线性共价闭合（LCC）DNA微载体（DNA微环）是一种非病毒基因递送载体，具有高效的转染效率，适用于任何DNA递送应用。in vivo生产系统简单、快速且可规模化。以下方案提供了DNA微环制备的可视化分步操作说明。
本文内容
摘要
摘要
我们构建了线性共价闭合（LCC）DNA微载体，作为一种通过简单的体内平台产生的非病毒基因递送载体替代方案。in vivo。DNA微环具有更高的安全性，并能高效地将DNA载荷递送至靶细胞。传统的DNA载体携带不必要的原核序列，包括抗生素抗性基因、CpG基序以及细菌复制起始位点，这些成分可能引发宿主免疫反应。此外，由于其较大的分子量，传统DNA载体的生物可利用性也受到限制。其环状结构还可能导致染色体整合，从而引发插入突变。
从DNA微型载体中切除细菌序列，仅保留目的基因（GOI）及必要的真核表达元件。我们的LCC DNA微型载体（或称DNA迷你串）不含具有免疫原性的细菌序列，因而提高了其生物利用度和目的基因的表达水平。若载体整合至染色体中，LCC DNA迷你串将致死性地破坏宿主染色体，从而从增殖的细胞群体中清除潜在的危险突变体。因此，DNA迷你串兼具“微环”DNA的优点，同时避免了载体意外整合事件的发生。与传统质粒及其同源的共价闭合环状（CCC）对应物相比，DNA迷你串表现出更优的生物利用度、转染效率和胞质动力学特性，因而实现靶细胞有效转染所需的阳离子表面活性剂用量更低。
我们构建了一步诱导型系统 体内 用于生产DNA迷你环的系统 大肠杆菌 操作简便、快速且可扩展。
引言
目标是利用一种简单且高效的一步热诱导方法，制备可放大的线性共价闭合（LCC）DNA微载体 体内 DNA微环生产系统。DNA微环提供了一种安全有效的非病毒性DNA递送策略。它结合了LCC载体的安全性与DNA微环的高效性，同时在不降低转染效率的前提下，为病毒来源载体提供了更安全的替代方案。
为了使转基因递送系统取得成功，DNA 载体必须进入目标宿主细胞并表达其所编码的转基因。在实际操作中，需要克服多种细胞屏障，尤其是在哺乳动物系统中。为避免被血清核酸酶降解以及被网状内皮系统免疫识别，DNA 载体必须与目标系统具有生物相容性和免疫相容性。裸露的 DNA 会迅速被血浆中的核酸酶消化，而质粒膜由致密的脂蛋白屏障构成，因此 DNA 载体必须能够快速穿过靶细胞的细胞膜。一旦进入细胞，载体必须穿越细胞质，并穿过核膜进入细胞核，以实现转基因的表达。非病毒基因递送技术主要致力于增强组织和细胞靶向性。然而，使用传统质粒进行这些技术会因其中含有免疫原性细菌序列而降低转染效率，这些序列会迅速导致基因表达沉默1,2。传统质粒通常携带抗生素抗性基因，以用于原核系统中的维持。然而，这些基因可能在人类宿主体内产生潜在的不良反应，或通过水平基因转移使宿主天然菌群获得抗性。传统质粒还含有二核苷酸 CpG 基序2，可能引发非预期的免疫刺激反应，从而可能降低或抑制转基因的表达。
由于仅由真核表达盒组成，DNA微环载体（如DNA微环）3是基因递送的更优选择，因其尺寸更小且不含可刺激免疫的原核元件，从而表现出更高的胞外和胞内生物利用度以及增强的基因表达水平4. 减小的载体尺寸在抵抗与剪切力相关的阻力方面表现更佳 体内 靶向给药5每单位质量载体的拷贝数较高，所需转染试剂更少，从而降低毒性。然而，若载体随机整合至宿主染色体中，共价闭合环状（CCC）载体（包括DNA微环和常规质粒）由于具有分子连续性，可能引发插入突变，造成严重后果6相比之下，线性DNA载体的整合会破坏染色体并激活细胞死亡通路，从而将突变细胞从增殖细胞群体中清除，防止插入突变的发生7简约型免疫学定义基因表达（MIDGE）载体8 以及微型线性载体9 MiLV 是开发的 LCC DNA 载体 体外MIDGE 载体已表现出高达17倍的外源基因表达提升 体内 与传统的质粒DNA载体相比11，并在疫苗研究中展现出良好的应用前景10 和癌症8 基因治疗。此外，由于LCC微载体具有无扭转的结构，与CCC超螺旋对应物相比，其转染试剂用量更少，从而降低了毒性。7.
