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溶剂动力学诱导膜酶中熵驱动速率加速机制的解析

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DOI：

10.3791/53168

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2016年1月16日

 , 
1Science for Life Laboratory, School of Biotechnology, KTH Royal Institute of Technology

本文内容

摘要

酶中水分子运输的通道影响活性位点的溶剂化和催化作用。本文介绍了一种基于计算机模拟（in silico）建模与实验相结合的策略，用于设计这些额外的催化基序。该方法将增进我们对溶剂动力学在酶催化中作用的理解。

摘要

酶催化作用是在水环境中进化而来的。然而，溶剂动力学对催化过程的影响目前仍缺乏充分理解，通常被忽视。研究酶中的水分子动力学及其相关的热力学效应极为复杂，涉及计算机模拟、核磁共振（NMR）实验和量热法等多种手段。连接酶活性位点与周围溶剂的水分子通道对于溶剂的置换和动态行为至关重要。本文所述方案可用于设计调控这些介导水传输的结构基序，从而影响酶的特异性、活性和热力学性质。本方法建立在理论与实验相结合的生物物理框架之上，即使研究人员此前不具备计算机建模或生物物理化学的专业背景，亦可应用该方法。通过测量水通道受阻的酶突变体在催化过程中伴随的焓变和熵变，该方法将推动我们在分子水平上对酶催化机制的理解。该方案可应用于膜结合酶及其他复杂体系的研究，有助于深入认识溶剂重排在催化中的重要作用，并为蛋白质设计与工程提供新的催化策略。

引言

水是生命化学的基础1。酶活性位点的水分子分布和溶剂化状态以一种高度复杂的方式影响配体结合1,2和催化反应3的焓变与熵变，其作用机制远超疏水效应的范畴2,3。核磁共振（NMR）4、量热法2以及对溶剂化蛋白的分子模拟已被用于揭示显式水分子在驱动配体结合5-8、特异性识别和活性调控2,9,10中的作用。本文中，我们提出一种独特的实验方法，用于评估溶剂分子置换对酶催化过程的热力学影响（图1）。我们的综合策略结合了计算机模拟、酶的定向改造与热力学分析（图1），有助于进一步阐明目前尚不清楚的溶剂动力学对催化反应的影响。

溶剂化酶活性位点中由水介导的氢键提供的稳定焓相互作用，可能被熵惩罚所抵消1。这些熵代价与受限于蛋白质空腔内的水分子自由度降低有关，相较于体相水分子，其运动自由度减少5。因此，有序水分子的释放可为配体结合1和催化反应3提供熵驱动力。溶剂动力学的一个关键方面是水分子在蛋白质内部与外部溶剂之间的交换过程4。伴随而来的活化能、焓和熵的变化11在分子层面上尚未完全阐明。通过阻断酶中负责水分子传输的特定通道，可评估溶剂动力学及其对活化能的贡献（图1）。此外，通过在不同温度下进行一锅法动力学实验，可以从较少的实验次数中提取多个底物的相对热力学活化参数（图1，右侧）。本研究的方法已应用于复杂的膜结合三萜环化酶体系，这类酶可生成对生命具有重要意义的多环萜类化合物12。该实验方案利用常规离心机即可实现较高产量的膜蛋白回收（10–20 mg/L）。

尽管酶是在水环境中进化的，但溶剂在促进催化过程中的作用通常被忽视。除了蛋白质动力学13,14能够形成具有与过渡态电荷互补的预组织活性位点15外，水分子的动力学特性对于高效的酶催化也可能具有重要意义。通过整合多种跨学科技术，我们的目标是推动对水动力学和热力学这一高度复杂领域的研究。使这些工具更易于被科学界获取，将有助于发展新的策略，用于酶工程和蛋白质设计，以改变其活性和特异性。

