方法文章

细菌人工染色体:对于正链RNA病毒研究的功能基因组学工具

DOI：

10.3791/53164

⸱

2015年12月29日

 ,  ,  , 
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里提出了一种用于创建感染性细菌人工染色体的方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组 RNA 的全长 cDNA。该方案可用于构建其他正链 RNA 病毒的功能性 cDNA，使其成为研究病毒生物学的强大基因组工具。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

反向遗传学是一种完全从克隆的 cDNA 中拯救感染性病毒的方法，它彻底改变了正链 RNA 病毒的领域，其基因组与细胞 mRNA 具有相同的极性。基于 cDNA 的反向遗传学系统是一种开创性方法，能够直接作病毒基因组 RNA，从而产生重组病毒，用于病毒复制和发病机制中病毒 RNA 元件和基因产物的分子和遗传研究。它还提供了一个有价值的平台，允许开发用于递送外源基因的基因定义疫苗和病毒载体。然而，对于许多正链 RNA 病毒，如日本脑炎病毒 （JEV），克隆的 cDNA 不稳定，对功能性 cDNA 的构建和传播构成重大障碍。在这里，本报告描述了使用以下一般实验程序创建和扩增遗传稳定的全长感染性 JEV cDNA 作为细菌人工染色体 （BAC） 的战略考虑：病毒 RNA 分离、cDNA 合成、cDNA 亚克隆和修饰、全长 cDNA 的组装、cDNA 线性化、体外RNA 合成和病毒回收。该方案提供了一种通用方法，适用于将一系列正链 RNA 病毒的全长 cDNA 克隆到 BAC 载体中，特别是那些基因组长度为 >10 kb 的病毒，从中可以用噬菌体 RNA 聚合酶在体外转录感染性 RNA。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

用于RNA病毒学家，重组DNA技术在20世纪70年代后期出现使得有可能转换的病毒RNA基因组成的cDNA克隆，其可随后被传播作为细菌的RNA病毒的基因操作的质粒。1所述的第一RNA病毒是分子克隆是噬菌体Qβ，一个正链RNA病毒，感染大肠杆菌 。一份载有Qβ基因组RNA的全长cDNA拷贝质粒引起感染Qβ噬菌体在引入E.大肠杆菌 。2之后不久，这种技术应用于脊髓灰质炎病毒，人类和动物的一个正链RNA病毒。质粒轴承脊髓灰质炎病毒基因组RNA的全长cDNA的感染性时转染到哺乳动物细胞和能够产生感染性病毒体3在这个"DNA的启动"的方法，将克隆的cDNA应在细胞内转录的启动病毒RNA的复制。然而，目前还不清楚如何转录启动以及如何转录物加工成正确的病毒序列。这种担忧导致了另一种"RNA推出"的发展方针，从而使病毒RNA基因组的完整基因副本是根据由E.识别的启动子克隆大肠杆菌或噬菌体RNA聚合酶，用于生产在体外合成的RNA具有确定的5'和3'末端，在导入宿主细胞经历完整的病毒复制循环的4,5的第一次成功，这种方法据报道为雀麦花叶病毒，6,7-植物的正链RNA病毒。此后，核糖核酸射方法已经被开发用于广泛的正链RNA病毒，包括杯状病毒，甲病毒，黄病毒，动脉炎病毒，和冠状病毒。1,4,5,8

在这两个DNA和RNA的启动反向遗传学系统，一个FUL的施工升的全长cDNA克隆的关键是产生感染性DNA或正链RNA病毒的RNA，但它成为相当大的技术挑战，作为病毒基因组的尺寸增加。9-17特别是，一个大的RNA基因组〜10 -32 kb的提出了三种主要障碍全长官能cDNA的克隆18的第一个困难是一个忠实的​​cDNA拷贝的合成，因为RT-PCR的保真度是成反比的病毒RNA的长度。第二关是有潜在毒性的序列的存在，因为长的RNA分子更可能含有能够使cDNA片段在质粒不稳定在大肠杆菌的意想不到的序列大肠杆菌 。第三也是最关键的问题是合适的载体的可用性，因为它是很难找到的克隆载体，可以容纳的> 10kb的一个病毒cDNA插入物。在过去的三十年里，这些障碍已经被克服在酶学，方法论，是一些进步ðvectorology。1,4,5,8其中，最有前途的创新发展是大的正链RNA病毒传染性细菌人工染色体（BAC）的克隆。 BAC载体是一低拷贝质粒克隆（1-2个拷贝/细胞）的基础上E.大肠杆菌 F质粒，具有的平均DNA插入物大小:约120-350 kb的19-21的DNA片段被插入到以类似的方式将BAC载体以克隆到一般的克隆载体。所产生的BAC克隆是稳定的多代的E.大肠杆菌。22,23到目前为止，上述BAC技术已被用来创建感染性cDNA克隆的三个正链RNA病毒家族， 即 黄病毒科 ， 动脉炎 24-29，30和冠状的> 10个成员。9,16,17 ，31,32

使用日本脑炎病毒（JEV）作为一个例子，目前的工作报告的详细过程，可以是用于构建遗传稳定的全长感染性BAC为各种正链RNA病毒。 JEV是一种人畜共患黄病毒33是在鸟类，猪和其他脊椎动物宿主之间性质通过蚊子载体传播。34,35在人类中，JEV感染可引起严重的常常是致命的神经系统疾病的日本脑炎（JE），36中发生的亚洲和西太平洋，37,38的部分地区有中〜50,000-175,000临床病例，估计每年的发病率。39,40乙脑病毒的基因组是〜11 KB，单股，正链RNA分子，由由两个非编码区（NCR的）在5'和3'侧翼的单个开放阅读框（ORF）结束。41,42的ORF编码是受宿主和病毒蛋白酶裂解，生成10个单独的蛋白质多蛋白，指定C，PRM，请E，NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5中的N至C端方向34,43,44此外，电子NS1（NS1'）的xtended形式是由-1核糖体移密码子NS2A 8-9表示。45,46这些11种蛋白质中，有三种结构蛋白（C，的prM和E）是用于感染性的形成至关重要病毒粒子，47,48和其余八的非结构蛋白（NS1到NS5，和NS1'）是病毒RNA复制，49-51颗粒组装，52-56和先天免疫逃避至关重要。57-59两者的5'和3 'NCR的含有保守的一级序列和形式的RNA二级/三级结构，60-62其中用于调节病毒RNA复制很重要。63,64

