方法文章

快速 原位 使用寡核苷酸探针在甲醛固定的大鼠脑组织上进行杂交以检测5-羟色胺综合征

DOI：

10.3791/53165

⸱

2015年9月23日

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种快速且简化的 原位 杂交方法适用于多聚甲醛固定的脑组织，从而减少了使用新鲜冷冻组织时所需的复杂且耗时的步骤。该方法通过鉴定5-羟色胺5-HT受体验证其有效性。2A 受体基因 htr2a 在大鼠中。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA；摇头丸）的毒性可能因急性血清素（5-羟色胺；5-HT）综合征而导致特定脑区血清素能mRNA表达的区域性变化。该假设可通过以下方法进行验证 原位 杂交检测5-羟色胺5-HT2A 受体基因 htr2a过去，此类利用放射性核糖探针的实验操作较为困难，原因在于其流程复杂，需耗时数天才能完成，且该技术要求使用在无RNase环境中保存的新鲜冷冻组织，进一步增加了操作难度。近年来，短寡核苷酸探针的开发已简化了 原位 杂交程序，并允许使用多聚甲醛固定的脑切片，这类样本在实验室中更为常见。本文中，我们描述了一种在预固定脑组织上使用非放射性寡核苷酸探针的详细实验方案。本研究所用的杂交探针包括 dapB （编码二氢吡啶二羧酸还原酶的细菌基因）， ppiB （一个编码肽基脯氨酰异构酶B的管家基因），以及 htr2a （编码5-HT的血清素基因）2A 受体）。该方法相对简单、成本低廉、可重复性强，且完成时间少于两天。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5-羟色胺（5-羟色胺；5-HT）综合征是一种由促进5-HT的药物（如抗抑郁药）引起的急性神经功能障碍1，同时也可见于娱乐性使用MDMA的情况2。与该急性综合征相关的分子机制，如情绪波动、学习和记忆障碍，目前尚未完全阐明3,4。原位杂交是一种强大的研究工具，可用于检测和定量可能在单细胞水平表达的特定mRNA。传统进行原位杂交的方法是使用放射性标记的核糖探针，该探针可特异性地与目标基因杂交。然而，该方法的主要缺点在于需要复杂的、耗时的探针制备和杂交步骤，同时还需要获取保存在无RNase环境中的新鲜冷冻组织5,6。

最近已开发出可与比核探针所需片段更短的RNA片段杂交的寡核苷酸探针7。此外，这些探针在不牺牲特异性的前提下可产生较低的背景信号8。这种新开发的探针技术可用于免疫细胞化学实验室中常见的经多聚甲醛固定的脑组织的原位杂交（in situ hybridization）。

在此，我们描述了一种实验方案 原位 使用寡核苷酸探针在多聚甲醛固定的 大鼠 脑组织上进行杂交，并将结果与新鲜冷冻脑组织中的发现进行比较5,6本方案用于检验 MDMA 滥用会导致 5-HT 变化的假设2A 受体基因 htr2a 脑组织中的 mRNA。我们首先对动物进行 MDMA 处理，随后进行多聚甲醛组织灌注， 原位 杂交的 thr2a 探针，以及数据分析。请注意 dapB （编码二氢吡啶二羧酸还原酶的细菌基因）作为阴性对照，且 ppiB （编码肽基脯氨酰异构酶B的看家基因）作为阳性对照。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以下所述的动物使用程序已获得罗斯大学兽医学院和佛罗里达大西洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。尽管本方案要求使用无菌技术和手套，但无需RNase-free环境。