方案

1. 体外计算机 建模

  1. 从蛋白质数据库（PDB）下载目标蛋白的PDB结构。通过移除多余的亚基，并使用“Cell Neutralization and pKa YASARA 中的“预测”实验16对于膜结合型三萜环化酶，水盒的合适尺寸为 91x67x77 Å。手动调整催化活性氨基酸的质子化状态。
    注意：如有必要，可使用“编辑|交换|原子”命令将 PDB 文件中的底物类似物修改为真实底物。
  2. 使用 AMBER 力场套件中的“能量最小化”命令对结构进行最小化17采用粒子网格埃瓦尔德方法（PME）18 为考虑长程静电相互作用。根据标准设置确定范德华相互作用的截断距离。
    注意：“能量最小化”命令通过短暂的最速下降法最小化来消除构象应力，随后进行模拟退火（时间步长 2 fsec，每 10 步原子速度降低为原来的 0.9 倍）th 步骤）持续进行直至达到收敛即， 每个原子在200步内的能量降低小于0.012 kcal/mol。

2. 活性位点溶剂化与水分子进入的模型

  1. 模拟退火结束后，运行一段20纳秒的分子动力学（MD）轨迹，并通过“文件|另存为|模拟快照”命令生成至少10个快照，随后启动“开始模拟”。在标准计算机上，采用周期性边界条件和正则系综进行模拟。使用Berendsen控温方法将温度维持在298 K。
  2. 通过“编辑|删除|残基”命令删除2.1中获得的快照中的所有水分子以及可能存在的配体/底物，对快照进行预处理。使用“叠加|对象”命令将每个快照单独与原始PDB结构叠加，以确保所有结构处于相同的空间位置。将如此处理后的每个快照另存为新的PDB文件（使用“文件|另存为|PDB”命令）。
    注意：对于有经验的建模人员：可依据补充代码文件1中提供的模板编写脚本，以自动化完成此过程。
  3. 将2.2中已进行三维空间对齐的预处理快照（PDB格式）作为输入，导入至软件CAVER 3.019中。若仅分析少量快照，可在标准计算机上运行CAVER。采用0.7 Å19的探针半径，以确保检测到专用于水分子传输的通道。
  4. 在分子图形软件中可视化CAVER 3.0生成的通道。为便于通道的可视化，可使用补充代码文件2中提供的宏程序。

3. 计算机模拟 酶工程改造水分子分布模式与水动力学

  1. 根据 CAVER 3.0 软件生成的输出文件“summary.txt”中“ID”标题所列出的顺序，确定排名最高的通道。
  2. 通过目视检查（使用步骤 2.4 获得的模型），确定构成排名最高通道（3.1）且其侧链较小并朝向通道内部的氨基酸残基。利用“Swap Residue”命令，识别可通过增加空间位阻而阻断通道的单个氨基酸替换。首先通过目视检查确认通道已被阻断，然后重复本方案的步骤 1.2–3.1 进行验证。

4. 突变基因的表达

  1. 使用非重叠引物通过定点突变PCR对野生型基因引入突变20。
  2. 将含有目的基因的质粒DNA加入含有合适克隆菌株的感受态细胞的离心管中，冰上孵育30分钟。在42 °C水浴中进行45秒的热激转化。加入500 µl新鲜的富集培养基（2YT，16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl），在37 °C、200 rpm条件下孵育45分钟。通过将转化后的细胞涂布于添加适当抗生素的琼脂平板上进行筛选。
  3. 在确认突变基因的DNA序列后，使用上述热激法将质粒DNA转化至表达菌株中。对于膜结合型三萜环化酶的表达，使用BL21(DE3)菌株。
  4. 在添加适当抗生素的2YT培养基中，于37 °C开始培养5 ml过夜（O/N）的表达菌株培养物。
  5. 接种一个装有300 ml添加适当抗生素的2YT培养基的2 L带挡板摇瓶，使初始OD值达到0.05–0.09（在600 nm处测定）。在OD值为0.6–0.8时诱导表达蛋白后，将细胞沉淀冷冻并储存在-80 °C。
    1. 对于pD861载体中的膜结合型三萜环化酶，使用0.5至2 mM鼠李糖诱导，并在37 °C表达4小时，以获得较高的蛋白产量21。