本协议描述的工具，方法和策略产生全长乙脑病毒感染性BAC SA 14 -14-2。28这种功能BAC克隆包含了乙脑病毒基因组RNA，它是通过一个启动子包含一个完整的基因副本，65对于SP6 RNA聚合酶上游的病毒的5'末端和一个独特的XbaⅠ限制性病毒3'末端的体外径流转录的下游位点。此BAC技术适用于构建一个功能完整的cDNA分子克隆用于正链RNA病毒的阵列。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意: 图1给出一个策略来产生全长感染性JEV cDNA的结构作为BAC 28 表1提供了在本协议中使用的寡核苷酸的列表28。

1.在细胞培养上清液中提取病毒RNA从乙脑病毒颗粒

  1. 开始用含有JEV的SA 14 -14-2，一活JE疫苗病毒，需要生物安全等级2遏制细胞培养基。
    注意:病毒滴度是约1-3×10 6噬斑形成单位/ ml。
  2. 采取必要的生物安全培训所有标准微生物操作，安全设备和实验室设施，乙脑病毒SA 14 -14-2合作之前。
  3. 从使用的苯酚和异硫氰酸胍66（图1A）单相溶液中的含病毒的细胞培养基的等分试样纯化病毒RNA。
    1. 广告Ð600微升单相试剂加入200μl培养上清液的在1.7 ml的微管中。用手摇动试管剧烈30秒和温育5分钟，在RT均化混合物。
    2. 加入160微​​升的氯仿在匀浆样品。通过握手管剧烈，持续15秒，并留在室温下2-3分钟混匀。
    3. 离心在13400×g下的总裂解物15分钟，在4℃，这导致两个液相，即一个分离，低级的有机相和上部的水相。含RNA的上层水相（小于200微升）转移到新的微管中。
    4. 加入1微升5微克/微升糖原和400μl的100％异丙醇并孵育在室温10分钟沉淀RNA。
    5. 离心机在13400×g下在4℃下10分钟的混合物。弃上清，用1mL的75％乙醇通过脉冲涡旋3洗涤RNA沉淀到五倍，并在13400×g下在4℃下离心5分钟。
    6. 空气干燥RNA沉淀10分钟，将其溶解在40微升的dh 2 O的存储所提取的RNA在-80℃直至使用。

2.合成设置4个重叠的cDNA片段（F1至F4）覆盖了整个病毒基因组RNA反转录（RT）-PCR的

  1. 执行与纯化的病毒RNA的10微升等分试样作为模板，莫洛尼鼠白血病病毒的修饰形式逆转录酶20微升RT反应。67
    1. 设置包含10微升纯化的RNA，1微升10 mM的dNTP混合物，1微升4皮摩尔/微升引物和1微升卫生署2 O. 13微升的混合物使用片段特异性引物对每个RT反应:1RT为F1，2RT为F2，3RT为F3和4RT为F4。
    2. 在65℃孵育该混合物5分钟，置于冰上1分钟，然后快速自旋收集康特的nts在管的底部。
    3. 加入4微升5×RT缓冲液，1微升0.1 M DTT，1微升40单位/微升RNA酶抑制剂，和1微升200单位/μL逆转录酶。移液器向上和向下的三到五倍混合。
    4. 来进行反应，在50℃进行1小时，然后加热灭活样品在70℃下进行15分钟。存储所述合成第一链cDNA在-20℃直到使用。
  2. 进行与热灭活RT反应作为模板和高保真耐热性DNA聚合酶68（图1B）的一个5微升等份一个100μl的PCR反应。
    1. 设置在冰上将100μl的PCR反应中，含有5微升RT反应，20微升5×PCR缓冲液，4μl的10mM dNTP混合物，5微升10μM的正向引物，5μl的10μM反向引物，1微升2 U个/μl的DNA聚合酶，和60微升卫生署2 O.使用片段特异性引物对每个PCR reactioN:1F + 1R为F1（2573 BP），2F + 2R为F2（4171 BP），3F + 3R为F3（3922碱基对），和4F + 4R的F4（1798 BP）。
    2. 通过手指翻转的管的三到五倍，并短暂离心​​轻轻混匀以收集其内容在底部。
    3. 开始用30秒的起始变性步骤在98℃，随后25-30个循环用下述PCR热循环:10秒在98℃，30秒，在60℃，1-2分钟（30秒/ KB）72℃。存储所述PCR产物在4℃直至进行分析。
  3. 运行每个PCR反应的一个2-5微升等分试样在含有0.5微克/毫升溴化乙锭（EtBr）（图2）在0.8％琼脂糖凝胶。
    小心:乙锭是一种强效的诱变剂和需要实验室外套，安全眼镜和手套以佩戴和极其小心其使用，储存和处置过程中被观察到。

