬 RNA 沉淀，随后在 4 °C 条件下，以 13,400 × g 离心 5 分钟。
    6. 将RNA沉淀在空气中干燥10分钟，并溶于40 µl的dH₂O中2O. 将提取的RNA于-80 °C保存，直至使用。

2. 通过逆转录（RT）-PCR 合成一组四个覆盖整个病毒基因组 RNA 的重叠 cDNA 片段（F1 至 F4）

  1. 以 10 µl 纯化的病毒 RNA 为模板，使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的改良形式进行 20 µl 的逆转录（RT）反应。67
    1. 配制 13 µl 的混合液，其中包含 10 µl 纯化的 RNA、1 µl 10 mM dNTP 混合物、1 µl 4 pmol/µl 的引物和 1 µl dH2O。每个 RT 反应使用片段特异性引物：F1 使用 1RT，F2 使用 2RT，F3 使用 3RT，F4 使用 4RT。
    2. 将混合物在 65 °C 下孵育 5 分钟，然后置于冰上 1 分钟，快速离心以使液体沉降至管底。
    3. 加入 4 µl 5× RT 缓冲液、1 µl 0.1 M DTT、1 µl 40 U/µl RNase 抑制剂和 1 µl 200 U/µl 逆转录酶。通过移液吹打 3 至 5 次混匀。
    4. 在 50 °C 下反应 1 小时，随后在 70 °C 下加热灭活 15 分钟。将合成的第一链 cDNA 储存于 -20 °C，待用。
  2. 以 5 µl 热灭活后的 RT 反应产物为模板，使用高保真耐热 DNA 聚合酶进行 100 µl 的 PCR 反应68（图 1B）。
    1. 在冰上配制 100 µl 的 PCR 反应体系，包含 5 µl RT 反应产物、20 µl 5× PCR 缓冲液、4 µl 10 mM dNTP 混合物、5 µl 10 µM 正向引物、5 µl 10 µM 反向引物、1 µl 2 U/µl DNA 聚合酶和 60 µl dH2O。每个 PCR 反应使用片段特异性引物对：F1 使用 1F+1R（2573 bp），F2 使用 2F+2R（4171 bp），F3 使用 3F+3R（3922 bp），F4 使用 4F+4R（1798 bp）。
    2. 用手指轻弹管壁 3 至 5 次轻轻混匀，短暂离心以使液体沉降至管底。
    3. 开始热循环程序：98 °C 预变性 30 秒，随后进行 25–30 个循环，每个循环包括：98 °C 变性 10 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1–2 分钟（按 30 秒/千碱基计算）。PCR 产物分析前储存在 4 °C。
  3. 取每种 PCR 反应产物 2–5 µl，在含有 0.5 µg/ml 溴化乙锭（EtBr）的 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳（图 2）。
    注意：溴化乙锭（EtBr）为强效诱变剂，使用、储存和处理时必须穿戴实验服、安全眼镜和手套，并采取极端谨慎的防护措施。