5. 使用普通离心机进行膜提取及蛋白质纯化

  1. 配制以下缓冲液：重悬缓冲液（100 mM 磷酸钾，pH 7.5，添加蛋白酶抑制剂片剂）、去垢剂缓冲液（1% (v/v) Triton X-100，50 mM 磷酸钾，pH 7.5）和反应缓冲液（0.2% Triton X-100，50 mM 磷酸钾，pH 7.5）。
    1. 对于角鲨烯-藿烯环化酶或其他最适pH较低的膜结合酶，需将重悬缓冲液中的磷酸钾替换为柠檬酸盐。此类酶应使用以下缓冲液：去垢剂缓冲液（1% Triton X-100，60 mM 柠檬酸盐，pH 6.0）和反应缓冲液（0.2% Triton X-100，60 mM 柠檬酸盐，pH 6.0）。
      注意：若使用His标签进行纯化，需在重悬缓冲液中加入20 mM 咪唑（终浓度）。
  2. 在玻璃烧杯中称取冷冻细胞沉淀，使用匀浆器将细胞重悬于重悬缓冲液中，使终浓度为0.3 g细胞/ml。采用超声破碎法裂解细胞，设置振幅为80%，脉冲模式为开1秒、关1秒，共进行3个循环，每个循环50秒。
  3. 加入去垢剂缓冲液，使去垢剂终浓度为0.2% (v/v)。于4 °C下颠倒混匀1小时以达到平衡。在4 °C下以39,000 × g离心50分钟，保留上清液以获得膜蛋白组分。
    注意：若采用His标签纯化，每克细胞加入约1.5 ml Ni-NTA琼脂糖，4 °C孵育1小时。
  4. 通过离子交换或His标签纯化进行第一步纯化21。平衡缓冲液和洗脱缓冲液中均需添加0.2% Triton X-100。使用截留分子量为10 kDa的离心过滤装置将纯化后的蛋白浓缩5倍。
    注意：Triton X-100形成的胶束大小会导致去垢剂终浓度约为1%。
  5. 使用浓缩后的蛋白进行凝胶过滤精细纯化步骤，选择适用于球状蛋白分离范围为2 × 104–8 × 106的层析介质，并以反应缓冲液作为流动相。按照制造商说明书，使用Bradford Ultra试剂盒测定纯化蛋白的含量。

6. 动力学

  1. 用反应缓冲液配制新鲜的5 mM底物储备液。在30%振幅下超声处理2-5分钟，获得均匀乳液。
  2. 将恒温混匀仪预热至所需反应温度。使用外部温度计检测装有水的玻璃小瓶内部温度以确认温度准确。
  3. 对于单底物动力学实验，将乳化后的底物稀释至至少五个玻璃小瓶中，使各瓶中底物终浓度相同。
    1. 对于含多种底物的一锅法相对动力学实验，通过在每个小瓶中混合所有底物，制备至少五个相同的小瓶。对于疏水性三萜类化合物，底物终浓度应控制在10-200 µM范围内。
  4. 将玻璃小瓶在恒温混匀仪中预孵育10分钟，然后加入酶以启动反应。总反应体积建议为1 ml，振荡速度至少为1,200 rpm。
  5. 通过加入500 µl含100 µM癸醇（作为积分标准品）的乙酸乙酯终止不同时间点的反应。