3.亚克隆四个cDNA片段（F1至F4）进入BAC载体的创建PBAC / F1至PBAC / F4 bŸ分子克隆技术

  1. 消化该载体并用两个适当的限制性内切酶的DNA插入，​​如下:
    1. 在总体积为60微升（含有〜500 ng的DNA进行PBAC / PRRSV / FL（载体）的连续消化，30 pBeloBAC11质粒（7507碱基对，GenBank登录号U51113）， 用 Pme I的衍生物和 Not I ，10U酶，1×消化缓冲液和1×BSA），在37℃12-15小时，这产生15426 bp的载体片段。
    2. 在60微升的总体积进行各四个的cDNA的扩增子（插入） 用 Sma I的的顺序消化和 Not I（含有〜1微克的DNA，20U酶，1×消化缓冲液中，1×BSA），在25 ℃（ 的Sma I）或37℃（ 的Not I）12-15小时，这将产生所需尺寸的下面插入片段:F1（2559碱基对），F 2（4157碱基对），F3（3908碱基对），和F4（1784 BP）。
  2. 净化所需载体和通过凝胶提取插入的DNA片段。
    1. 在含有1％低熔点琼脂糖凝胶0.5微克/毫升的EtBr分离双重消化产物。切出所需DNA片段的条带与琼脂糖的下长波紫外光最小量（通常〜200微升）。
    2. 加的透射电镜缓冲器等体积（10毫摩尔Tris-氯，1毫摩尔EDTA和10mM的MgCl 2），以在1.7 ml的微管的切琼脂糖。孵育样品在72℃下10-15分钟，用涡旋每2-3分钟，直到琼脂糖完全熔化。
    3. 添加预热的缓冲液饱和的苯酚等体积，涡流大力1分钟，并离心13400×g下在室温下10分钟。
      注:混合物分离成较低的有机相和上部的水相。传输含有该DNA，以一个新的微管中的上层水相。
    4. 加等体积氯仿:异戊醇（24:1），涡旋1分钟，并在离心机13中，400×g下在室温下10分钟。上层水相转移到新的小管。
    5. 加入0.5微升10微克/微升酵母tRNA，1/10体积的3M乙酸钠和2.5体积的100％乙醇。保持在冰上的混合物20分钟。
    6. 离心在13400×g下将混合物在室温10分钟。除去上清液并用1ml的70％乙醇通过脉冲涡旋的三到五倍，并在13400×g下离心10分钟，洗DNA沉淀。
    7. 空气干燥DNA沉淀10分钟，并溶解于20μlTE缓冲液中（10毫摩尔Tris-Cl和1mM EDTA的制造[pH 7.6]）。
  3. 结扎目标向量，并使用T4 DNA连接酶插入的DNA片段。
    1. 建立含有50-100纳克载体DNA，一个〜3倍摩尔过量的插入DNA，400单位的T4 DNA连接酶，和1×连接缓冲液中的20微升连接反应。孵育在16℃下12-15小时连接反应。
      注:包括负对照醇反应， 即向量只有不插入，同步发展。
    2. 执行四个独立结扎，与2559-BP每个加入醋酸铅/ PRRSV / FL的15426个碱基PME I- 不是我片段（为F1），4157-BP（用于F2），3908-BP（适用于F3），或1784-BP（为F4）四个基因扩增子之一的Sma I- 不是我的片段，产生亚克隆PBAC / F1至PBAC / F4。
  4. 变换连接的DNA 到大肠杆菌大肠杆菌 DH10B由氯化钙 2 -热冲击法。
    1. 取氯化钙的100微升等分试样处理过的主管DH10B细胞69储存在-80℃并解冻它们在冰上。
      注:用100微升每改造的细胞。
    2. 添加DNA连接反应至100μl解冻的细胞的10微升等分试样在1.7 ml的微管中，通过敲击管轻轻混匀，并保持在冰上30分钟。
    3. 热休克在42℃WA DNA的细胞混合物45秒之三浴，放置在冰上2分钟，然后添加900微升的LB肉汤的预温热至室温。
    4. 孵育热休克的细胞在35℃下1小时，振荡下225-250转。
    5. 涂布在含有10μg/ ml氯霉素的LB琼脂平板上培养的细胞（CML）的50至200微升等分试样。保持平板在室温，右侧朝上，直到他们干的。
    6. 转动板倒置并孵育在35℃下15小时。
  5. 通过基于列的纯化方法（图1C）恢复来自宿主细胞克隆的BAC DNA。
    1. 挑六至八个细菌菌落从LB-CML琼脂平板接种他们入含有10μg/ ml的CML 3毫升的2×YT液体培养基。孵育培养物在35℃下进行10小时，同时剧烈振摇（225-250转）
    2. 隔离重组的DNA的BAC从1-1.5毫升使用自旋列的细菌培养物，所指示的制造商。70洗脱提取的DNA（typi卡利100-200纳克）在20μlTE缓冲液中。
    3. 在10微升的总体积下进行分离的BAC的两种分析限制性内切酶消化为〜6小时，一个使用用于克隆的相同的酶，以确定具有正确插入物的载体的存在下（见协议3.1），另以用合适的酶（例如， 的BglⅡ， 的NcoⅠ，或的PstⅠ）测试克隆的BAC的完整性，产生一种独特的限制性片段模式。
    4. 接种500微升阳性细菌培养物（从协议3.5.1）的在500毫升的2×YT-CML培养基中，培养接种物6小时，在35℃下以225-250转摇动传播正确克隆的BAC。使用过滤柱从500毫升培养物纯化的BAC DNA（通常为10-20微克），如制造商推荐的。71
      注:初始4的BAC亚克隆，各含有的JEV基因组RNA的cDNA片段，可能被证明对e或更多不想要的突变相比时共识病毒基因组42（其用作参考序列）的序列。任何此类突变需要由之前的全长JEV cDNA的装配基于PCR的定点诱变进行校正。27

4.创建全长乙脑病毒基因与5'SP6启动子和3'径流网站

  1. 病毒基因组的进行三次遗传修饰（见下文协议4.1.1-4.1.3）中克隆的cDNA，以允许体外径流的基因组长度RNA的转录与正品5'和3'末端。
    1. 通过重叠延伸PCR（图1D，PBAC / F1的SP6）引入一个SP6启动子直接上游的病毒基因组的5'端的。
      1. 经由PBAC / F1的第一标准的PCR扩增两个重叠的DNA片段与两个引物对SP6F + SP6R（产品大小，173碱基对）和F1F + F1R（商品SIZE，676碱基对），每个中含有1μl的模板DNA（〜200微微克/微升）50微升反应，将10μl5×PCR缓冲液，2微升的10mM的dNTP，各10μM的正向和反向2.5μl的引物，0.5微升2 U /μLDNA聚合酶，68和 31.5微升卫生署2 O.使用以下循环轮廓进行PCR:98℃30秒，98℃25个循环持续10秒，60℃30秒，72℃20秒。
      2. 凝胶纯化两个PCR扩增的DNA片段在1.5％低熔点琼脂糖凝胶上运行每两个PCR产物后，如在协议3.2所述。
      3. 通过使用最外面的引物SP6F + F1R第二融合PCR融合两个凝胶纯化的DNA片段（产品大小，821碱基对）在100微升反应包括每两个纯化的DNA片段的1微升（约100微克/微升）， 20微升5×PCR缓冲液，4μl的10mM的dNTP，各10μM的正向和反向5μl的引物，1微升2 U /μLDNA聚合酶，68和63微升卫生署2 O.使用下面的热循环概况:98℃30秒，98℃25个循环持续10秒，60℃30秒，72℃30秒。
      4. 从1％的低熔点琼脂糖凝胶凝胶纯化融合PCR扩增子，如在协议3.2所述。
      5. 执行协议3.1-3.5中描述的五步克隆过程结扎凝胶纯化融合PCR扩增子的760-bp的精灵 I-BSI WI片段与PBAC / F1的9532-bp的精灵 I-BSI WI片段以产生PBAC / F1 SP6。
    2. 由通过重叠延伸PCR（ 图1D，PBAC / F3 KO）引入沉默点突变（A→9134 T）取出预先存在的，内部XbaI位核苷酸9131。
      1. 放大两个重叠的DNA片段用醋酸铅/ F3的第一个标准的PCR用两个引物对X1F + X1R（产品尺寸，746碱基对）和X2F + X2R（产品大小，316碱基对）在协议4.1.1.1所述的实验条件下在50微升反应。
      2. 凝胶纯化两个PCR扩增的DNA片段上1.5％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后，如在协议3.2详述。
      3. 通过使用在议定书4.1.1.3所述的实验条件下在100μl的反应的最外引物X1F + X2R（产品大小，1033 bp）的所述第二融合PCR融合两个凝胶纯化的DNA片段。
      4. 从1％的低熔点琼脂糖凝胶凝胶纯化融合PCR扩增子，如在协议3.2详述。
      5. 执行协议3.1-3.5中描述的五步克隆过程结扎凝胶纯化融合PCR扩增子的949-bp的无毒 II- 的Not I片段与16245-bp的未 I-BSI WI和2141-bp的BSI W I - PBAC / F3的无毒二片段，产生醋酸铅/ F3 KO。
    3. 设计一种新的人工的XbaⅠ径流站点的病毒基因组的3'末端的下游通过基于PCR的定点诱变（图1D，PBAC / F4 RO）。
      1. 通过PBAC的PCR产生一个DNA片段/ F4用引物ROF + ROR（产品大小，324碱基对）在100微升反应含有1μl的模板DNA（〜200微微克/微升），20微升5×PCR缓冲液，4微升10毫的dNTP，各10μM的正向5微升和反向引物，1微升2单位/微升DNA聚合酶，68和 64微升卫生署2 O.使用以下循环轮廓进行PCR:98℃30秒，98℃25个循环持续10秒，60℃30秒，72℃15秒。
      2. 凝胶纯化从1％低熔点琼脂糖凝胶对PCR扩增的DNA片段，如在协议3.2详述。
      3. 执行协议3.1-3.5描述的五步克隆过程结扎283 bp的SFI I-ñOT我片段凝胶纯化PCR扩增子用醋酸铅/ F4的16933个碱基SFI I- 不是我片段创建醋酸铅/ F4 RO的。
  2. 组装一组四个改性，通过在三个自然限制性酶切位点连接（BSR GI， 巴姆 HI和阿瓦我的cDNA重叠成一个单一的全长SA 14 -14-2 BAC（PBAC / SA 14 -14-2） ）使用的五步克隆协议中的详细步骤的顺序方式3.1-3.5（ 图1E）:F1 SP6→F1 SP6 F2（通过与醋酸铅的替代醋酸铅/ F1 SP6的BSR摹I- 不是我片段/ F2）→F1 SP6 F2F3 KO（通过与醋酸铅/ F3 KO）→F1 SP6 F2F3 KO F4 RO的替代醋酸铅/ F1 SP6 F2的巴姆 ^ h I- 不是我片段（取代的阿瓦 I- 不是我片段PBAC / F1 SP6 F2F3 KO与醋酸铅/ F4 的RO）。

