方法文章

通过16S rRNA基因测序与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定罕见细菌病原体

DOI：

10.3791/53176

⸱

2016年7月11日

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1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

本文内容

摘要

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基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）与分子技术（16S rRNA 基因测序）可实现对常规诊断中罕见细菌病原体的鉴定。本方案的目标在于结合这两种技术，从而获得更准确、更可靠的数据。

摘要

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存在多种罕见且因此描述尚不充分的细菌病原体，据报道可导致免疫功能低下患者发生严重感染。大多数情况下，仅有一些少量数据（多以病例报告形式发表）用于研究这些病原体作为感染因子的作用。因此，为了明确此类微生物的致病特性，有必要开展包含大量此类细菌的流行病学研究。此类监测研究中所采用的方法必须满足以下标准：菌株鉴定需符合现行命名法规且准确可靠，操作简便（具有稳健性），适用于常规诊断并具有经济性，且能够在不同实验室之间产生可比结果。通常，在常规检测中鉴定细菌菌株有三种策略：1）表型鉴定，通过表征细菌的生化与代谢特性进行鉴定；2）分子技术，如16S rRNA基因测序；3）基于蛋白质组学的新型方法——质谱分析。由于质谱分析和分子技术是鉴定多种细菌物种最具前景的工具，本文将重点描述这两种方法，并讨论其应用中的进展、局限性及潜在问题。

引言

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在常规诊断中，罕见病原体的准确鉴定受到限制，原因是传统的培养和生化方法操作繁琐且有时结果不可靠。此外，临床微生物学实验室每天需要处理大量病原体，数量从数百到数千不等，因此必须依赖自动化系统。除了实现高通量日常检测外，还需精确鉴定细菌种类，因为不同菌种的抗菌药物敏感性模式存在差异，准确鉴定可为临床医生选择合适的抗生素提供关键信息（例如，Enterococcus spp.、Acinetobacter spp.）12,43。

自动化微生物鉴定系统（aMIS）采用标准化的酶促反应组来表征细菌分离株的代谢特性 13,15,16,26,27尽管这些系统中使用的试剂盒采用了大量不同的生化反应， 例如， 本研究中所用aMIS的GN卡中的47 52，该策略仅能对有限种类的细菌实现可靠鉴定。此外，该数据库作为一个高级专家系统，明显侧重于检测具有医学重要性的相关及高度相关细菌 13,15,16,36另外两种在实验室中广泛使用的系统也采用这种生化方法进行细菌鉴定。近期研究表明，本研究中使用的aMIS与其中一种竞争系统在鉴定准确性方面相当（分别为93.7%和93.0%），而3rd aMIS在物种水平上的鉴定准确率仅为82.4% 35这些差异可能源于基础鉴定数据参考的质量、试剂盒和软件的版本、代谢差异以及技术人员的操作熟....

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方案

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1. 细菌DNA的提取

  1. 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液的配制
    1. 称取1.65 g Na2HPO4 x 2H2O、0.22 g NaH2PO4 x 2H2O 和 8.80 g NaCl 置于烧瓶中，加入蒸馏水定容至 1,000 ml，调节 pH 至 7.4。使用细菌过滤器（0.22 µm）过滤溶液，以供最终使用。
  2. 革兰氏阴性菌的DNA提取
    1. 将患者样本划线接种于合适的培养基（例如，哥伦比亚血琼脂），鉴定并分离潜在病原体。
    2. 制备纯培养物，并进行革兰氏染色，以确定菌体形态并确认培养物的纯度49。
    3. 用1 µl一次性接种环挑取单个细菌菌落，转移至含有1 ml PBS溶液的无菌2.0 ml离心管中。
    4. 将该悬浮液在恒温混匀仪中95 °C孵育10分钟。孵育后，使细菌裂解液（含溶解的DNA）冷却至室温，可直接用于扩增，或于-20 °C保存以备后续使用（图1a）。
  3. 革兰氏阳性菌的DNA提取
    1. 将患者样本划线接种于合适的培养基（例如，哥伦比亚血琼脂），鉴定并分离潜在病原体。进行革兰氏染色以....

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结果

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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种新颖、快速且低成本的微生物常规诊断方法。通过MALDI-TOF MS进行细菌种属鉴定所获得的谱图主要由核糖体蛋白组成，同时也包含其他“在不同环境条件下受干扰极小、具有持家功能的高度保守蛋白” 17该mMIS数据库包含大量参考光谱，即使是临床分离物中罕见的细菌也能被准确鉴定。 7,56,57. 评分值反映了鉴定出的物种的可靠性。评分高于2.300表示物种鉴定高度可信；评分在2.000至2.300之间表示物种鉴定可靠；评分在1.700至2.000之间表示物种鉴定较可能；评分低于1.700则不可信。当出现多个物种的评分均高于2.000时，需采用额外的检测方法，因此我们结合了多种技术，包括16S rDNA测序、API鉴定系统，以及针对细菌形态学和/或表型特征的技术，如革兰染色和运动性检测。 等。 若分值低于1.700，则需采用上述检测方法以实现可靠的物种鉴定。近期已有研究证实，可结合使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）与16S.......