3. 通过分子克隆技术将四个cDNA片段（F1至F4）分别亚克隆至BAC载体，构建pBAC/F1至pBAC/F4

  1. 使用两种合适的限制性内切酶对载体和插入DNA进行酶切消化，步骤如下：
    1. 对pBAC/PRRSV/FL（载体）进行连续消化处理30 pBeloBAC11 质粒（7507 bp，GenBank 登录号 U51113）的一种衍生物，带有 Pme 我与 不 在37 °C下，将约500 ng DNA、10 U酶、1×消化缓冲液和1×BSA混合至终体积60 µl，消化12–15小时，得到15426 bp的载体片段。
    2. 对四个cDNA扩增子（插入片段）分别进行依次消化 Sma 我与 不 在25 °C下，于60 µl总体积（含约1 µg DNA、20 U酶、1×消化缓冲液和1×BSA）中进行反应Sma I）或 37 °C（不 I）过夜孵育12-15小时，得到以下目标大小的插入片段：F1（2559 bp）、F2（4157 bp）、F3（3908 bp）和F4（1784 bp）。
  2. 通过凝胶回收纯化目的载体和插入DNA片段。
    1. 在含有0.5 µg/ml溴化乙锭的1%低熔点琼脂糖凝胶上分离双酶切产物。在长波紫外光下切取所需DNA片段条带，尽量减少琼脂糖用量（通常约为200 µl）。
    2. 加入等体积的TEM缓冲液（10 mM Tris-Cl，1 mM EDTA和10 mM MgCl₂）2将样品加入含有切下的琼脂糖的1.7 ml微量离心管中。在72 °C孵育10–15分钟，每2–3分钟涡旋振荡一次，直至琼脂糖完全融化。
    3. 加入等体积预热的缓冲液饱和酚，剧烈涡旋震荡1分钟，然后在室温下以13,400 × g离心10分钟。
      注意：混合物会分离为下层有机相和上层水相。将含有DNA的上层水相转移至新的微量离心管中。
    4. 加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），涡旋混匀1分钟，室温下13,400 × g离心10分钟。将上层水相转移至新的微量离心管中。
    5. 加入0.5 µl浓度为10 µg/µl的酵母tRNA、1/10体积的3 M醋酸钠和2.5体积的100%乙醇。将混合物置于冰上孵育20分钟。
    6. 在室温下以13,400 × g离心10分钟。弃去上清液，加入1 ml 70%乙醇，通过脉冲式涡旋振荡3至5次洗涤DNA沉淀，然后在13,400 × g下离心10分钟。
    7. 将DNA沉淀在空气中干燥10分钟，然后溶于20 µl TE缓冲液（10 mM Tris-Cl和1 mM EDTA [pH 7.6]）中。
  3. 使用T4 DNA连接酶将目标载体与插入DNA片段进行连接。
    1. 设置一个20 µl连接反应体系，包含50–100 ng载体DNA、约3倍摩尔过量的插入片段DNA、400 U T4 DNA连接酶和1×连接缓冲液。将连接反应体系在16 °C孵育12–15小时。
      注意：需设置阴性对照反应， 即，仅含载体而无插入片段，平行进行。
    2. 进行四次独立的连接反应，每次连接均将15426-bp Pme I-不 pBAC/PRRSV/FL 的 I 片段，大小分别为 2559-bp（F1）、4157-bp（F2）、3908-bp（F3）或 1784-bp（F4） Sma I-不 将四个cDNA扩增片段之一的I片段进行克隆，以生成亚克隆pBAC/F1至pBAC/F4。
  4. 将连接的DNA转化进入 大肠杆菌 DH10B通过CaCl₂处理2-热激法
    1. 取100 µl等份的CaCl₂溶液2经处理的感受态DH10B细胞69 在 -80 °C 下保存，并在冰上解冻。
      注意：每次转化使用 100 µl 细胞。
    2. 将10 µl DNA连接反应产物加入1.7 ml微量离心管中的100 µl解冻细胞中，轻轻敲击管壁混匀，冰上静置30 min。
    3. 将DNA-细胞混合物在42 °C水浴中热激45秒，置于冰上2分钟，然后加入900 µl预热至室温的LB培养基。
    4. 将热激后的细胞在35 °C、225-250 rpm振荡条件下孵育1小时。
    5. 将培养的细胞以50至200 µl的体积涂布于含有10 µg/ml氯霉素（Cml）的LB琼脂平板上。将平板正置，于室温放置直至干燥。
    6. 将平板倒置，在35 °C下孵育15小时。
  5. 通过基于柱纯化的方法从宿主细胞中回收克隆的BAC DNA（图1C).
    1. 从LB-Cml琼脂平板上挑取六至八个细菌菌落，接种于3 ml含有10 µg/ml Cml的2xYT液体培养基中。在35 °C下以225–250 rpm剧烈振荡培养10小时。
    2. 使用离心柱，按照制造商说明从1-1.5 ml细菌培养物中分离重组BAC DNA。70 将提取的DNA（通常为100-200 ng）溶于20 µl TE缓冲液中。
    3. 对分离的BAC进行两次分析性限制性酶切消化，总体积为10 µl，消化时间约为6小时。其中一次酶切使用克隆时所用的相同限制性内切酶（参见方案3.1），用于鉴定载体中是否存在正确的插入片段；另一次酶切则选用适当的限制性内切酶，用于检测克隆获得的BAC的完整性。例如, Bgl 二， Nco 我，或 Pst I），产生一种独特的限制性片段模式。
    4. 将正确的克隆BAC接种于500 ml 2xYT-Cml培养基中，接种量为500 µl阳性菌液（来自方案3.5.1），在35 °C、225–250 rpm振荡条件下培养6小时，以扩增BAC。按照制造商的建议，使用滤柱从500 ml培养物中纯化BAC DNA（通常可获得10–20 µg）。71
      注意：与病毒基因组的共识序列相比，最初的四个BAC亚克隆（每个均包含一段JEV基因组RNA的cDNA片段）可能含有一个或多个非预期的突变42 （作为参考序列）。在组装全长JEV cDNA之前，任何此类突变均需通过基于PCR的定点突变技术进行校正。27

