大鼠眶下神经慢性缩窄性损伤（IoN-CCI）用于三叉神经病理性疼痛研究

摘要

本文描述了一种用于研究三叉神经病理性疼痛的啮齿类动物模型。所述方法包括对大鼠眶下神经实施慢性压迫损伤的手术操作，以及术后用于检测提示持续性疼痛和异常性疼痛的自发性和诱发性行为变化的行为学测试。

摘要

动物模型是研究神经病理性疼痛病理生理学和药理学的重要工具。本文描述了用于研究大鼠三叉神经病理性疼痛的手术及行为学实验方法。为了特异性模拟三叉神经病理性疼痛综合征，通过松结扎对眶下神经（IoN）造成慢性压迫损伤（CCI）。本文介绍了一种经眶内入路暴露并结扎眶下神经的方法。在眶下神经结扎后，大鼠表现出自发性行为改变以及对von Frey纤毛刺激的反应异常，提示存在持续性疼痛和机械性异常性疼痛。行为学改变的发展过程可分为两个阶段。在IoN-CCI后的第一周（第1阶段），大鼠面部梳理行为显著增加且呈现不对称性，即面部擦拭动作主要集中在受损的眶下神经支配区域。i.e., 将属于更广泛全身梳理行为一部分的面部梳理（该行为在IoN-CCI后基本不受影响）与既不 preceding 也不 following 全身梳理的独立面部梳理行为区分开来，后者在IoN-CCI后显著增加。在此期间，对眶下神经支配区域的机械刺激反应性降低。这种低反应性会突然转变为极度的高反应性，即使非常微弱的刺激强度也能引发伤害性防御行为（第2阶段）。这些行为学改变与临床上报道的面部疼痛表现（i.e., 对面部有害刺激的反应）具有表型相似性，提示在结扎的眶下神经支配区域内存在感觉异常/感觉迟钝以及机械性异常性疼痛。

引言

体感神经损伤通常会导致感觉丧失。然而，在某些情况下，外周神经损伤为何以及如何引发慢性疼痛，目前尚不十分清楚。因此，疼痛性神经病变仍然是临床上难以治疗的病症¹，并显著降低患者的生活质量^2-3。动物模型是评估现有药物及新研发药物疗效的重要工具，同时也有助于揭示神经病理性疼痛发生与维持过程中的病理生理机制。转化性疼痛研究面临的关键挑战之一，是识别和测量动物的自发性疼痛（即，能够提示动物存在疼痛的生理、行为或其他表现，而这些表现并非由在动物基础状态下急性施加的探针刺激所引起）。本实验的总体目标是通过手术在大鼠中诱导眶下神经损伤，从而产生自发性和诱发性伤害性行为，用于研究三叉神经病理性疼痛的发生机制及其治疗方法。

定向的孤立面部理毛行为是评估大鼠自发性神经病理性疼痛的独特指标。在眶下神经（IoN）慢性压迫损伤（CCI）后，大鼠表现出自发行为的改变以及对触觉刺激反应的变化，提示存在持续性疼痛和机械性异常性疼痛⁴。在IoN-CCI后，大鼠面部理毛活动增加且呈现不对称性，即理毛动作主要集中在受损神经所支配的面部区域。相比之下，与面部有害刺激（例如，福尔马林注射）⁵不同，非疼痛性感觉干扰（即单侧触须剪除、眶下神经局部麻醉阻滞、在触须上涂抹矿物油）不会引起面部理毛行为的显著改变，或仅在刺激开始后的极短时间内（即最初几分钟内）出现短暂变化⁶。因此认为，IoN-CCI后出现的这种异常理毛行为是损伤神经支配区域内自发性强烈厌恶感的行为表现。这种IoN-CCI大鼠的行为与临床患者所描述的自发性疼痛具有高度相似性。后续研究进一步区分了两种面部理毛行为：一种是作为更广泛全身理毛行为组成部分的面部理毛（即“理毛过程中的面部理毛”），其在IoN-CCI后基本不受影响；另一种是既不 preceding 也不 following 全身理毛的伤害性感受相关面部理毛（即“孤立性面部理毛”），其在IoN-CCI后显著增加^7-9。从药理学角度而言，“理毛过程中的面部理毛”可作为评估药物非特异性效应（例如镇静作用）的理想对照指标，这类效应可能影响运动功能。两种类型的面部理毛中前肢运动模式完全相同。

在坐骨神经慢性压迫损伤（IoN-CCI）后，大鼠对触觉刺激的反应也出现改变，提示存在机械性异常性疼痛^{4, 10}在IoN-CCI术后第一周（或数周）内，大鼠不再对轻度或中度触觉刺激产生反应即， von Frey）刺激。这种低反应性随后会突然转变为极度的高反应性，即使非常微弱的刺激强度也会引发伤害性行为。高反应性的出现时间在大鼠之间可能存在差异，但大多数大鼠在术后三至四周内即表现出高反应性。