7. 提取与热力学分析

  1. 通过涡旋振荡并手动剧烈摇动玻璃小瓶1分钟，对反应混合物进行萃取。在室温下，将玻璃小瓶于台式离心机中以9,600 × g离心10分钟。转移上层（有机相）至一空管中。加入额外的 500 µl 加入提取溶剂至反应管中，并重复提取步骤。
  2. 用 Na 干燥提取的反应混合物2SO4涡旋5秒，将离心管静置10分钟。使用台式离心机在室温下以9,600 × g离心1分钟。将提取后的样品转移至气相色谱（GC）进样瓶中。
  3. 对每种感兴趣的酶变体，重复步骤 6.1–7.2，使用至少四种不同的底物初始浓度（用于单底物动力学）和四种不同的温度（用于单底物和竞争性动力学）。
  4. 按照先前所述方法进行气相色谱分析3使用非极性色谱柱分析疏水性五环产物。将初始柱温设为 120 °C 并使用温度梯度 5 °C/分钟，具体取决于产品和色谱柱。
  5. 积分产物峰面积，并利用内标物峰面积（对应于 100 µM). 绘制每种产物的浓度（[P]）随反应时间的变化曲线（t）。对转化率低于10%的数据点进行线性回归，得到初始反应速率（V0由拟合直线的斜率根据下式给出：
    Static equilibrium equation, V₀=∂[P]/∂t, formula for scientific analysis.
    注意: 对于含多种底物的一步法相对动力学研究， V0 是其他底物影响下某一特定底物的初始反应速率。
  6. 单底物动力学作图 V0/[E] 对相应底物浓度作图。表观 k猫/KM 根据公式，该值由图表中线性部分的斜率给出：
    Michaelis-Menten equation, kinetic enzyme activity, rate formula, biological kinetics study.
    [S] 是反应中底物的浓度，[E] 是所用酶的浓度。 k猫/KM 相当于催化常数除以米氏常数。对每个温度和每个酶突变体重复该分析。
  7. 对于单底物动力学，根据过渡态理论进行热力学分析22
    Chemical kinetics formula, enzyme catalysis equation, thermodynamic parameters analysis.
    kb 是玻尔兹曼常数， h 普朗克常数， T 开尔文温度，以及 R 气体常数。对 ln(( 的图进行线性回归分析k猫/KM)/((kb*T)/h))) 与 1/T. 活化焓（ΔH‡由 (-斜率)* 给出R 以及活化熵（ΔS‡) 由（截距）给出R.
    注意：同样，可通过使用饱和底物浓度进行分析 k猫 如公式 3 中的速率常数
  8. 对于含多种底物的一步法相对动力学，获得相对表观动力学参数
    k猫/KM 数值来自23:
    (k猫/KM)A/(k猫/KM)B = V0，A/V0，B[B]/[A] (4)
    对于其 V0，A 指底物A在与底物B竞争条件下的初始反应速率。
  9. 对于含多种底物的一步法相对动力学，通过非线性回归获得相对于作为参照的A，B的相对活化热力学参数：
    Enzyme kinetics equation, ΔG‡ calculation, ln(kcat/KM) ratio, formula, biochemical process.
  10. 根据参考化合物 A 的活化焓和活化熵，计算底物 B 的绝对活化参数：
    Thermodynamic equations, chemical reactions, enthalpy and entropy changes, scientific analysis.

结果

通过in silico分析及对检测到的通道进行可视化（使用补充代码文件2中的脚本），表明水分子动态在酶促多环化催化中具有重要作用。根据实验方案第3节，发现S168是嗜酸脂环芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）三萜环化酶中一个通道内衬的“热点”氨基酸残基（图1，左中）。通过在in silico中引入S168F突变，可从视觉上观察到该通道被阻断（图1，左下）。

三萜环化酶催化多环产物生成的反应速率对温度高度敏感（图2A）。按照本方案（第4-7节）进行实验发现，当温度升高25 °C时，野生型酶催化五环产物生成的表观kcat/KM值增加至原来的50倍（图2A）。通过引入单点突变阻断个别通道，对实验测定的绝对表观kcat/KM值及其温度依赖性均产生显著影响（图2A）。

根据实验测定的动力学参数，利用公式3以及本方案第6-7节中针对单底物动力学的方法生成线性热力学图（图2B）。对于隧道被阻断的突变体，其活化熵和活化焓的显著变化表明水分子动力学在促进多环化级联反应中起关键作用（图2C，计算基于图2B）。此外，水分子通道发生改变的突变体表现出不同的活化吉布斯自由能（ΔG‡=ΔH‡-T*ΔS‡，图2B-C）。例如，在303 K时，S168F通道突变体的活化吉布斯自由能为14 kcal/mol，而野生型酶为16 kcal/mol。