4. 构建带有5' SP6启动子和3'终止位点的全长JEV cDNA

  1. 进行三项遗传修饰（见下文方案 4.1.1–4.1.3），以对克隆的 cDNA 实现 体外 带有病毒基因组真实5'和3'末端的全长基因组RNA的加尾转录
    1. 通过重叠延伸PCR在病毒基因组5'端上游直接引入SP6启动子图1D， pBAC/F1SP6).
      1. 使用SP6F+SP6R（产物大小173 bp）和F1F+F1R（产物大小676 bp）两对引物，分别对pBAC/F1进行第一轮标准PCR，扩增出两个重叠的DNA片段。每个50 µl反应体系包含1 µl模板DNA（~200 pg/µl）、10 µl 5× PCR缓冲液、2 µl 10 mM dNTPs、各2.5 µl的10 µM正向和反向引物、0.5 µl 2 U/µl DNA聚合酶。68 和 31.5 µl dH₂O2O. 使用以下扩增程序进行PCR：98 °C 预变性30秒，然后进行25个循环，每个循环为98 °C 变性10秒、60 °C 退火30秒、72 °C 延伸20秒。
      2. 按照方案3.2所述，将两份PCR产物在1.5%低熔点琼脂糖凝胶上电泳后，对两种PCR扩增的DNA片段进行凝胶纯化。
      3. 通过第二次融合PCR，使用最外侧引物SP6F+F1R（产物大小为821 bp）将两个经凝胶纯化的DNA片段融合。反应体系为100 µl，包含：各1 µl的两种纯化后DNA片段（~100 pg/µl）、20 µl 5× PCR缓冲液、4 µl 10 mM dNTPs、各5 µl 10 µM的正向与反向引物、1 µl 2 U/µl DNA聚合酶。68 和 63 µl dH₂O2O. 使用以下热循环程序：98 °C 预变性 30 秒，然后进行 25 个循环，每个循环为 98 °C 变性 10 秒、60 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒。
      4. 按照方案 3.2 所述，从 1% 低熔点琼脂糖凝胶中纯化融合的 PCR 扩增产物。
      5. 执行第3.1–3.5节所述的五步克隆程序，连接760-bp片段 Pac I-Bsi凝胶纯化的融合PCR扩增片段的W I片段，长度为9532 bp Pac I-BsipBAC/F1 的 W I 片段用于构建 pBAC/F1SP6.
    2. 移除已有的内部结构 Xba 在核苷酸9131位点引入同义点突变（A9134→T）通过重叠延伸PCR（图1D， pBAC/F3敲除).
      1. 使用引物对 X1F+X1R（产物大小 746 bp）和 X2F+X2R（产物大小 316 bp），在 50 µl 反应体系中，按照方案 4.1.1.1 所述实验条件，通过第一轮标准 PCR 对 pBAC/F3 进行扩增，获得两个重叠的 DNA 片段。
      2. 按照方案3.2中的说明，在1.5%低熔点琼脂糖凝胶上电泳分离后，对两个PCR扩增的DNA片段进行凝胶纯化。
      3. 使用最外侧引物X1F和X2R，通过第二次融合PCR将两个经凝胶纯化的DNA片段连接，反应体系为100 µl，反应条件同方案4.1.1.3中所述（产物大小为1033 bp）。
      4. 从1%低熔点琼脂糖凝胶中纯化融合的PCR扩增产物，具体步骤见方案3.2。
      5. 执行第3.1–3.5节所述的五步克隆程序，连接949-bp片段 Avr 第二部分不 凝胶纯化的融合PCR扩增片段I，长度为16245 bp 否 I-BsiW I 和 2141-bp BsiW I-Avr pBAC/F3 的 II 型片段以生成 pBAC/F3敲除.
    3. 构建一种新型人工 Xba 在病毒基因组3'端下游通过基于PCR的定点诱变进行截短图1D， pBAC/F4RO).
      1. 使用引物ROF和ROR对pBAC/F4进行PCR扩增，生成一个DNA片段（产物大小为324 bp）。反应体系为100 µl，包含1 µl模板DNA（~200 pg/µl）、20 µl 5× PCR缓冲液、4 µl 10 mM dNTPs、各5 µl的10 µM正向和反向引物、1 µl 2 U/µl DNA聚合酶。68 和 64 µl dH₂O2O. 使用以下扩增程序进行PCR：98 °C 预变性30秒，然后进行25个循环，每个循环为98 °C 变性10秒、60 °C 退火30秒、72 °C 延伸15秒。
      2. 从1%低熔点琼脂糖凝胶中纯化PCR扩增的DNA片段，具体步骤见方案3.2。
      3. 执行第3.1–3.5节所述的五步克隆程序，连接283-bp Sfi I-不 对经凝胶纯化的PCR扩增产物进行片段化，片段大小为16933碱基对 Sfi I-不 将 pBAC/F4 的 I 片段进行切割以构建 pBAC/F4RO.
  2. 将四段经过修饰且相互重叠的cDNA组装成一条完整的全长SA14-14-2 BAC（pBAC/SA14-14-2）通过在三个天然限制性位点连接而成（BsrG I, BamH I，和 Ava I) 按照方案 3.1-3.5 中详述的五步克隆程序，以顺序方式进行（图1EF1SP6 → F1SP6F2（通过替换） BsrG I-不 pBAC/F1 的 I 片段SP6 与pBAC/F2相比）→ F1SP6F2F3基因敲除 （通过替换） BamH I-不 pBAC/F1 的 I 片段SP6F2 与 pBAC/F3 的比较敲除) → F1SP6F2F3敲除F4RO （通过替换） Ava I-不 pBAC/F1 的 I 片段SP6F2F3敲除 与pBAC/F4的相比RO).

5. 制备高纯度的全长SA14-14-2 BAC 大量提取物

  1. 将含有 pBAC/SA14-14-2 的 E. coli DH10B 单菌落接种于 3 ml 含 10 µg/ml 氯霉素（Cml）的 2xYT 液体培养基中，于 35 °C、225–250 rpm 振荡培养 10 小时，然后取 500 µl 该菌液接种至 500 ml 含氯霉素的 2xYT 培养基中，于 35 °C 剧烈振荡培养 6 小时。
  2. 将菌液分装至两个 250 ml 离心瓶中，于 4 °C、3,107 × g 离心 15 分钟。将每份沉淀重悬于 30 ml GTE 溶液（50 mM 葡萄糖、25 mM Tris-Cl 和 10 mM EDTA [pH 8.0]）中，再加入 500 µl 60 mg/ml 溶菌酶。将两份细胞悬液置于冰上孵育 10 分钟。
  3. 向每份细胞悬液中加入 60 ml 新鲜配制的裂解液（0.2 N NaOH 和 1% SDS），充分混匀至溶液澄清，并于室温放置 10 分钟。
  4. 向每瓶中加入 45 ml 中和液（100 ml，含 60 ml 5 M 醋酸钾、11.5 ml 冰醋酸和 28.5 ml dH2O），通过反复倒置瓶子彻底混匀，并将中和后的裂解液置于冰上孵育 10 分钟。
  5. 于 4 °C、18,566 × g 离心 20 分钟。将两瓶上清液转移至两个新的 250 ml 离心瓶中，每瓶加入 0.6 倍体积的 100% 异丙醇，并于冰上放置 20 分钟。
  6. 于 4 °C、18,566 × g 离心 20 分钟以沉淀析出物。将每份沉淀溶解于 5 ml TE 缓冲液中，合并至一个 50 ml 离心管中（总体积 10 ml），通过加入等体积的 5 M 氯化锂沉淀 RNA。将混合物置于冰上孵育 10 分钟。
  7. 于 4 °C、14,636 × g 离心 20 分钟以沉淀 RNA。将上清液转移至一个新的 250 ml 离心管中，加入 2 倍体积的 100% 异丙醇以沉淀 DNA。将混合物置于冰上孵育 20 分钟。
  8. 于 4 °C、18,566 × g 离心 20 分钟以沉淀 DNA。吸除上清液，将 DNA 沉淀重悬于 9.5 ml TE 缓冲液（pH 7.6）中，加入 10 g 氯化铯（CsCl）和 390 µl 10 mg/ml 溴化乙锭（EtBr）。
  9. 使用带有 18 G 针头的注射器将 DNA-CsCl-EtBr 溶液装入一支 16 × 76 mm 可密封的聚丙烯离心管中。在超速离心机中于 20 °C、401,700 × g 离心 16 小时（图 3）。
  10. 使用 18 G 针头在梯度液顶部制造通气孔，再用带有 20 G 针头的注射器从梯度液侧面收集 BAC 质粒 DNA 条带。
  11. 向经溴化乙锭染色的 BAC DNA 样品中加入 2.5 倍体积的经 dH2O 饱和的正丁醇，涡旋混匀。于 13,400 × g 离心 1 分钟，将下层水相转移至新的 1.7 ml 微量离心管中。重复此步骤六次。
  12. 向经丁醇萃取的 BAC DNA 中加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和 2.5 倍体积的 100% 乙醇，于冰上孵育 10 分钟，以沉淀去除溴化乙锭的 BAC DNA。于 13,400 × g 离心 10 分钟，用 1 ml 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，再次离心收集沉淀。
  13. 将 DNA 沉淀室温干燥 10 分钟，溶解于 200 µl TE 缓冲液（pH 7.6）中。
    注：图 4 展示了乙型脑炎病毒 SA14-14-2 反向遗传系统的整体流程。