1. 准备

  1. 组织制备与切片
    1. 将大鼠随机分为三组：新鲜/生理盐水组（SAL；0.9% NaCl）、预固定/SAL组和预固定/3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA；详见表1）。
    2. 分别对SAL组和MDMA组大鼠腹腔注射1 ml/kg SAL和10 mg/kg MDMA，每2小时一次，共三次。让动物存活6天。
    3. 第7天，对大鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮联合5 mg/kg赛拉嗪，以实现深度麻醉（即角膜眨眼反射和尾夹反射消失）。
    4. 对于新鲜/SAL组，迅速断头处死大鼠并取出脑组织进行新鲜脑检测（详见参考文献5）。
    5. 对于预固定/SAL组和预固定/MDMA组，沿胸骨做一长约10–12 cm的切口，暴露胸骨末端。
    6. 用止血钳夹住胸骨末端，用锐利剪刀在两侧横向剪开膈肌，然后沿肋骨向上剪开，与肺平行。
    7. 一只手用小镊子夹住心脏腹侧尖端，另一只手用18 G 注射针刺入左心室（注意针头适配器端通过Y形硅胶管连接至冰浴的SAL和多聚甲醛容器及蠕动泵；参见参考文献9）。
    8. 将SAL泵调至中等流速（约5 ml/min）启动，用镊子穿刺右心房以释放回流液体。维持SAL灌注30分钟。
    9. 将多聚甲醛泵调至中等流速启动，使冰浴的4%多聚甲醛灌注动物30分钟。
    10. 移除灌注装置并断头处死动物。沿颅骨中线做一从后向前的切口，掀开颅骨以暴露颅腔10。
    11. 用刮匙从颅腔中取出脑组织，放入含有25 ml 4%多聚甲醛的50 ml离心管中，置于4 ºC冰箱内固定24小时。
    12. 将脑组织转移至含25 ml 30%蔗糖溶液的50 ml离心管中，于4 ºC保存3天。最后将脑组织置于塑料袋中，于-80 °C保存备用。
    13. 将脑组织用包埋介质固定于持样头，在-26 ºC恒温冷冻切片机中冷冻。将新鲜冷冻脑组织切成20 µm切片，预固定多聚甲醛脑组织切成10 µm切片。通过轻轻接触切片的方式将其转移至室温载玻片上。
    14. 室温下空气干燥4小时。将切片载玻片密封于密闭袋中，于-80 °C保存备用。
  2. 脱水
    1. 从-80 °C冰箱中取出载玻片，将切片分配至以下三种检测之一：ht2a、ppiB（阳性对照）或dapB（阴性对照）；用圆珠笔标记并标注切片（勿用铅笔）。将载玻片浸入100%乙醇中，室温下5分钟。在通风橱中干燥5分钟。
  3. 预处理
    1. 向载玻片上的切片滴加20 µl预处理试剂1（碱性磷酸酶失活剂）。将载玻片置于湿润盒的支架上（注意盒盖已盖好，以维持高湿度，防止反应液蒸发）。
    2. 将湿润盒置于水平摇床上，低速轻柔振荡10分钟。用双蒸水（ddH2O）洗涤载玻片两次，每次2分钟。将载玻片浸入盛有150 ml预处理试剂2（断裂由多聚甲醛固定引起的交联结构）的200 ml烧杯中。在100 ºC下加热共5分钟（热诱导恢复RNA结构11）。
    3. 用ddH2O洗涤载玻片两次，每次2分钟。将载玻片浸入100%乙醇中5分钟。在通风橱中干燥5分钟。使用疏水笔在组织切片选定区域周围画圈（例如，非皮质结构，包括丘脑和下丘脑，如图2所示）。
    4. 向每个选定区域滴加10 µl预处理试剂3（增强探针渗透性），盖上湿润盒盖。将盒子放入配备水平摇床的杂交炉中，设定温度为40 ºC，轻柔振荡30分钟。用ddH2O洗涤载玻片两次，每次2分钟。

2. 杂交与扩增

  1. 分别吸取10 µl的htr2a、ppiB和dapB探针试剂至选定区域。用盖子盖好湿盒以防止试剂蒸发。在低速设置的水平摇床上轻轻振荡。将载玻片置于40 ºC烘箱中孵育2小时。
  2. 用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增-1试剂，振荡后于40 ºC孵育30分钟。
  3. 用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增-2试剂，振荡后于40 ºC孵育15分钟。
  4. 用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增-3试剂，振荡后于40 ºC孵育30分钟。
  5. 用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增-4试剂，振荡后于40 ºC孵育15分钟。
  6. 用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增-5试剂，振荡后于室温孵育30分钟。
  7. 用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。在每个选定区域加入10 µl扩增-6试剂，振荡后于室温孵育15分钟。再用洗涤缓冲液洗涤载玻片两次，每次2分钟。

3. 信号检测

  1. 将10 µl红色试剂加入每个选定区域（注意：该试剂为Red-B与Red-A按1:60比例混合而成，需立即使用）。将玻片置于室温下的湿盒中，放在水平摇床上，以低速轻轻振荡10分钟。
  2. 用(ddH2O)洗涤玻片两次，每次10分钟。将玻片放入60 ºC烘箱中干燥15分钟。将玻片置于通风橱内的二甲苯中5分钟。在每个选定区域滴加20 µl二甲苯基封片介质，并加盖盖玻片。