按照第7节中的方案，通过单锅动力学实验（图3A），利用公式4可计算额外底物的表观kcat/KM 值。此外，通过在不同温度下进行竞争实验，可构建线性热力学图（图3B，公式5）。与单一底物动力学类似，相对于参考化合物，其他底物的相对活化焓和活化熵可直接从实验数据线性拟合的截距和斜率获得。通过参考化合物相关的热力学数据进行算术加和，可进一步评估活化过程热力学参数的绝对值（公式6）。根据本方案所得结果明确表明，水通道受阻的膜酶变体对不同尺寸底物的活化热力学参数表现出根本性差异（图3C）。

计算机模拟酶建模、溶剂化、基因表达、膜提取、动力学分析示意图。
图1. 实验流程概要：in silico 计算机建模与实验性蛋白质设计及热力学分析相结合，有助于深入理解溶剂动力学对酶催化作用的影响。 请点击此处查看该图的放大版本。

酶动力学数据：表观 k_cat/K_M 与温度的关系（A, C）；Arrhenius 图（B）。表格，图表。
图 2. 野生型及隧道突变体从单底物动力学获得的活化热力学参数。（A）由实验数据并通过公式 1 和 2 获得的表观 kcat/KM 值。（B）利用过渡态理论对实验数据进行线性拟合并应用公式 3 进行热力学分析。（C）由（B）中的图计算得到的活化热力学参数。折叠前的角鲨烯底物以虚线表示形成/断裂的化学键。请点击此处查看此图的放大版本。

酶动力学表格、阿伦尼乌斯图、活化参数；酶变体的数据分析。
图 3. 野生型及隧道变体在不同底物下的活化热力学参数。（A）通过单锅动力学实验，利用公式 4 计算得到的相对 kcat/KM 值。（B）利用公式 5 对不同温度下的动力学数据进行热力学作图。（C）利用公式 6 计算得到的绝对活化热力学参数，参考底物为 图 2 中的角鲨烯。底物中形成或断裂的化学键以虚线表示。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

获得高质量野生型膜酶及其通道突变体实验热力学数据最关键的步骤包括：1）计算机模型的构建；2）均一纯化的蛋白质；3）乳化底物储备液；4）动力学实验过程中温度的控制；5）使用内标法提取反应混合物。

计算机模型的构建得益于使用具有用户友好界面并支持多种平台的软件，从而大大简化了建模过程。因此，本实验方案基于 YASARA 建模套件16，以确保即使缺乏建模经验的研究人员也能顺利实施本策略。用于识别水通道的计算机模型理想情况下应基于目标酶的晶体结构24。为此，蛋白质数据库中丰富的晶体结构资源具有重要价值。根据我们的经验，成功构建通道识别模板的一个关键环节是保留晶体结构中的结晶水分子。在进行分子动力学模拟时，使用溶剂化酶体系盒同样至关重要，此类模拟可在普通计算机上运行。来自 Alicyclobacillus acidocaldarius 的三萜环化酶在分子动力学模拟过程中在水中保持稳定3。然而，对于可能不稳定的酶，或许需要保留晶体结构中的去垢剂分子和/或使用细胞膜模拟环境，以支持更长时间的分子动力学模拟。可以预见，即使对于结构高度复杂的靶标，其能量最小化的晶体结构仍可通过本方案提供重要的反应机理信息，尽管该方法无法捕捉通道结构组织的动态特征。

CAVER19 的基础模式仅需单个或少量快照作为输入，非专业人员在普通笔记本电脑上即可使用。根据我们的经验3，瓶颈半径（即 最狭窄处的半径）小于 1 Å 的通道对水分子可能具有重要意义，特别是当晶体结构中的水分子位于预测通道内部时（图1，中左）。另一方面，较大的瓶颈半径可能意味着该通道可用于底物进出活性位点的运输过程10。补充代码文件2中的脚本可供非专业人员用于预测通道的可视化。未来的实验将揭示同源建模是否能达到足够高的分辨率，以实现对水分子网络及其动力学的原子级研究。阐明在活性位点存在或不存在配体的情况下进行分子动力学模拟如何影响通道识别过程，也具有重要意义。

膜蛋白的动力学研究可能构成巨大的挑战25。本文所述方案基于一种简单的膜提取方法，可在无需使用超速离心机等昂贵设备的情况下获得膜酶。以凝胶过滤作为最终纯化步骤，可去除潜在的残留膜颗粒，并有助于确定合适的去垢剂环境25。