5.准备全长度的高纯度马克西准备SA 14 -14-2 BAC

  1. 生长的大肠杆菌单菌落大肠杆菌 DH10B携带PBAC / SA 14 -14-2于3ml含有10μg/ ml的CML 10小时在35℃振荡下225-250转，然后的2xYT肉汤的比例增加接种500微升10小时的细菌培养到500ml的2xYT-CML介质和培养的接种6小时在35℃下剧烈振荡的。
  2. 离心机的细菌培养在2个250 ml瓶装在3107×g的15分钟，在4℃。重悬在30毫升的GTE溶液（50mM葡萄糖，25毫摩尔Tris-Cl和10mM EDTA的制造[pH 8.0]）每个颗粒，然后加入500微升60毫克/毫升溶菌酶。冰上孵育两种细胞悬浮液10分钟。
  3. 加60毫升新鲜的裂解液（0.2N的NaOH和1％SDS），以每个细胞悬浮液，搅拌均匀，直到清楚，并保持裂解液在RT 10分钟。
  4. 加45毫升中和溶液（100毫升，由60 ml的5M乙酸钾，11.5毫升冰醋酸，和28.5 ml的卫生署2 O）与每个瓶子，通过反转瓶调匀，在冰上孵育的中和的裂解物10分钟。
  5. 离心机在18566×g的20分钟，在4℃下中和的裂解物。传送两个瓶子的上清液分成两个新250毫升瓶;加100％的异丙醇，以每0.6体积，并保持在冰上20分钟。
  6. 降速析出物在18566×g的20分钟，在4℃。溶解每个颗粒在5ml TE缓冲液中，将它们组合在50ml管（10 ml的数量），并通过加入5M的氯化锂等体积沉淀的RNA。冰上孵育混合物10分钟。
  7. 离心机将RNA沉淀物在14636×g的20分钟，在4℃。将上清液转移到一个新250个毫升管，并通过添加2体积的100％异丙醇中沉淀的DNA。冰上孵育混合物20分钟。
  8. 降速的DNA沉淀，在18566×g的20分钟，在4℃。吸出上清液，重悬DNA沉淀在9.5毫升的TE缓冲液（pH 7.6），并加入10克氯化铯（铯）和390微升10毫克/毫升的EtBr。
  9. 装载DNA的氯化铯 - 溴化乙锭溶液将使用装有18G的针头的注射器16×76毫米的可密封聚丙烯管中。旋在超速离心机密封CsCl梯度在401700×g下16小时，在20℃（ 图3）。
  10. 使用18G的针产生通气孔在梯度的顶部和20G的针装有注射器检索来自梯度侧的BAC DNA收集来自CsCl梯度的BAC质粒的DNA带。
  11. 加入2.5倍体积的dh 2 O型饱和的正丁醇的溴化乙锭染色BAC DNA样品，并通过涡旋混合。离心机在13400×g的1分钟，该混合物的下层水相转移到新的1.7 ml的话筒rotube。重复此过程六倍。
  12. 通过加入1/10体积的3M乙酸钠和2.5体积的100％乙醇的丁醇提取的BAC DNA的和温育在冰上10分钟沉淀出的EtBr - 自由的BAC DNA。离心沉淀物在13400×g的10分钟，用1毫升70％乙醇洗涤DNA沉淀，并通过离心再次沉淀它。
  13. 空气干燥DNA沉淀10分钟，并溶解在200μlTE缓冲液（pH为7.6）。
    注意: 图4示出了反向遗传学系统的JEV SA 14 -14-2的概述。