方案

伦理声明：动物的饲养和护理均按照国际疼痛研究协会（IASP）研究与伦理问题委员会的指南进行¹¹。本实验方案已获机构伦理委员会批准。

1. 受试者

1. 使用雄性 Sprague-Dawley 大鼠（到达时体重为 250–300 g）。
2. 将大鼠饲养在实底笼具中，置于湿度为 40–60%、室温为 21 ± 1 °C 的动物房内。
3. 自由供应水和饲料。
4. 维持反向的 12:12 小时明暗循环（光照开启时间为 20 时）。

2. 手术

1. 每只大鼠准备两段约6 cm长的铬制肠线结扎线（5-0），并将其置于无菌生理盐水中，以防止干燥变硬和脆裂。
2. 用戊巴比妥（60 mg/kg，腹腔注射）对动物进行麻醉，并给予阿托品（0.1 mg/kg，腹腔注射）。通过伸展一只后肢并用指甲轻捏脚趾间的蹼状皮肤以检测麻醉深度，确保施加足够的压力，观察动物是否出现肢体屈曲反应。若动物发生肢体屈曲，应追加戊巴比妥。
3. 剃除大鼠头部毛发，以便在两眼中心前后等距处沿正中线做一条长约25 mm的头皮切口。
4. 将大鼠头部固定于立体定位仪或其他头部固定装置中。将大鼠置于加热垫上以维持体温。
5. 在双眼上涂抹眼膏以防止干燥造成损伤。
6. 用酒精擦拭剃过的头部区域，然后使用碘伏。
7. 在颅顶正中做一皮肤切口，暴露颅骨和鼻骨。
8. 使用手术显微镜执行步骤 2.9 至 2.16。
9. 使用棉签和一对杜蒙特镊子，游离由上颌骨、额骨、泪骨和颧骨构成的眼眶边缘。用棉签吸除可能流出的血液。
10. 轻柔地用精密棉签将眼眶内容物推开，以暴露眶下神经（IoN），注意避免过度牵拉走行于IoN上方的前筛神经。使用精密棉签和Dumont镊子以分离动作将IoN从周围结缔组织中游离出来。若出现出血，可用棉签吸除血液。
11. 进行结扎时，将一段铬制肠线的一端沿额骨向下推送，位于眶上神经（IoN）内侧，并平行于IoN向下方推进数毫米。此时结扎线位于眶上神经与额骨之间并保持固定。
12. 将45度角弯曲的Dumont镊尖滑入眶下神经（IoN）下方，使其靠近结扎线。轻轻向外侧牵拉眶下神经，暴露结扎线及镊尖。用镊子夹住结扎线，随后将镊子从眶下神经下方向外侧抽出。
13. 从眼眶腔中拉出结扎线，直至结扎线的两端距离眶下神经（IoN）大致等距。
14. 用结扎线的两端打一个“滑结”，以便精确控制缩窄程度，并将结滑至眶下神经（IoN）处。继续滑动结，使IoN受到轻微可察觉的缩窄。在滑结之上打一个常规结，以保持缩窄程度恒定。即， 以防止滑结松脱）。
15. 剪断结扎线，使结的两端留出约 2 mm 的自由端。
16. 重复相同的步骤（2.11 至 2.15），在距离第一个连接位点 2 mm 处进行第二次连接。
17. 假手术组执行步骤 2.2 至 2.10。
18. 使用聚酯缝合线（4-0）缝合头皮切口，并将大鼠置于加热垫上使其恢复。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得离开无人看管，且在完全恢复前不得将其放回与其他动物同处的环境中。
19. 为避免镇痛药物对神经病理性疼痛发展产生预先干预效应，术后疼痛不应给予镇痛治疗。