6. 合成RNA的转录 体外 来自线性化的全长JEV BAC DNA

  1. 在总体积为 100 µl（含 3 µg DNA、60 U 酶、1× 消化缓冲液和 1× BSA）的体系中，用 Xba I 对 pBAC/SA14-14-2 进行大规模限制性酶切，37 °C 反应 12–15 小时。取 3 µl 消化反应产物，在含 0.5 µg/ml EtBr 的 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
  2. 将酶切反应产物进一步与 25 U 蚕豆芽素核酸酶（MBN）在 30 °C 孵育 2 小时（图 4A）。
  3. 用 dH2O 将经 Xba I 酶切并经 MBN 处理的样品体积补至 300 µl。向稀释后的样品中加入等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），剧烈涡旋振荡 1 分钟，13,400 × g 离心 10 分钟，然后将上层水相转移至新的 1.7 ml 微量离心管中。加入等体积氯仿，重复提取步骤一次。
  4. 通过乙醇沉淀回收经酚/氯仿提取的线性化 BAC：加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠和 2.5 倍体积的 100% 乙醇，冰上孵育 20 分钟。13,400 × g 离心 10 分钟以沉淀 DNA，用 1 ml 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，再通过重新离心收集沉淀。
  5. 将 DNA 沉淀室温干燥 10 分钟，溶于 30 µl dH2O 中。取 1 µl 回收的 BAC 样品，在含 0.5 µg/ml EtBr 的 0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳分析（图 5A）。
  6. 对线性化的 BAC DNA 进行截短式转录（run-off transcription），总体积为 25 µl（含约 200 ng 模板 DNA、0.8 mM 帽类似物 [m7G(5')ppp(5')A]、1 mM rNTPs、40 U RNase 抑制剂、20 U SP6 RNA 聚合酶72 和 1× 转录缓冲液），37 °C 反应 1 小时（图 4B）。为基于 [3H]UTP 掺入量进行 RNA 定量，可加入 0.5 µM [3H]UTP，并通过其在 DE-81 滤纸上的吸附情况进行监测69。
  7. 取 1–2 µl 截短式转录反应产物，在含 0.5 µg/ml EtBr 的 0.6% 琼脂糖凝胶上进行电泳（图 5B）。

7. 确定RNA感染性与病毒产量

  1. 将BHK-21细胞以每皿3 × 106个细胞的密度接种于150 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
    注意：BHK-21细胞使用含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、维生素以及青霉素/链霉素的α最低必需培养基进行维持培养。
  2. 用10 ml冷的溶液A（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4和1.5 mM KH2PO4）冲洗细胞单层，再加入4 ml胰蛋白酶-EDTA（0.25%）处理使细胞脱离培养皿，随后在台式离心机中以270 × g离心2分钟收集细胞。
  3. 将细胞沉淀重悬于50 ml锥形管中的50 ml冷溶液A中，于270 × g离心2分钟。重复该洗涤步骤三次；最后一次洗涤后，将细胞沉淀以2 × 107个细胞/ml的密度重悬于Sol A中。
  4. 取400 µl细胞悬液与2 µg合成RNA在2 mm间隙电穿孔杯中混合，并立即在最佳电穿孔条件下使用电穿孔仪进行电穿孔：980 V、脉冲时长99 µsec、共5次脉冲（图4C）。
    注意：Protocol 6.5中合成的3H标记RNA可直接用于电穿孔，无需进一步纯化。
  5. 将电穿孔后的细胞在室温下静置10分钟，然后转移至含有600 µl完全培养基的1.7 ml微量离心管中。
  6. 将电穿孔后的细胞在1 ml完全培养基中进行10倍系列稀释，取每种稀释液100 µl接种于6孔板中未电穿孔的BHK-21细胞单层（5 × 105个细胞）上。
  7. 孵育4–6小时后，用含10%胎牛血清的最低必需培养基配制的0.5%琼脂糖覆盖细胞。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下继续孵育4天。
  8. 通过7%甲醛固定并用含5%乙醇的1%结晶紫染色来观察感染灶（空斑）27（图6A）。
    1. 可选步骤：转染后18–20小时，通过免疫荧光检测法检测RNA电穿孔细胞中日本脑炎病毒（JEV）蛋白的表达情况27,73（图6B）；并在转染后22小时和40小时收集RNA电穿孔细胞的上清液，通过空斑实验进行病毒滴度测定27,63（图6C）。