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讨论

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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和16S rRNA基因测序均可用于鉴定大量不同种类的细菌。MALDI-TOF MS是一种快速、经济且操作简便的方法，且已有大量细菌质谱数据库可供使用。因此，MALDI-TOF MS是一种快速、经济高效且可靠的筛查方法，适用于以罕见细菌病原体为重点的研究17,20,39,51。在一项比较MALDI-TOF MS与其他表型鉴定方法的前瞻性研究中，Seng et al. 证实了MALDI-TOF MS在成本效益和速度方面的优势59，Tan et al. 报道其在实验室环境中每年可将细菌鉴定所需的试剂和人力成本降低56.9%62。Gaillot et al. 的研究也支持了此类成本的降低28

另一方面，16S rDNA测序耗时更长、操作繁琐，且需要专业人员进行分析34。然而，这两种方法均适用于常规诊断，并已证明联合使用可提高结果的可靠性与鉴定准确性，尤其在结果存疑时更具.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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作者谨向 Enno Jacobs 教授致以诚挚感谢，感谢他持续提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CHROMASOLV，HPLC 级水，1 LSigma-Aldrich Chemie, München, Germany270733
Tissue Lyser LTQiagen, Hilden, Germany85600振荡式匀浆器
玻璃珠 1.0 mmVWR International, Darmstadt, Germany412-2917
Thermomixer 5436Eppendorf, Hamburg, Germany2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen, Hilden, Germany51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U)Qiagen, Hilden, Germany201225
正向引物 TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)biomers.net, Ulm, Germany -
反向引物 RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)biomers.net, Ulm, Germany -
Mastercycler Eppendorf, Hamburg, Germany- 热循环仪
反应管 1.5 mlSARSTEDT, Nümbrecht, Germany72,692
反应管 2 mlSARSTEDT, Nümbrecht, Germany72,693,005
PCR 8孔管条盖Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany711040X
PCR 8孔软管条Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany711030X
Sharp R-ZV11 Sharp Electronics, Hamburg, Germany-微波炉
Titriplex III (EDTA Na2-盐脱水物；1 kg)Merck, Darmstadt, Germany1084211000
SeaKem LE 琼脂糖Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany849006
SmartLadder SF - 100 至 1,000 bpEurogentec, Lüttich, BelgiumMW-1800-04
溴酚蓝 (25 g)Sigma-Aldrich Chemie, München, GermanyB0126
二甲苯青 FF (10 g)Sigma-Aldrich Chemie, München, GermanyX4126
ComPhor L Maxi Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany-
溴化乙锭溶液 1% (10 ml)Carl Roth, Karlsruhe, Germany2218.1
Gel Doc 2000Bio-Rad Laboratories, München, Germany-凝胶成像系统 
ExoSAP-IT (500 次反应)Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom78201
缓冲液 (10x) 含 EDTA Life Technologies, Darmstadt, Germany402824
BigDye Terminator Kit v1.1Life Technologies, Darmstadt, Germany4337450
Hi-Di 甲酰胺 (25 ml)Life Technologies, Darmstadt, Germany4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)Qiagen, Hilden, Germany63206
3130 遗传分析仪Life Technologies, Darmstadt, Germany-测序仪
带条形码的 MicroAmp 光学 96 孔反应板Life Technologies, Darmstadt, Germany4306737
3130 遗传分析仪，96 孔板底座Life Technologies, Darmstadt, Germany4317237
3130 遗传分析仪，96 孔板固定夹Life Technologies, Darmstadt, Germany4317241
3130 遗传分析仪，孔板密封垫Life Technologies, Darmstadt, Germany4315933
3130 遗传分析仪，POP-7 聚合物，7 mlLife Technologies, Darmstadt, Germany4352759
3130 遗传分析仪，4 毛细管阵列，50 cmLife Technologies, Darmstadt, Germany4333466
测序分析软件 5.4Life Technologies, Darmstadt, Germany-
microflexBruker Daltonik, Bremen, Germany-我们的 mMIS
VITEK MSbioMérieux, Nürtingen, Germany 第2代 mMIS
flexControl 3.4Bruker Daltonik, Bremen, Germany-设备控制软件
Biotyper 实时分类 3.1 (RTC)Bruker Daltonik, Bremen, Germany-分析软件
α-氰基-4-羟基肉桂酸 (HCCA)，1 gBruker Daltonik, Bremen, Germany201344
肽校准标准品 IIBruker Daltonik, Bremen, Germany222570
MSP 96 靶板，抛光钢Bruker Daltonik, Bremen, Germany8224989
peqGREENpeqlab 37-5010
MALDI Biotyper Galaxy Bruker Daltonik, Bremen, GermanyPart No. 1836007 自动化样品制备系统
Vitek 2 bioMérieux, Nürtingen, Germany 我们的 aMIS
MicroScan Beckman Coulter, Krefeld, Germany第2代 aMIS
BD Phoenix™ 自动化微生物系统BD, Heidelberg, Germany第3代 aMIS
Staphylococcus aureus 亚种 aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, FrancePCR 阳性对照 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoul....

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16S rRNA Sanger

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