4. 图像采集

  1. 拍摄所选区域的数字显微照片（例如下丘脑 图1和图3使用 4× 和 20× 物镜进行放大观察。保存图像文件。

5. 颗粒图像分析

  1. 将图像文件拖放到 ImageJ 主窗口中。转到菜单栏，选择“Image”，然后从下拉菜单中选择“Type”，并选择“8-bit”。
  2. 选择“Adjust”，然后选择“Threshold”以打开对话框。在对话框中调整下限滑块的数值，以去除不需要的背景。转到菜单栏，选择“Analyze”，然后选择“Analyze Particles”以打开第二个对话框。
  3. 将粒子大小设置为 10，然后勾选“Show outlines”、“Display results”和“Summarize”选项。最后，点击“OK”以在对话框中查看粒子数据。

6. 电子表格计算

  1. 将数据输入 Excel 表格，并计算 SAL 组颗粒数的平均值作为基线。计算每个部分的百分比水平，并据此绘制图表（图 4）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用寡核苷酸RNA探针（<25 nt），可在经多聚甲醛预固定和新鲜冷冻处理的脑组织制备的下丘脑细胞中检测到杂交信号，表现为红色斑点。htr2a mRNA分子存在于某些细胞中（实心箭头所示），而不存在于其他细胞中（空心箭头所示）。我们观察到，多聚甲醛预固定组织与新鲜冷冻组织之间无明显差异（图1）。成功的杂交结果可首先通过肉眼评估（图2）。我们发现，选定区域（以圆圈标记）与dapB探针杂交后，肉眼未观察到可见信号（图2A-B）；相反，与ppiB探针杂交的区域在整个检测区域内呈现均匀分布的信号（图2C-D）。在htr2a检测中，信号仅出现在特定核团内（箭头所示；图2E-F），尽管所有圈出区域均已与htr2a探针完成杂交。值得注意的是，MDMA切片中的信号强度相较于SAL切片较弱。杂交信号的详细特征可通过显微仪器进一步观察。与dapB探针杂交的细胞中未见红色斑点（<...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

主要关注点之一是 原位 杂交试验中，由于RNase酶的存在，选择适当的RNA保存技术至关重要。众所周知，这些酶广泛存在于细胞和环境中，可能影响实验结果。然而，通过将组织置于干冰/酒精溶液中，可迅速抑制酶活性。5,12尽管快速固定对于使用核糖探针进行杂交至关重要13，关于寡核苷酸探针的实验条件，目前了解甚少。本研究使用寡核苷酸探针发现，经多聚甲醛预固定与在冰/乙醇溶液中快速保存的新鲜脑组织之间无明显差异。这表明，经多聚甲醛预固定的脑组织RNA对寡核苷酸探针杂交的质量无显著影响。由于预固定脑组织相比新鲜脑组织更易于切片，本方案为杂交实验提供了一种可选的组织制备方法。

我们认为，在水平摇床上将脑组织切片置于密封的保湿盒内并持续振荡，对实现成功的杂交至关重要。若未遵循这些步骤，可能导致杂交不均匀或背景信号过高。为排除假阴性或假阳性结果的可能性，实验应包含必要的对照切片。我们发现，dapB 探针未显示出可见信号。这并不意外，因为 dapB 是一种细菌基因，在哺乳动物细胞中通常不存在。相比之下，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了美国国立卫生研究院资助（R15DA029863）、佛罗里达大西洋大学本科生研究资助（M30014）以及罗斯大学兽医学院研究资助的支持。我们感谢国家药物滥用研究所（美国马里兰州罗克维尔）为本研究提供（±）3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（±MDMA）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RNAscope 阴性对照探针-DapBAdvanced cell diagnostic, INC310098
RNAscope 预处理试剂 4Advanced cell diagnostic, INC320046
RNAscope 2.0 HD 试剂盒 - 红色Advanced cell diagnostic, INC310036
RNAscope 探针 - Rn-PpibAdvanced cell diagnostic, INC313921
大鼠 Htr2aAdvanced cell diagnostic, INC300031
冷冻切片机LeicaCM 1850
水平摇床VWR88032-088
杂交炉Thermo Fisher Scientific222000
Superfrost Plus 显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-15
疏水笔VectorH-4000
显微镜OlympusProvis AX70

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234(2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

HTR2A Fast Red Image J RNA

相关文章