3. 行为学测试流程

1. 在术前测试前，让大鼠至少适应饲养环境 8 天。
2. 在术前测试前，每天至少一次使大鼠适应测试程序，持续三天。
3. 在黑暗的房间内进行测试，测试区域中央上方 1 米处悬挂一个 60 W 的红色灯泡提供照明，使中央区域明亮而周围区域较暗，房间其余部分保持黑暗。
4. 确保有足够的背景噪音，以减少突发性听觉刺激的干扰。如有必要，提供白噪音。
5. 面部理毛行为的观察
   1. 将一只来自种群的大鼠放入一个无垫料的带盖塑料笼中，从饲养区转运至测试室。注意：理想情况下，转运过程应尽可能短，并尽量减少外界刺激。
   2. 将大鼠放入一个无垫料的透明塑料笼中（长 × 宽 × 高：24 cm × 14 cm × 17 cm），笼后放置一面镜子，并置于摄像机前方。
   3. 记录动物行为 10 分钟。记录期间，确保实验人员不在测试室内。
   4. 在放入下一只动物前，清洁观察笼。
   5. 确保由对大鼠实验分组情况不知情的实验人员分析所记录的行为。
   6. 记录 10 分钟内每次面部理毛行为的发生。注意：面部理毛定义为前爪接触面部区域的动作模式。
   7. 区分两种类型的面部理毛行为。如果一段理毛行为前后均未伴随身体理毛（i.e.，除面部外其他身体部位的理毛），则将该次行为归类为孤立性面部理毛；如果面部理毛前后立即发生身体理毛，则将该次行为归类为身体理毛过程中的面部理毛。
   8. 确定面部理毛行为的次数。
      1. 将面部理毛动作之间不超过 4 秒的时间间隔归类为单次行为内的间隔（i.e.，单次理毛行为内部动作之间的暂停）。
      2. 将面部理毛动作之间超过 4 秒的时间间隔归类为不同行为之间的间隔（i.e.，两次理毛行为之间的完全中断）。
6. 机械刺激测试
   1. 将最多 6 只大鼠一组，用带垫料的带盖笼子从饲养区转运至测试室。确保转运过程短且外界刺激最小化。
   2. 将大鼠单独放入带垫料的透明塑料笼中（长 × 宽 × 高：24 cm × 14 cm × 17 cm），笼子带有铰链盖，便于开合。
   3. 使用一组五根逐步增加强度的 von Frey 纤维丝。注意：使纤维丝弯曲所需的力量分别为 0.015 g、0.127 g、0.217 g、0.745 g 和 2.150 g。
   4. 让大鼠适应观察笼及伸展动作 10 分钟。每 30 秒打开一次笼盖，用塑料棒轻轻触碰笼壁。
   5. 当动物处于嗅探/无运动状态（i.e., 四肢着地，既未移动也未僵直，但表现出嗅探行为）时，在眶下神经（IoN）支配区域内、靠近须垫中心、围绕上唇须的有毛皮肤处施加第一根 von Frey 纤维丝。
   6. 根据以下反应类别对动物对刺激的反应进行评分⁴。
      1. 完全无反应记为 0 分。
      2. 刺激探测反应（i.e.，大鼠将头转向刺激物并探索该物体）记为 1 分。
      3. 退缩反应（i.e.，施加刺激时大鼠缓慢将头转开或迅速向后抽动，有时在刺激同侧出现一次面部擦拭动作）记为 2 分。
      4. 逃避/攻击反应（i.e.，大鼠被动地通过身体移动远离刺激物，蜷缩至笼壁一侧，或主动攻击刺激物，做出咬合和抓取动作）记为 3 分。
      5. 不对称面部理毛（i.e.，大鼠朝向受刺激面部区域连续进行至少三次不间断的洗脸动作）记为 4 分。
      6. 对每只动物按刺激强度递增顺序施加刺激。在一侧施加某一强度刺激后，先在另一侧施加相同强度刺激，再进入下一强度。随机化同侧与对侧刺激的顺序。注意：每次刺激前，动物必须处于嗅探/无运动状态。

结果

IoN-CCI 大鼠在术后表现出明显的孤立面部理毛时间增加（图1）。这种增加在术后第一周结束时达到峰值，随后几周逐渐下降。最近的多数研究发现，面部理毛行为显著增加可持续长达三周。假手术大鼠的面部理毛行为基本不受影响。

IoN-CCI 大鼠在术后第一周对 IoN 区域同侧机械刺激也几乎完全无反应（图 2）。在接下来的一周内，这种低反应性被高反应性所取代。不同大鼠出现高反应性的时间可能有所差异，表现为平均评分逐渐升高且个体间差异减小。研究发现，这种高反应性可持续长达术后 120 天。IoN-CCI 大鼠对对侧机械刺激的反应性也有轻微增加，但与假手术大鼠相比，其差异可能 barely 具有统计学意义。

讨论

IoN-CCI 模型最引人注目的方面在于，它提供了一种对自发性、非诱发性（神经病理性）疼痛的独特测量方法。大多数使用脊神经模型的神经病理性疼痛动物研究，仅关注伤害性行为（例如，发声和回缩反应），这些行为反映了对机械或热刺激的过敏性¹²。然而，患者最主要的临床主诉是持续性疼痛，而非痛觉过敏或触诱发痛¹³。

本文描述了眶下神经慢性压迫损伤（IoN-CCI）后两种神经病理性疼痛的评估指标：孤立性面部理毛行为（自发性疼痛）和对von Frey纤毛刺激的反应性（机械性异常性疼痛）。其他关于IoN-CCI后神经病理性疼痛行为的评估方法亦见于其他文献报道。 即热痛觉过敏¹⁴ 冷痛觉过敏¹⁵此外，新开发的口面部疼痛评估方法，例如口面部疼痛评估装置（Orofacial Pain Assessment Device, OPAD）^16-17 或以进食持续时间作为口面部伤害性反应的指标¹⁸可能成为IoN-CCI术后疼痛的有效评估指标。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铬制肠线	Dynek	CG504
戊巴比妥钠（Nembutal ）	药房
阿托品	药房
小型动物用剪毛器 - Favorita II	Aesculap	GT104
立体定位仪	Stoelting	51600
眼科软膏（Liposic）	药房
恒温监测系统	Harvard Apparatus	PY8 50-7221-F
棉签	药房
精密棉签	Qosina	10225
手术显微镜	Kaps	SOM 62
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-10
Dumont 镊子 - 微钝头尖端 (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
剪刀 - 钝头尖端	Fine Science Tools	14574-09
聚酯缝合线 - Mersilene (4-0)	Ethicon	R871H
数码摄像机	Sony	HDR-CX330E
Semmes-Weinstein Von Frey 感觉测定仪套装	Stoelting	58011