从本实验方案中获得可重复的动力学结果，关键在于通过超声处理将底物储备液乳化。仅通过涡旋振荡将疏水性底物稀释于反应缓冲液中，会形成不均匀的底物-去垢剂混合物。非乳化的底物溶液在移液时会导致浓度不可重复（已通过定量气相色谱法确认），从而无法准确测定初始反应速率。相反，正确乳化的储备液在移液时应能获得初始速率的良好线性回归分析结果，其决定系数（R2）应在0.98–0.99范围内。疏水性底物的另一个重要方面是其在底物-去垢剂混合物中的表观溶解度和可利用性。事实上，无法使三萜环化酶达到参考底物角鲨烯的饱和状态。因此，本文中提供的为表观 kcat/KM 值，这些值可能同时包含结合与化学反应步骤的贡献。然而，已有研究表明，对于三萜环化酶催化的多环化级联反应，kcat/KM 的限速步骤为化学反应步骤3。

使用外部温度计验证反应玻璃小瓶内部的实际温度至关重要。然而，对于具有重要恒定表观特性的变体，线性拟合效果可能较差 k猫/KM 不同温度下的数值。本文特别强调了S168F变体的这一特性（图 2A) 活化焓接近于零 (图2B 和 2C）。表观上极微小的温度依赖性变化 k猫/KM，可能导致观测到的活化熵Δ的不确定性S‡ (即， 线性图中的截距 图2B）。原则上，观察到的活化熵也可能受到不同变体中活性酶丰度差异的影响，而仅通过测定蛋白质浓度无法检测到这种差异。当在同一个反应体系中混合多种底物时，实验误差有望降低，因为在这些条件下，所有不同的底物都与相同量的酶相互作用（公式4）。使用添加了内标物的提取溶剂对于校正提取过程和/或气相色谱进样过程中的差异至关重要。

过渡态理论已成功应用于酶学研究26。这一重要的理论框架最初是为气相中的单分子反应而发展的。然而，已有研究表明，酶主要通过降低经典活化能垒来发挥作用26。本文中假设透射系数为1，该假设可能影响所测得的活化焓和/或活化熵。量子隧穿效应以及其他非经典效应（如过渡态的重新跨越）对催化的贡献大约可达1,000倍，相当于约4 kcal/mol的能量降低26。可以看出，野生型酶表现出的活化熵（在328 K时为16 kcal/mol，图2C）远大于由非均匀透射系数引起的此类非经典效应。在使用本方案比较野生型与隧穿突变体的活化热力学参数时，透射系数的影响应当会减小。

活化吉布斯自由能（ΔG‡）由焓变（ΔH‡）和熵变（-T*ΔS‡）两部分组成。酶在催化过程中溶剂的重排可能影响这两个参数。本实验方案旨在通过整合一系列相关且易于使用的in silico计算工具以及必要的生物物理实验框架，促进对这些现象的研究。该方法预期可用于研究多种酶促过程，包括膜结合酶的催化作用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢瑞典研究理事会（VR）通过青年研究者资助项目 #621-2013-5138 为本工作提供资金支持。感谢皇家理工学院（KTH）PDC 高性能计算中心提供计算支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
YASARAYASARA Bioscienceshttp://www.yasara.org/分子建模与模拟程序 
CAVER CaverSofthttp://caver.cz/用于分析蛋白质中通道的工具，学术用途可免费授权
Bradford UltraExpedeonBFU1L, BFU05L适用于含高达1%去垢剂溶液的蛋白质定量
Potter-Elvehjem匀浆器VWR432-0205, 432-0217用于冷冻细胞沉淀的匀浆处理
蛋白酶抑制剂混合片剂Roche4693159001蛋白酶抑制剂
离心过滤单元MilliporeUFC901008用于蛋白质浓缩的离心过滤装置，截留分子量10 kDa
Thermomixer Eppendorf5382000015用于样品孵育的温控混合仪

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CAVER 3 0
溶剂动力学诱导膜酶中熵驱动速率加速机制的解析
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