结果

对于所有正义链RNA病毒而言，反向遗传系统的可靠性和效率取决于克隆的全长cDNA的遗传稳定性，该cDNA序列与病毒基因组RNA的共识序列相对应。27 图1 展示了一种五步策略，用于构建全长感染性cDNA作为乙脑病毒SA株的BAC14-14-228第1步：从感染JEV的BHK-21细胞的细胞培养上清液中纯化病毒RNA图1A）；第二步，合成覆盖整个病毒基因组的四个重叠cDNA扩增子（F1至F4）（图1B）；步骤3，将四个连续的cDNA片段分别亚克隆至BAC载体，构建pBAC/F1至pBAC/F4（图1C）；步骤 4，对克隆的 cDNA 进行修饰以 体外 SP6 RNA聚合酶体外转录 即，在病毒5'端上游紧邻处插入SP6启动子序列（pBAC/F1）SP6），消除已有的内部 Xba 在核苷酸9131位点引入一个同义点突变A以创建I位点9134→T (pBAC/F3基因敲除），并插入一种新型人工 Xba 紧接病毒3'-端下游的跑出位点（pBAC/F4）RO) (图1D）；以及第5步，全长SA的组装14-14-2 cDNA BAC，pBAC/SA14-14-2 (图1E). 表1 列出了本克隆实验中所使用的寡核苷酸序列。28

为了构建具有功能性的JEV全长cDNA，首要步骤是以纯化的病毒RNA为模板，通过RT-PCR合成四个相互重叠的cDNA片段。图2展示了将四个RT-PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳后的典型结果。该凝胶图像清晰表明，JEV全长cDNA已被扩增为四个相互重叠的cDNA片段。在某些情况下，由于引物在cDNA合成或扩增过程中发生非特异性结合，RT-PCR反应可能会产生一种或多种额外的病毒特异性或非特异性产物，这些产物通常小于预期目标产物。另一方面，若在病毒RNA提取过程中意外引入RNase污染，或RT-PCR操作不当，则可能导致几乎无法扩增出预期的RT-PCR产物。

下一步关键步骤是将部分或全长JEV cDNA克隆并修饰到BAC中，该过程相对简单，采用标准的重组DNA技术即可完成。69 图3 展示了含有JEV SA全长cDNA的BAC克隆纯化的代表性结果14-14-2 通过 CsCl-EtBr 梯度离心分带获得。在本实验中，经过 401,700 × g 离心 16 小时后，出现两条明显条带， 即，该 E. coli 染色体DNA位于上方，超螺旋BAC质粒DNA位于下方，两者在长波紫外光下可见于试管中央。最小体积（约400 µl用注射器在管壁侧面穿孔，小心收集下方的BAC DNA条带。随后通过丁醇抽提去除BAC DNA中的溴化乙锭（EtBr），再通过乙醇沉淀浓缩不含溴化乙锭的BAC DNA。

最后一步是测定体外转录合成RNA的特异性感染性 体外 来自全长的SA14-14-2 BAC (pBAC/SA14-14-2）在RNA转染入易感细胞后（图4）。此步骤包括三个连续步骤：步骤1，全长SA的线性化；14病毒基因组3'端的-14-2 cDNA（图4A）；第二步，通过加尾转录从线性化cDNA合成RNA（run-off transcription）图4B）；以及第3步，在转染了合成RNA的BHK-21细胞中拯救重组病毒（图4C）。实验中，使用了两种独立的pBAC/SA克隆14-14-2 用...进行线性化处理 Xba I型消化并用MBN处理以去除由 Xba I 消化。线性化的 BAC 通过酚-氯仿抽提纯化，随后进行乙醇沉淀。两种纯化后 BAC 的线性化结果通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳验证。图 5A）。苯酚-氯仿抽提必须小心操作，以确保线性化的BAC不含RNase。两种线性化的BAC分别作为cDNA模板，在SP6 RNA聚合酶作用下进行加帽的体外转录，同时加入m7G(5')ppp(5')A 帽类似物。通过将两个体外转录反应混合物的等分试样与参照的1 kb DNA ladder一同在0.6%琼脂糖凝胶上电泳，验证合成RNA的完整性。图 5B). 在此简易检测中，主要的显著RNA条带始终迁移至3 kb参考DNA条带略下方，且呈现清晰锐利的形态。然而，降解的RNA在同一凝胶上则会呈现弥散模糊的外观。

感染灶检测法是测定合成RNA特异性感染活性的金标准。该检测通过将RNA样本电穿孔转染至BHK-21细胞，随后将等量的10倍系列稀释的电穿孔细胞接种于含 naive BHK-21细胞的6孔板中（3 × 105 细胞/孔），并将琼脂糖覆盖于细胞单层上。孵育4天后，用甲醛固定存活的细胞，并用结晶紫溶液染色，以定量感染中心（空斑）的数量，该数量对应于递送至细胞内的感染性RNA分子数（图 6A）。由于用于的cDNA模板 体外 转录已被证实不具有感染性，27 将转录反应混合物的一部分直接用于电穿孔。电穿孔是RNA转染的首选方法； alternatively，RNA也可通过DEAE-葡聚糖和阳离子脂质体等其他方法进行转染。RNA电穿孔效率很高，但如果电穿孔反应中存在盐类或电穿孔比色皿被重复使用，则偶尔会发生电脉冲“电弧”现象。通过免疫荧光检测，使用抗NS1兔抗血清检测RNA转染细胞中病毒蛋白的表达图6B). 通过噬斑实验分析了RNA转染细胞上清液中积累的病毒颗粒的产生情况（图6C实验结果明确表明，cDNA衍生的合成RNA在允许性BHK-21细胞中具有感染性，能够产生高滴度的重组病毒。