6.转录合成的RNA 在体外从线性全长乙脑病毒BAC DNA

  1. 执行的一个大规模酶切PBAC / SA 14 -14-2 用 XbaI在100微升（含有3微克DNA，60单位酶，1×消化缓冲液中，1×BSA），在37℃，总体积下12-15小时。检查D的3微升等份在含有0.5微克/毫升的EtBr在0.8％琼脂糖凝胶igestion反应。
  2. 孵育消化反应进一步用绿豆核酸酶25单位（MBN）在30℃下2小时（图4A）。
  3. 带来的XbaⅠ消化，MBN处理的样品的体积达到300微升与卫生署2 O.添加的苯酚等体积氯仿:异戊醇（25:24:1）稀释样品，涡旋大力1分钟，自旋在13400×g的10分钟，然后上层水相转移到新的1.7 ml的微管。加等体积氯仿并重复提取步骤。
  4. 通过乙醇沉淀回收的苯酚/氯仿萃取，线性化BAC:加入1/10体积的3M乙酸钠和2.5体积100％乙醇，并在冰上孵育20分钟。离心沉淀物在13400×g的10分钟，用1ml的70％乙醇洗涤DNA沉淀，然后通过再离心旋下来。
  5. 风干该DNA PELLE吨10分钟，并溶解于30μl 卫生署2 O的检查所回收的BAC上用0.5微克/毫升的EtBr（图5A）在0.8％琼脂糖凝胶1微升等份。
  6. 在25微升（含有〜200纳克模板DNA，0.8毫帽类似物[米7 G（5'）PPP（5'）A〕，1mM的的rNTPs的总体积进行的线性化BAC DNA的径流转录， 40单位RNA酶抑制剂，20单位SP6 RNA聚合酶，72和1×转录缓冲液）在37℃下进行1小时（ 图4B）。包括0.5μM〔3 H〕双绞线对[3 H]双绞线掺入的基础上RNA定量，通过吸附到DE-81上的滤纸作为监测。69
  7. 运行径流转录反应的1-2微升等分试样在含有0.5微克/毫升的EtBr（图5B）0.6％琼脂糖凝胶。

7.确定RNA的感染性和病毒产量

  1. 培养BHK-21细胞150毫米文化前进重新菜肴的3×10 6个细胞/皿24小时的密度，在37℃，5％的CO 2。
    注意:保持 BHK-21细胞中的α极限必需培养基补充有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，维生素，和青霉素/链霉素。
  2. 漂洗细胞单层，用10毫升冷溶液A（137mM的氯化钠，2.7毫米氯化钾，8.1毫的 Na 2 HPO 4，和1.5mM的KH 2 PO 4）的。通过处理分离从碗碟细胞用4ml胰蛋白酶-EDTA（0.25％）的，并通过离心收集他们在270×g下在台式离心机中2分钟。
  3. 重悬在50ml锥形管中并离心细胞沉淀用50ml冷溶液A的细胞悬浮液在270×g下2分钟。重复此清洗过程三次;在最后一次洗涤后，重悬细胞沉淀以2×10 7个细胞/ ml，在溶胶A的密度
  4. 混合细胞悬浮液的400μl的等分试样与2μ克在2毫米间隙的电击杯合成的RNA，并及时电穿孔与电穿孔的混合物最佳电穿孔条件下:980伏，99微秒的脉冲长度，以及5个脉冲（图4C）。
    注意:使用不经进一步纯化直接用于电穿孔协议6.5中合成的3 H-标记的RNA。
  5. 离开电穿孔的细胞在室温下10分钟，并转移至1.7 ml的微管中含有600μl的完全培养基中。
  6. 制备电穿孔的细胞的10倍系列稀释液在1毫升完全培养基的和板每个稀释的100μl的等分试样上unelectroporated BHK-21细胞（5×10 5）在6孔板的单层。
  7. 后4-6小时的孵育，覆盖含有10％胎牛血清的细胞用0.5％琼脂糖中极限必需培养基。孵育所述板4天，在37℃，5％的CO 2。
  8. 可视化的感染性中心秒（斑）由固定用7％的甲醛和染色用1％结晶紫，5％乙醇27（图6A）。
    1. 择:检查RNA电穿孔的细胞在18-20小时转染后通过免疫荧光实验27,73（图6B）的JEV蛋白质的表达，并且收获从RNA电细胞上清液在22和40小时后转染病毒滴定通过空斑测定27,63（图6C）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对于所有的正链RNA病毒，反向遗传学系统的可靠性和效率取决于一个克隆的全长cDNA的遗传稳定性，其序列相当于共识的病毒基因组RNA序列。27 图1示出五步骤策略的全长感染性cDNA的构建作为BAC为JEV的SA 14 -14-2 28:第1步，病毒RNA从JEV感染的BHK-21细胞（图1A）的细胞培养物上清液纯化;步骤2，合成四个重叠的cDNA的扩增子（F1至F4）跨越整个病毒基因组（图1B）;步骤3中，亚克隆的四个邻接的cDNA片段的插入BAC载体，创建PBAC / F1至PBAC / F4（图1C）;步骤4中，将克隆的cDNA 用于体外径流用SP6 RNA聚合酶， 即转录的变形例中，放置一个SP6启动子序列紧接病毒的5'末端（PBAC / F1的SP6）的上游侧，通过引入沉默点突变消除预先存在的内部XbaI位点在核苷酸9131，阿9134→T（PBAC / F3 正），并插入一个新的人工的XbaⅠ径流现场立即病毒3'-端（PBAC / F4 RO）（图1D）的下游;和第5步，一个全长的组件SA 14 -14-2的cDNA的BAC，PBAC / SA 14 -14-2（图1E）。 表1列出了在此克隆程序中使用的寡核苷酸。28

用于功能JEV cDNA的结构中，第一重要的步骤是使用纯化病毒RNA作为用于RT-PCR的模板的四个重叠cDNA片段的合成。 图2提供了一个代表性的结果为四RT-PCR产物是分别电泳在0.8％琼脂糖凝胶。这种凝胶清楚显示的全长cDNA的JEV被放大成四个重叠cDNA片段。偶尔，RT-PCR反应可能产生，因为引物时cDNA合成/扩增非特异性退火的一个或多个附加的病毒特异性或非特异性的产品，大多是比预期的产物更小，。另一方面，很少或没有预期的，因为在病毒RNA分离或不当的RT-PCR性能意外RNase污染的RT-PCR产物将被扩增。

下一关键步骤是一个partial-或全长的cDNA JEV在BAC，它是一种使用标准重组DNA技术相对简单的过程的克隆和修饰。69 图3给出了为 BAC克隆的含有纯化的代表性结果JEV SA 14 -14-2的通过捆在氯化铯-溴化乙锭梯度的全长cDNA。在该实验中，离心分离16小时，401700×g下后，两个不同的频带， 即 ， 大肠杆菌大肠杆菌染色体DNA的上方和超螺旋的BAC质粒DNA的下面，是在管的下长波紫外光中间可见。一个最小的体积（〜400微升）作为低级BAC DNA带的小心地戳一个孔与在管侧的注射器收集。接着，溴化乙锭是从BAC DNA由丁醇萃取萃取，将乙锭 - 自由BAC的DNA通过乙醇沉淀浓缩。

