快速 原位 使用寡核苷酸探针在甲醛固定的大鼠脑组织上进行杂交以检测5-羟色胺综合征

摘要

本方案描述了一种快速且简化的 原位 杂交方法适用于多聚甲醛固定的脑组织，从而减少了使用新鲜冷冻组织时所需的复杂且耗时的步骤。该方法通过鉴定5-羟色胺5-HT受体验证其有效性。_2A 受体基因 htr2a 在大鼠中。

摘要

3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA；摇头丸）的毒性可能因急性血清素（5-羟色胺；5-HT）综合征而导致特定脑区血清素能mRNA表达的区域性变化。该假设可通过以下方法进行验证 原位 杂交检测5-羟色胺5-HT_2A 受体基因 htr2a过去，此类利用放射性核糖探针的实验操作较为困难，原因在于其流程复杂，需耗时数天才能完成，且该技术要求使用在无RNase环境中保存的新鲜冷冻组织，进一步增加了操作难度。近年来，短寡核苷酸探针的开发已简化了 原位 杂交程序，并允许使用多聚甲醛固定的脑切片，这类样本在实验室中更为常见。本文中，我们描述了一种在预固定脑组织上使用非放射性寡核苷酸探针的详细实验方案。本研究所用的杂交探针包括 dapB （编码二氢吡啶二羧酸还原酶的细菌基因）， ppiB （一个编码肽基脯氨酰异构酶B的管家基因），以及 htr2a （编码5-HT的血清素基因）_2A 受体）。该方法相对简单、成本低廉、可重复性强，且完成时间少于两天。

引言

5-羟色胺（5-羟色胺；5-HT）综合征是一种由促进5-HT的药物（如抗抑郁药）引起的急性神经功能障碍¹，同时也可见于娱乐性使用MDMA的情况²。与该急性综合征相关的分子机制，如情绪波动、学习和记忆障碍，目前尚未完全阐明^3,4。原位杂交是一种强大的研究工具，可用于检测和定量可能在单细胞水平表达的特定mRNA。传统进行原位杂交的方法是使用放射性标记的核糖探针，该探针可特异性地与目标基因杂交。然而，该方法的主要缺点在于需要复杂的、耗时的探针制备和杂交步骤，同时还需要获取保存在无RNase环境中的新鲜冷冻组织^5,6。

最近已开发出可与比核探针所需片段更短的RNA片段杂交的寡核苷酸探针⁷。此外，这些探针在不牺牲特异性的前提下可产生较低的背景信号⁸。这种新开发的探针技术可用于免疫细胞化学实验室中常见的经多聚甲醛固定的脑组织的原位杂交（in situ hybridization）。

在此，我们描述了一种实验方案 原位 使用寡核苷酸探针在多聚甲醛固定的 大鼠 脑组织上进行杂交，并将结果与新鲜冷冻脑组织中的发现进行比较^5,6本方案用于检验 MDMA 滥用会导致 5-HT 变化的假设_2A 受体基....

方案

以下所述的动物使用程序已获得罗斯大学兽医学院和佛罗里达大西洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。尽管本方案要求使用无菌技术和手套，但无需RNase-free环境。

1. 准备

1. 组织制备与切片
   1. 将大鼠随机分为三组：新鲜/生理盐水组（SAL；0.9% NaCl）、预固定/SAL组和预固定/3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA；详见表1）。
   2. 分别对SAL组和MDMA组大鼠腹腔注射1 ml/kg SAL和10 mg/kg MDMA，每2小时一次，共三次。让动物存活6天。
   3. 第7天，对大鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮联合5 mg/kg赛拉嗪，以实现深度麻醉（即角膜眨眼反射和尾夹反射消失）。
   4. 对于新鲜/SAL组，迅速断头处死大鼠并取出脑组织进行新鲜脑检测（详见参考文献⁵）。
   5. 对于预固定/SAL组和预固定/MDMA组，沿胸骨做一长约10–12 cm的切口，暴露胸骨末端。
   6. 用止血钳夹住胸骨末端，用锐利剪刀在两侧横向剪开膈肌，然后沿肋骨向上剪开，与肺平行。
   7. 一只手用小镊子夹住心脏腹侧尖端，另一只手用18 G 注射针刺入左心室（注意针头适配器端通过Y形硅胶管连接至冰浴的SAL和多聚甲醛容器及蠕动泵；参见参考文献

结果

使用寡核苷酸RNA探针（<25 nt），可在经多聚甲醛预固定和新鲜冷冻处理的脑组织制备的下丘脑细胞中检测到杂交信号，表现为红色斑点。htr2a mRNA分子存在于某些细胞中（实心箭头所示），而不存在于其他细胞中（空心箭头所示）。我们观察到，多聚甲醛预固定组织与新鲜冷冻组织之间无明显差异（图1）。成功的杂交结果可首先通过肉眼评估（图2）。我们发现，选定区域（以圆圈标记）与dapB探针杂交后，肉眼未观察到可见信号（图2A-B）；相反，与ppiB探针杂交的区域在整个检测区域内呈现均匀分布的信号（图2C-D）。在htr2a检测中，信号仅出现在特定核团内（箭头所示；图2E-F），尽管所有圈出区域均已与htr2a探针完成杂交。值得注意的是，MDMA切片中的信号强度相较于SAL切片较弱。杂交信号的详细特征可通过显微仪器进一步观察。与dapB探针杂交的细胞中未见红色斑点（<.......

讨论

主要关注点之一是 原位 杂交试验中，由于RNase酶的存在，选择适当的RNA保存技术至关重要。众所周知，这些酶广泛存在于细胞和环境中，可能影响实验结果。然而，通过将组织置于干冰/酒精溶液中，可迅速抑制酶活性。^5,12尽管快速固定对于使用核糖探针进行杂交至关重要¹³，关于寡核苷酸探针的实验条件，目前了解甚少。本研究使用寡核苷酸探针发现，经多聚甲醛预固定与在冰/乙醇溶液中快速保存的新鲜脑组织之间无明显差异。这表明，经多聚甲醛预固定的脑组织RNA对寡核苷酸探针杂交的质量无显著影响。由于预固定脑组织相比新鲜脑组织更易于切片，本方案为杂交实验提供了一种可选的组织制备方法。

我们认为，在水平摇床上将脑组织切片置于密封的保湿盒内并持续振荡，对实现成功的杂交至关重要。若未遵循这些步骤，可能导致杂交不均匀或背景信号过高。为排除假阴性或假阳性结果的可能性，实验应包含必要的对照切片。我们发现，dapB 探针未显示出可见信号。这并不意外，因为 dapB 是一种细菌基因，在哺乳动物细胞中通常不存在。相比之下，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RNAscope 阴性对照探针-DapB	Advanced cell diagnostic, INC	310098
RNAscope 预处理试剂 4	Advanced cell diagnostic, INC	320046
RNAscope 2.0 HD 试剂盒 - 红色	Advanced cell diagnostic, INC	310036
RNAscope 探针 - Rn-Ppib	Advanced cell diagnostic, INC	313921
大鼠 Htr2a	Advanced cell diagnostic, INC	300031
冷冻切片机	Leica	CM 1850
水平摇床	VWR	88032-088
杂交炉	Thermo Fisher Scientific	222000
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
疏水笔	Vector	H-4000
显微镜	Olympus	Provis AX70