寡核苷酸序列a（5' 至 3'）位置b极性
1RTTAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT		2578–2603反义链
1FaatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT		1–22有义链
1RattgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT		2532–2553反义链
2RTTTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA		5975–6000反义链
2FaatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT		1800–1821有义链
2RattgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC		5929–5950反义链
3RTACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT		9426–9451反义链
3FaatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT		5500–5521有义链
3RattgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT		9380–9401反义链
4RTAGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA		10952–10977反义链
4FaatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA		9200–9221有义链
4RattgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC		10956–10977反义链
SP6Fcataccccgcgtattcccac
ta		有义链
SP6RACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa		1–14反义链
F1FaggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG		1–17有义链
F1RTGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA		638–662反义链
X1FCGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG		8403–8427有义链
X1RAAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC		9120–9148反义链
X2FGGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT		9120–9148有义链
X2Rcacgtggacgagggcatgcc
tgcag		反义链
ROFCCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC		10670–10694有义链
RORagggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC		10954–10977反义链
aJEV 序列以大写字母表示，BAC 序列以小写字母表示。
b核苷酸位置参考日本脑炎病毒 SA14-14-2 完整基因组序列（GenBank 登录号 JN604986）。

表1：用于cDNA合成、PCR扩增和BAC诱变的寡核苷酸。

Viral RNA isolation and full-length cDNA assembly diagram, including cDNA synthesis, subcloning, and modification processes.
图1. 日本脑炎病毒SA株全长cDNA构建策略14-14-2 作为 BAC。 (A) 从JEV颗粒中分离病毒RNA。图示为JEV SA基因组RNA的示意图14-14-2. (B) 合成覆盖整个病毒基因组的四个重叠cDNA片段（F1至F4）。C将四个重叠的cDNA片段亚克隆至BAC载体中，构建pBAC/F1至pBAC/F4。D) 克隆 cDNA 的修饰以进行加尾转录 体外pBAC/F1SP6 是 pBAC/F1 的一个衍生物，其在病毒 5' 端上游含有 SP6 启动子序列。pBAC/F3敲除 是 pBAC/F3 的一个衍生物，包含一个同义点突变（A9134→T，星号）。pBAC/F4RO 是 pBAC/F4 的一种衍生物，含有一个人工合成的 Xba 病毒3'端下游的游离片段。E) SA全长的组装14-14-2 BAC (pBAC/SA14-14-2). 请点击此处以查看此图的放大版本。

凝胶电泳结果；按千碱基大小分离的DNA；显示分子量标记物。
图2. 覆盖JEV SA14-14-2全长基因组RNA的四个重叠cDNA片段（F1至F4）的合成。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳对四个RT-PCR产物进行分析。M，1 kb DNA ladder。四个cDNA片段的预期大小已在凝胶图像底部标出。请点击此处查看该图的放大版本。

氯化铯密度梯度离心分离染色体DNA、BAC DNA和RNA；示意图。
图3. 含有JEV SA14-14-2全长cDNA的BAC的纯化。 采用SDS-碱裂解法从E. coli DH10B中提取BAC质粒，再通过CsCl-EtBr密度梯度离心进行条带收集以进一步纯化。图中展示的是使用16 × 76 mm可密封聚丙烯管进行CsCl-EtBr梯度离心的示例。请点击此处查看该图的放大版本。

cDNA linearization and RNA synthesis diagram; virus recovery via RNA transfection; genetic process.
图4. 从全长JEV SA中恢复感染性病毒的概述14-14-2 cDNA 在 BAC 中组装 (A) cDNA 模板的线性化。全长 JEV BAC 用限制性内切酶切割 Xba 我并用 MBN 处理。 (B) RNA转录物的合成。在m存在的情况下，线性化的cDNA由SP6 RNA聚合酶进行转录7G(5')ppp(5')A 帽类似物。C合成JEV的回收。 体外 将转录的RNA通过电穿孔转染至BHK-21细胞，以产生高滴度的合成病毒。 请点击此处以查看此图的放大版本。

cDNA 模板和 RNA 转录本的凝胶电泳图；按碱基对大小分离 DNA。
图 5. 利用全长 JEV BAC 作为 cDNA 模板，通过体外转录合成 RNA。（A）线性化全长 JEV BAC pBAC/SA14-14-2 的制备。两个独立的 pBAC/SA14-14-2 克隆（Cl.1 和 Cl.2）经 Xba I 酶切并随后用 MBN 处理，实现线性化。通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测线性化的 BAC。(B) 通过截断式转录生成合成 RNA。以上述两种线性化 BAC 分别作为模板，进行 SP6 RNA 聚合酶介导的截断式转录。取两组转录反应的等分试样在 0.6% 琼脂糖凝胶上电泳分析。M，1 kb DNA 标准分子量标记。请点击此处查看该图的放大版本。