最后一步是从核糖核酸转染到允许细胞（图4）之后的全长的SA 14 -14-2 BAC（PBAC / SA 14 -14-2） 体外转录的合成RNA的特异性感染性的测定。该步骤包括三个顺序步骤:在3'步骤1，全长的线性化的SA 14 -14-2的cDNA病毒基因组（图4A）的末端;步骤2，从生产线性的cDNA合成的RNA通过径流转录（图4B）的;和第3步中，重组病毒在BHK-21转染的细胞合成的RNA（图4C）的救援。实验上，PBAC / SA 14 -14-2的两个独立的克隆，线性化用 XbaⅠ消化并用MBN处理以除去由XbaI位消化产生的四碱基的5'突出端。将线性化的BAC进行清理通过苯酚 - 氯仿提取，接着乙醇沉淀。两个纯化的BAC的线性化证实在0.8％琼脂糖凝胶（图5A）。酚 - 氯仿提取必须小心，以确保线性化BAC的无RNA酶的。每两个线性化的BAC的担任用于使用SP6 RNA聚合酶在米7 G（5'）ppp的存在下径流转录的cDNA模板（5'）的盖模拟。合成RNA的完整性被证明通过在0.6％琼脂糖凝胶上运行两个转录反应混合物的等分试样，以及一个参考1 kb的DNA梯（ 图 5B）。在这个简单的测定法中，主要的突出的RNA带总是迁移刚下面的3 kb的DNA参考乐队，似乎是尖锐的。然而，降解的RNA会对同一凝胶的拖尾外观。

感染性中心试验则是金标准，用于确定合成的RNA的特异性感染性。该测定是通过电穿孔的BHK-21细胞的RNA样品，播种的10倍系列稀释的电穿孔的细胞的等份在6孔板含幼稚BHK-21细胞（3×10 5细胞/孔 ），并覆盖琼脂糖进行到细胞单层。培育4天后，存活细胞用甲醛固定并用结晶紫小号olution量化感染性中心（斑块）的数量，其对应于递送到细胞（图6A）的感染性RNA分子的数目。由于用于体外转录的cDNA模板已被证明是无感染性的，直接用于电穿孔的转录反应混合物的27等分试样。电穿孔是用于RNA转染的优选方法;可选地，分子RNA可以通过使用DEAE-葡聚糖和阳离子脂质体的其它方法来进行转染。核糖核酸电穿孔是非常有效的，但"电弧"电脉冲的发生很少如果盐存在的电穿孔反应或如果电穿孔杯中被重用。病毒蛋白的在RNA转染的细胞中的表达进行了检查，使用抗NS1兔抗血清（图6B）免疫荧光实验。在RNA转染的细胞的上清液积累病毒颗粒的生产是一个通过空斑测定（图6C）alyzed。这些实验的结果清楚地表明，该cDNA衍生的合成的RNA是在感染性许可BHK-21细胞，产生重组病毒的高滴度。

寡核苷酸 序列一个 （5'至3'） 位置 b 极性
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578年至2603年反义
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 感
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532年至2553年反义
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 蚂蚁ISENSE
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800年至1821年感
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 反义
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 反义
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 感
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 反义
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10952-10977 反义
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 感
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10956-10977 反义
SP6F cataccccgcgtattcccac
TA 		感
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 反义
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 感
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 反义
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 感
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 反义
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 感
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		反义
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10670-10694 感
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10954-10977 反义
一个乙脑病毒序列用大写字母显示，和BAC序列表示小写字母。
b核苷酸位置是指JEV SA 14 -14-2（Genbank登录号JN604986）的完整基因组序列。

表1: 用于cDNA合成，PCR扩增，和BAC诱变寡核苷酸。

cDNA合成修饰图;显示了病毒 RNA 分离、亚克隆、组装过程。
图1。0;战略乙脑病毒SA 14 -14-2的全长cDNA 为BAC建设的病毒RNA从JEV颗粒（A）隔离。示出的是JEV的SA 14 -14-2的基因组RNA的示意图。 （B）的4重叠的cDNA片段合成（F1至F4）覆盖整个病毒基因组。 （ 三）亚克隆四个重叠的cDNA片段插入BAC载体，创造PBAC / F1至PBAC / F4。 （D）的变形例的克隆的cDNA 用于体外径流转录。 PBAC / F1的SP6是PBAC / F1的包含病毒的5'末端上游的SP6启动子序列的衍生物。 PBAC / F3 KO是PBAC / F3的衍生物，它包含一个无声的点突变（A→9134 T，星号）。 PBAC / F4 RO是PBAC / F4的衍生物包含病毒3'末端的下游人造的XbaⅠ决胜点。 （E STRONG>）全长SA 14 -14-2 BAC组装（PBAC / SA 14 -14-2）。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA电泳结果;凝胶显示按大小（以千碱基为单位）分离的 DNA 片段;分子标记。
图2.合成四个重叠cDNA片段（F1至F4）跨越的JEV的SA 14 -14-2 的全长基因组RNA。四个RT-PCR产物通过电泳在0.8％琼脂糖凝胶评价。男，1 kb的DNA阶梯。四cDNA片段的预期大小显示在凝胶图像的底部。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3.含纯化乙脑病毒的全长cDNA SA 14 -14-2 的BAC中 的 BAC质粒从大肠杆菌中分离大肠杆菌 DH10B由SDS-碱裂解法和通过捆在氯化铯-溴化乙锭梯度进一步纯化。介绍的是使用16×76毫米密封聚丙烯管的氯化铯，溴化乙锭梯度的一个例子。 请点击此处查看该图的放大版本。

cDNA线性化和RNA合成图;通过在BHK-21细胞中转染RNA进行病毒回收。
图4.概述传染性病毒的全长乙脑病毒SA 14 -14-2的cDNA组装在BAC 复苏 的 cDNA模板（一）线性化。全长的JEV BAC被切断与XbaⅠ和治疗MBN。 （二）合成的RNA转录物。将线性化的cDNA通过SP6 RNA聚合酶在米7 G（5'）PPP（5'）甲帽类似物的存在下转录。 （ 三）恢复合成JEVs的。 体外转录的RNA转染BHK-21细胞，通过电产生合成病毒的高滴度。 请点击此处查看该图的放大版本。

琼脂糖凝胶电泳cDNA和RNA转录本;DNA 条带大小;分子标记。
图5.合成的RNA的体外 使用全长BAC JEV作为cDNA模板转录。线性化的全长的JEV BAC，PBAC / SA 14 -14-2的（A）的生成。 PBAC的两个独立克隆/ SA 14 -14-2（CL.1和Cl.2）通过消化XbaⅠ和后续治疗MBN线性化。将线性化的BAC通过电泳在0.8％琼脂糖凝胶检查。 （ 二）通过径流转录生产合成RNA的。每两个线性化的BAC的用作SP6 RNA聚合酶径流转录的模板。两个转录反应的等分试样上的0.6％琼脂糖凝胶上运行。男，1 kb的DNA阶梯。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞培养物中的RNA感染性和病毒产量;条形图、斑块测定、显微镜结果。
从全长JEV BAC和合成病毒的恢复转录合成RNA的图6.具体感染性。BHK-21细胞是模拟电穿孔（模拟），或电穿孔而得fr处的RNA转录嗡每个全长的JEV BAC（CL.1和Cl.2）的两个独立的克隆。 （A）RNA感染力。将细胞覆盖有琼脂糖和，以4天转染后以结晶紫染色。核糖核酸感染是由感染性中心试验测定来估算的感染性RNA的电穿孔进入细胞（左面板）的量。另外，感染性中心的有代表性图像示（右图）。 （二）蛋白的表达。细胞在4孔室载玻片中培养。在20小时后转染（HPT）中的RNA电穿孔的细胞的病毒蛋白的表达是​​通过使用一个初级抗NS1兔抗血清和次级的Cy3缀合的山羊抗兔IgG（红色）免疫荧光分析进行分析。细胞核被counterstained用4'，6-二脒基-2-苯基（蓝色）。免疫荧光图像被叠加在它们相应的微分干涉对比图像。 （C）病毒的产量。将细胞培养于150毫米培养皿。在22和40 HPT积累了RNA电穿孔细胞的培养上清液感染性病毒粒子的生产是由斑块检测检查。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前的协议已被成功地用来产生全长感染性cDNA克隆的两种不同菌株（CNU / LP2 27和SA 14 -14-2 28）JEV，黄病毒，其功能性的cDNA已被证明是本来就很难构建和由于传播宿主细胞毒性和克隆基因的遗传不稳定性8,74-76该协议包括三个主要部分组成:第一，采用高保真逆转录酶最大化的病毒RNA的忠实cDNA拷贝合成/放大/ DNA聚合酶;第二，克隆含有毒序列（未公布的数据）的病毒的prM-E的编码区74,77,78在从最初的cDNA亚克隆到最终的全长cDNA组装步骤非常低拷贝数载体的BAC;第三，利用克隆载体的BAC，可容纳外来DNA与120-350 kb的，19-21的平均尺寸，这显然容忍较大的DNA樱雪RTS比其他克隆载体。这种克隆方法将是普遍适用于许多其他正链RNA病毒，特别是那些具有约10〜32 kb的大的RNA基因组。的感染性cDNA克隆的产生是在发展为RNA病毒反向遗传学系统的一个关键步骤，特别是对正链RNA病毒，因为它的基因组作为病毒mRNA是受宿主细胞的核糖体翻译成蛋白质。因此，病毒复制可以通过导入的cDNA衍生的基因组长度RNA分子进入易感宿主细胞启动。感染性JEV cDNA克隆的可用性，当用重组DNA技术结合起来，还增加了我们的病毒生命周期的各个方面的理解，在分子水平上，如基因表达73,79和基因组的复制。63,64，一个全长的JEV cDNA克隆已被证明是用于抗病毒疫苗28和基因递送载体的发展的有价值的工具。 80,81

如同所有的正链RNA病毒中，有在构建可靠官能的cDNA JEV从中高度传染性的RNA 可以在体外进行合成的多个关键步骤。理想的情况下，从全长cDNA的克隆转录合成RNA的顺序应该是相同的，所述病毒基因组RNA，特别是所需要的病毒RNA复制的起始的5'-和3'-端序列的60-62在当前的协议，正宗5'-和3'-末端确保通过将SP6启动子序列的病毒基因组的第一个腺嘌呤核苷酸的上游和定位一个独特人工的XbaⅠ限制性位点的最后的下游病毒基因组的胸腺嘧啶核苷酸，分别。封端的合成的RNA与由一个Xba I位线性化和MBN处理的cDNA德的径流转录被生产正宗5'和3'末端mplate使用SP6 RNA聚合酶底漆与M 7 G（5'），PPP（5'）的盖模拟。该协议可以以多种方式进行修改。 体外转录，另一个噬菌体RNA聚合酶（例如，T3或T7）可以在与它的良好定义的启动子序列一起使用。27作为一个径流位点，不同的限制性位点可以使用，如果它不存在在病毒基因组，如果合成的RNA从线性的cDNA与正宗的3'端结束。 3'-端核苷酸序列的重要性已被证明在核糖核酸感染性〜10倍的下降，当一个合成的RNA包含三个或四个病毒无关的核苷酸在其3'末端27在体外转录反应中，既第m 7 G（5'），PPP（5'）A和m 7 G（5'），PPP（5'）G帽类似物可同样用得好，病毒5后者虽然地方不相关的额外摹核苷酸上游'末端，但是这此外不改变的感染性或合成的RNA复制。27此外，除去从RNA转录通过DNA酶I消化的cDNA模板是没有必要的核糖核酸的感染性的测试，因为与cDNA模板本身不是感染性的。27

上述BAC技术已被应用到构建感染性cDNA克隆为少数正链RNA病毒，即，二JEVs，CNU / LP2 27和SA 14 -14-2 28（基因组的大小，〜11 kb的）; 2登革热病毒，BR / 90 26和NGC 29（〜11 KB）;牛病毒性腹泻病毒，SD1（〜12 KB）; 25两种经典猪瘟病毒，C和帕德博恩（〜12 KB）; 24边界病病毒，吉夫霍恩（〜12 KB）; 24猪繁殖与呼吸综合征病毒，PL97-1 / LP1（〜15 KB）; 30传染性胃肠炎病毒，PUR46-MAD（〜29 KB）; 16猫传染性腹膜炎病毒，DF-2（〜29 KB）; 32严重急性呼吸系统综合症冠 ​​状病毒，乌尔巴尼（〜30 KB）; 9中东呼吸综合症，EMC / 2012（〜30 KB）; 17和人类冠状病毒，病毒OC43（〜 31 KB）31使用的BACs用于cDNA结构的主要优点是大的，1或2拷贝BAC质粒的高遗传稳定性。然而，其非常低拷贝数的固有性质是因为BAC DNA和随之减少在BAC DNA的纯度相对于宿主染色体DNA的非常低的产率的也是一个很大的缺点，。在当前的协议，BAC DNA的产率通过生长大肠杆菌最大化大肠杆菌 DH10B在营养丰富的介质，的2xYT转化的感染性BAC PBAC / SA 14 -14-2。尽管这样的努力，平均产量仅在从500毫升的2xYT肉汤BAC DNA的〜15微克。而且，BAC DNA的纯度最好使用氯化铯 - 溴化乙锭密度梯度离心进行纯化达到的，而不是通常使用的基于列的质粒分离。但是，要记住重要的是，BAC转化E.大肠杆菌不应过度生长，因为它可能会危及克隆的cDNA的遗传稳定性，和更高的增长并不必然导致更大的产率或更高纯度的BAC DNA。