RNA感染性与病毒产量分析；病毒研究中的图表、蚀斑及荧光显微镜图像。
图6. 来源于全长JEV BAC的合成RNA的特异性感染性及合成病毒的回收。 对BHK-21细胞进行模拟电穿孔（Mock）或使用来自两个独立全长JEV BAC克隆（Cl.1 和 Cl.2）的RNA转录本进行电穿孔。（A）RNA感染性。转染后4天，细胞覆盖琼脂糖并用结晶紫染色。通过感染中心测定法确定RNA的感染性，以估算电穿孔进入细胞的感染性RNA量（左图）。同时展示感染中心的代表性图像（右图）。（B）蛋白表达。细胞培养于4孔培养板中。在转染后20小时（hpt），通过免疫荧光检测分析RNA电穿孔细胞中病毒蛋白的表达，使用一抗为抗NS1兔抗血清，二抗为Cy3标记的 goat anti-rabbit IgG（红色）。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚复染（蓝色）。免疫荧光图像与其对应的微分干涉差图像叠加显示。（C）病毒产量。细胞培养于150 mm培养皿中。通过蚀斑测定法检测RNA电穿孔细胞在转染后22小时和40小时时培养上清中积累的感染性病毒颗粒的产量。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本方案已成功用于生成两种不同毒株（CNU/LP227 和 SA14-14-228）的日本脑炎病毒（JEV）全长感染性cDNA克隆。JEV属于黄病毒科，其功能性cDNA因宿主细胞毒性及克隆cDNA的遗传不稳定性而难以构建和扩增8,74-76。本方案包含三个主要部分：首先，使用高保真逆转录酶/DNA聚合酶最大限度地合成或扩增出与病毒RNA序列一致的cDNA；其次，在从初始cDNA亚克隆到最终全长cDNA组装的整个过程中，将含有毒性序列的病毒prM-E编码区（未发表数据）74,77,78克隆至拷贝数极低的BAC载体中；第三，采用可容纳平均大小为120–350 kb外源DNA的BAC克隆载体19-21，该载体对较大DNA插入片段的耐受性明显优于其他克隆载体。此克隆策略可广泛适用于许多其他正链RNA病毒，尤其是基因组大小约为10至32 kb的正链RNA病毒。构建感染性cDNA克隆是建立RNA病毒反向遗传学系统的关键步骤，对正链RNA病毒尤为重要，因为其基因组本身即可作为病毒mRNA，由宿主细胞核糖体翻译产生病毒蛋白。因此，将由cDNA衍生的全长RNA分子导入易感宿主细胞即可启动病毒复制。结合重组DNA技术，获得感染性JEV cDNA克隆显著加深了我们在分子水平上对病毒生命周期多个方面的理解，例如基因表达73,79和基因组复制63,64。此外，全长JEV cDNA克隆已被证实是开发抗病毒疫苗28和基因递送载体80,81的重要工具。

与所有正义链RNA病毒一样，构建可用于合成高感染性RNA的可靠功能性JEV全长cDNA涉及多个关键步骤 体外理想情况下，由全长cDNA克隆转录而来的合成RNA序列应与病毒基因组RNA序列完全相同，特别是病毒RNA复制起始所必需的5'-和3'-末端序列。60-62 在本实验方案中，通过将SP6启动子序列置于病毒基因组第一个腺嘌呤核苷酸的上游，并在下游设置一个独特的人工序列，确保了5'-和3'-端的真实性和准确性。 Xba I 限制性位点，分别位于病毒基因组最后一个胸腺嘧啶核苷酸的下游。通过从线性化质粒进行加帽的体外转录，产生具有真实5'和3'末端的合成RNA Xba 使用SP6 RNA聚合酶，以m为引物，对I-线性化并经MBN处理的cDNA模板进行反应7G(5')ppp(5')A 帽类似物。本方案可通过多种方式进行修改。 体外 转录，另一种噬菌体RNA聚合酶（例如，T3 或 T7）可与其明确定义的启动子序列联合使用。27 作为截短位点，如果某个不同的限制性酶切位点在病毒基因组中不存在，并且由线性化cDNA产生的合成RNA以其真实的3'端结尾，则可使用该位点。当合成RNA的3'端含有三个或四个与病毒无关的核苷酸时，其RNA感染性会下降约10倍，这已证明3'端核苷酸序列的重要性。27 在 体外 转录反应，包括m7G(5')ppp(5')A 和 m7G(5')ppp(5')G 帽类似物同样可以有效使用，尽管后者会在病毒5'端上游引入一个无关的额外G核苷酸，但这一添加并不影响合成RNA的感染性或复制能力。27 此外，进行RNA感染性检测时，无需通过DNase I消化去除cDNA模板，因为cDNA模板本身不具有感染性。27

目前，BAC 技术已应用于构建少数几种正义链 RNA 病毒的感染性 cDNA 克隆，包括两种乙型脑炎病毒（JEV），CNU/LP227 和 SA14-14-228（基因组大小约为 11 kb）；两种登革病毒，BR/9026 和 NGC29（约 11 kb）；牛病毒性腹泻病毒 SD1（约 12 kb）25；两种经典猪瘟病毒，C 株和 Paderborn（约 12 kb）24；边界病病毒 Gifhorn（约 12 kb）24；猪繁殖与呼吸综合征病毒 PL97-1/LP1（约 15 kb）30；可传播性胃肠炎病毒 PUR46-MAD（约 29 kb）16；猫传染性腹膜炎病毒 DF-2（约 29 kb）32；严重急性呼吸综合征冠状病毒 Urbani（约 30 kb）9；中东呼吸综合征冠状病毒 EMC/2012（约 30 kb）17；以及人冠状病毒 OC43（约 31 kb）31。使用 BAC 构建 cDNA 的主要优势在于其大尺寸、单拷贝或双拷贝 BAC 质粒具有高度的遗传稳定性；然而，其极低拷贝数的固有特性也是一大劣势，因为这会导致 BAC DNA 产量极低，并进而降低 BAC DNA 相对于宿主染色体 DNA 的纯度。在本实验方案中，通过在营养丰富的 2xYT 培养基中培养转化了感染性 BAC pBAC/SA14-14-2 的 E. coli DH10B 菌株，以最大化 BAC DNA 的产量。尽管如此，从 500 ml 的 2xYT 肉汤培养物中平均仅能获得约 15 µg 的 BAC DNA。此外，为获得最佳纯度，应采用 CsCl-EtBr 密度梯度离心法纯化 BAC DNA，而非常用的基于柱的质粒提取方法。然而，必须注意的是，转化了 BAC 的 E. coli 不应过度生长，因为这可能危及克隆 cDNA 的遗传稳定性，且更高的菌体生长量并不一定带来更高的 DNA 产量或更纯的 BAC DNA。