这里描述的协议是一个优化的，高效和简化的遗传稳定的全长感染性cDNA克隆作为BAC为JEV的构造和繁殖方法中，一个过程曾经认为实际上不可能。此相同的克隆策略，​​也可以应用于其它许多正链RNA病毒。在一般情况下，感染性cDNA克隆使我们介绍了各种突变（例如，缺失，插入，和点突变）的成病毒RNA基因组来研究它们的生物学功能中的病毒复制和发病机理。该cDNA为基础的反向遗传学系统使得能够开发和TES吨疫苗和靶向感兴趣的特定正链RNA病毒的毒力因子（多个）治疗的候选人。此外，这种感染性cDNA技术也可以用来作为病毒载体，能够表达外来感兴趣的基因（多个）用于生物医学研究中的许多应用。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢犹他州科学技术和研究基金对 YML 的支持，以及韩国国家研究基金会对 SIY 的支持（2009-0069679 和 2010-0010154）。这项研究得到了犹他州立大学犹他州农业实验站的支持，并被批准为期刊论文编号 UAES #8753。此外，作者感谢 Deborah McClellan 博士的编辑帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.分子克隆
2xYT 肉汤Sigma-AldrichY2377
[3H]UTPPerkinElmerNET380250UC放射性
50 ml 管Thermo Scientific （Nalgene）3114-0050
250 ml 瓶Beckman Coulter356011
琼脂糖Lonza50004
琼脂糖（低熔点）Life Technologies （Invitrogen）16520-100
AvaINew England BioLabsR0152S
AvrII新英格兰生物实验室R0174S
BamHI新英格兰生物实验室R0136S
BsiWI新英格兰生物实验室R0553S
BsrGI新英格兰BioLabsR0575S
丁醇Fisher ScientificA399-1 
氯化铯Fisher ScientificBP1595-1
氯霉素Sigma-AldrichC0378
氯仿Sigma-AldrichC2432致癌
DE-81 滤纸GE Healthcare Life Sciences3658-023
dNTP 混合物Life Technologies （Invitrogen）18427-088
大肠杆菌 DH10B Life Technologies （Invitrogen）18297-010
EDTASigma-AldrichE5134
乙醇 Sigma-AldrichE7023
溴化乙锭Sigma-AldrichE7637毒性和高诱变性
过滤柱（质粒大提试剂盒）Life Technologies （Invitrogen）K2100-26
冰醋酸Sigma-AldrichA6283刺激性
葡萄糖Sigma-AldrichG5400
糖原 罗氏10901393001
高保真 DNA 聚合酶New England BioLabsM0491S
异戊醇Sigma-AldrichI9392易燃
异丙醇 Amresco0918易燃
LB 肉汤Life Technologies （Invitrogen）12795-027
氯化锂Sigma-AldrichL9650
溶菌酶Amresco0663
氯化镁Sigma-AldrichM8266
M-MLV 逆转录酶Life Technologies （Invitrogen）18080-044
绿豆核酸酶New England BioLabsM0250S
针头 （18G， 20G）BD305196， 305175生物危害性 （锐器废料）
NotINew England BioLabsR0189S
寡核苷酸整合 DNA 技术定制寡核苷酸合成
PacINew England BioLabsR0547S
pBeloBAC11New England BioLabsER2420S （E4154S）
苯酚（缓冲液饱和）Life Technologies （Invitrogen）15513-039毒性和强腐蚀性
苯酚：氯仿：异戊醇Life Technologies （Invitrogen）15593-031毒性和强腐蚀性
苯酚：异硫氰酸胍Life Technologies （Ambion）10296-010、腐蚀性和刺激性
Pme INew England BioLabsR0560S
醋酸钾Amresco0698
RNase抑制剂Life Technologies（Invitrogen）10777-019
rNTP套装GE医疗保健生命科学27-2025-01
可密封聚丙烯管（16 & 76 mm） 贝克曼库尔特342413
SfiI新英格兰生物实验室R0123S
SMA I新英格兰生物实验室R0141S
乙酸钠Sigma-AldrichS2889
十二烷基硫酸钠Amresco0227
氢氧化钠Sigma-AldrichS5881
SP6 RNA 聚合酶New England BioLabsM0207S
离心柱（质粒小量制备试剂盒）Life Technologies （Invitrogen）K2100-11
注射器HSW NORM-JECT4200.000V0
T4 DNA 连接酶New England BioLabsM0202S
TrisAmresco0826
tRNA（酵母）Life Technologies （Invitrogen）15401-011
XbaI 新英格兰生物实验室R0145S
名称Company目录号评论
2。细胞培养
Alpha Minimal Essential MediumLife Technologies （Gibco）12561-049
锥形管 （50 mL）VWR21008-242
结晶紫 Sigma-AldrichC0775
培养皿 （150 mm） TPP93150 
比色皿（2 mm 间隙）哈佛仪器450125 
胎牛血清 Life Technologies （Gibco）16000-044
甲醛Sigma-AldrichF1635毒性和致癌
性谷氨酰胺Life Technologies （Gibco）25030-081
最低必需培养基Life Technologies （Gibco）61100-061
青霉素/链霉素Life Technologies （Gibco）15070-063
氯化钾Sigma-AldrichP3911
磷酸二氢钾Sigma-AldrichP9791
六孔板TPP92006
氯化钠Sigma-AldrichS3014
磷酸氢二钠Sigma-AldrichS3264
胰蛋白酶-EDTA （0.25%）Life Technologies （Gibco）25200-056
维生素Sigma-AldrichM6895
名称Company目录号评论
3。设备
琼脂糖凝胶电泳系统MupidMPDEXU-01
CO2 培养箱Thermo ScientificHeracell 150i
台式离心机 Thermo ScientificST16R
电穿孔仪哈佛仪器ECM 830
长波紫外线灯（手持式）UVPUVGL-58
台式离心机贝克曼库尔特368826
热循环仪Life Technologies （Applied Biosystems）GeneAmp PCR 系统 9700
涡旋仪Scientific IndustriesG-560
水浴Jeio TechWB-10E
有毒

参考文献

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  79. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).">Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).">Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).">Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

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