本文所述方案是一种优化的、高效且简化的构建与扩增基因稳定型全长感染性cDNA克隆的方法，该克隆以细菌人工染色体（BAC）形式存在，适用于日本脑炎病毒（JEV），而这一操作曾被认为在实际操作中几乎不可能实现。相同的克隆策略也可应用于许多其他正链RNA病毒。通常情况下，感染性cDNA克隆使我们能够在病毒RNA基因组中引入多种突变（例如，缺失、插入和点突变），以研究这些突变在病毒复制和致病过程中的生物学功能。基于cDNA的反向遗传学系统使得开发和测试针对特定正链RNA病毒毒力因子的疫苗和治疗候选物成为可能。此外，该感染性cDNA技术还可作为病毒载体，用于表达一个或多个感兴趣的外源基因，从而广泛应用于生物医学研究的多个领域。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢犹他州科学、技术与研究基金对YML的支持，以及韩国国家研究基金会资助（项目编号：2009-0069679和2010-0010154）对SIY的支持。本研究由犹他农业实验站、犹他州立大学资助，并已批准为犹他农业实验站期刊论文第UAES #8753号。此外，作者感谢Deborah McClellan博士在编辑方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 分子克隆
2xYT 培养基Sigma-AldrichY2377
[3H]UTPPerkinElmerNET380250UC放射性
50 ml 离心管Thermo Scientific (Nalgene)3114-0050
250 ml 瓶Beckman Coulter356011
琼脂糖Lonza50004
琼脂糖（低熔点）Life Technologies (Invitrogen)16520-100
AvaINew England BioLabsR0152S
AvrIINew England BioLabsR0174S
BamHINew England BioLabsR0136S
BsiWINew England BioLabsR0553S
BsrGINew England BioLabsR0575S
丁醇Fisher ScientificA399-1 
氯化铯Fisher ScientificBP1595-1
氯霉素Sigma-AldrichC0378
氯仿Sigma-AldrichC2432致癌性
DE-81 滤纸GE Healthcare Life Sciences3658-023
dNTP 混合液Life Technologies (Invitrogen)18427-088
E. coli DH10B Life Technologies (Invitrogen)18297-010
EDTASigma-AldrichE5134
乙醇 Sigma-AldrichE7023
溴化乙锭Sigma-AldrichE7637有毒且高度致突变
滤柱（质粒大提试剂盒）Life Technologies (Invitrogen)K2100-26
冰醋酸Sigma-AldrichA6283刺激性
葡萄糖Sigma-AldrichG5400
糖原 Roche10901393001
高保真DNA聚合酶New England BioLabsM0491S
异戊醇Sigma-AldrichI9392易燃
异丙醇 Amresco0918易燃
LB 培养基Life Technologies (Invitrogen)12795-027
氯化锂Sigma-AldrichL9650
溶菌酶Amresco0663
氯化镁Sigma-AldrichM8266
M-MLV 逆转录酶Life Technologies (Invitrogen)18080-044
绿豆核酸酶New England BioLabsM0250S
针头（18G，20G）BD305196, 305175生物危害（锐器废弃物）
NotINew England BioLabsR0189S
寡核苷酸Integrated DNA Technologies定制寡核苷酸合成
PacINew England BioLabsR0547S
pBeloBAC11New England BioLabsER2420S (E4154S)
苯酚（缓冲液饱和）Life Technologies (Invitrogen)15513-039有毒且高度腐蚀性
苯酚:氯仿:异戊醇Life Technologies (Invitrogen)15593-031有毒且高度腐蚀性
苯酚:硫氰酸胍Life Technologies (Ambion)10296-010有毒、腐蚀性且刺激性
Pme INew England BioLabsR0560S
醋酸钾Amresco0698
RNase抑制剂Life Technologies (Invitrogen)10777-019
rNTP 混合液GE Healthcare Life Sciences27-2025-01
可密封聚丙烯管（16 × 76 mm） Beckman Coulter342413
SfiINew England BioLabsR0123S
Sma INew England BioLabsR0141S
醋酸钠Sigma-AldrichS2889
十二烷基硫酸钠Amresco0227
氢氧化钠Sigma-AldrichS5881
SP6 RNA聚合酶New England BioLabsM0207S
离心柱（质粒小提试剂盒）Life Technologies (Invitrogen)K2100-11
注射器HSW NORM-JECT4200.000V0
T4 DNA连接酶New England BioLabsM0202S
TrisAmresco0826
tRNA（酵母）Life Technologies (Invitrogen)15401-011
XbaI New England BioLabsR0145S
名称公司货号备注
2. 细胞培养
α-最低必需培养基Life Technologies (Gibco)12561-049
锥形离心管（50 mL）VWR21008-242
结晶紫 Sigma-AldrichC0775
培养皿（150 mm） TPP93150 
比色杯（2 mm 间隙）Harvard Apparatus450125 
胎牛血清 Life Technologies (Gibco)16000-044
甲醛Sigma-AldrichF1635有毒且致癌
谷氨酰胺Life Technologies (Gibco)25030-081
最低必需培养基Life Technologies (Gibco)61100-061
青霉素/链霉素Life Technologies (Gibco)15070-063
氯化钾Sigma-AldrichP3911
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP9791
六孔板TPP92006
氯化钠Sigma-AldrichS3014
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS3264
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Life Technologies (Gibco)25200-056
维生素Sigma-AldrichM6895
名称公司货号备注
3. 仪器
琼脂糖凝胶电泳系统MupidMPDEXU-01
CO2 培养箱Thermo ScientificHeracell 150i
台式离心机 Thermo ScientificST16R
电穿孔仪Harvard ApparatusECM 830
长波紫外灯（手持式）UVPUVGL-58
台式离心机Beckman Coulter368826
PCR仪Life Technologies (Applied Biosystems)GeneAmp PCR System 9700
涡旋振荡器Scientific IndustriesG-560
水浴锅Jeio TechWB-10E

参考文献

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