我们改进的LCC DNA载体——DNA微环（DNA ministrings）——已展现出更优的表达效率和生物利用度7此外，DNA微环可在一步热诱导过程中生成 体内 生产系统，一种相较于MIDGE和MiLV LCC载体更为便捷且经济的替代方案，后者需要多个步骤 体外. 本演示的DNA微环生产系统是一种简单的热诱导过程 在体，使其既经济高效又易于扩展。该系统利用了 小肠结肠炎耶尔森菌 源自噬菌体 PY54 的 Tel/手掌 原端粒酶重组系统12 将最小真核表达盒与原核质粒骨架分离。我们已对此进行改造 大肠杆菌 在热诱导型噬菌体λ启动子cI[Ts]857控制下，使细胞（W3NN）表达端粒酶（Tel protelomerase）13表达后，端粒酶作用于 手掌 靶位点存在于 "超级序列" (SS) 位点位于前体质粒上，用于产生LCC产物，随后可从中纯化出DNA微环图1）。DNA微环前体质粒上的SS位点还编码其他重组酶的靶向位点，包括Cre重组酶（lox)，TelN 末端酶（protelomerase）端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP））和 Flp 重组酶（FRT），从而能够从一个前体质粒生成同基因型的LCC和CCC微型载体。此外，每个SS位点两侧均被SV40增强子（SV40e）序列所包围，以促进其向细胞核的转运14我们已在其他地方证明，连续添加SV40e可逐步提高转染效率7. 前体质粒（pDNA MiniString 或 pDMS）包含一个多克隆位点（图1）以促进将任何目的基因与绿色荧光报告蛋白（GFP）进行转录融合插入。
DNA微载体技术可替代传统方法，用于基因转移、报告基因表达以及真核系统中外源基因表达效率的评估。DNA微环分子结合了生物相容性以及提高转染效率的优势 "微型" 兼具线性DNA载体更优的安全性特征。我们强大的一步式生产平台可快速、简便地生产适用于任何基因转移应用的DNA微环载体，并提供更高的安全性保障。
方案
1. 培养基与培养物的制备
- 对于 LB + Amp：使用高压灭菌器在 121 °C 下灭菌 30 分钟，制备 500 ml 无菌Luria-Bertani培养基（LB）。加入氨苄青霉素，使其终浓度为 100 µg/ml，然后于 4 °C 保存备用。
- 对于 TB + Amp：用于大量（500 ml 或以上）迷你质粒的生产。使用高压灭菌器在 121 °C 下灭菌 30 分钟，制备 600 ml 无菌优质肉汤（Terrific Broth, TB）。加入氨苄青霉素，使其终浓度为 100 µg/ml，然后于 4 °C 保存备用。
- 对于 LB 琼脂 + Amp：通过在 LB + Amp 中添加 15 g/L 琼脂制备无菌 LB 琼脂平板。将约 15–20 ml 培养基分装至无菌培养皿中，倒置存放于 4 °C 备用。
- 通过在 LB 琼脂 + Amp 平板上无菌划线接种 W3NN[pDMS] 细胞，制备 W3NN[pDMS] 的划线平板。于 30 °C 培养过夜，直至可见单菌落。切勿在此温度以上培养 W3NN，以避免解除对原端粒酶表达的抑制。
- 将 5 ml LB + Amp 无菌转移至无菌试管中。从划线平板上挑取单菌落接种至该液体培养基中，制备 W3NN[pDMS] 的过夜培养物。于 30 °C 摇床中以 230–250 rpm 振荡培养过夜。
2. 生长期
- 无菌条件下，将 10 ml LB + Amp 转移至一个无菌的 125 ml 锥形瓶中，并加入 100 µl 过夜培养的 W3NN[pDMS] 菌液，使终体积为 1:100 的稀释比例。
- 对于较大体积的培养，可将 500 µl 过夜培养物加入 250 ml 锥形瓶中的 50 ml TB + Amp 培养基中，代替 LB + Amp。
- 或者，在步骤 2.2 中使用作为第二个"代表性"培养物。
- 将培养物置于 30 °C、250 rpm 摇床中培养，直至菌液达到对数生长中后期，以光密度（OD）或吸光度 A600 = 0.8 为标志。培养 1–2 小时后，培养基应开始肉眼可见浑浊。
- 无菌条件下，取 1 ml 培养液转移至洁净的分光光度计比色皿中。
- 使用紫外-可见分光光度计在 600 nm 波长下测定吸光度。以 1 ml 细胞培养所用的培养基（LB 或 TB）作为空白对照。可选地，也可使用步骤 2.1.3 中的代表性培养物进行此步骤。
- 若培养物尚未达到合适的 OD 值，则放回摇床继续培养，并每半小时检测一次；当 A600 接近 0.8 时，应更频繁地检测 OD 值。
- 当培养物达到对数生长后期（以 A600 = 0.8 为标志）时，无菌条件下将菌液转移至无菌的 50 ml 离心管中。
- 在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟以收集细胞。观察离心管底部是否形成细胞沉淀。
- 将上清液小心倾入适当的生物危害废物容器中，注意不要扰动细胞沉淀。
- 重复步骤 2.4–2.5，直至所有细胞均被收集完毕。
- 用 100 µl LB + Amp 重悬细胞沉淀。可用移液器吹打或使用涡旋振荡器混匀。为获得更多微小 DNA 串（ministring），可将来自 50 ml TB + Amp 培养物的沉淀重悬于 1 ml 新鲜 LB + Amp 培养基中。
3. 微型质粒生产
- 在无菌条件下，向125 ml锥形瓶中加入20 ml LB + Amp培养基，并加热至42 °C。若需更高产量的微小质粒，可准备500 ml预热至42 °C的LB + Amp培养基。
- 将重悬液转移至预热的培养基中。
- 在42 °C、250 rpm条件下培养，直至进入对数生长后期，以A600 = 1.0为标志。20 ml培养液在42 °C下培养时间不得超过1小时。
- 将温度降至37 °C，继续培养90分钟。对于500 ml培养体系，延长诱导时间为90–120分钟，且不降低温度。
- 将温度进一步降至30 °C，以200 rpm振荡培养，额外进行2小时的降温适应阶段。对于500 ml培养体系，可将降温适应阶段延长至4小时或过夜。
4. 收获微小片段
- 在无菌条件下将培养物转移至无菌的 50 ml 离心管中。在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟，并检查是否有沉淀。
- 将上清液倾倒至适当的生物危害废物容器中，注意不要扰动沉淀。重复此步骤，直至收集完所有细胞。
- 保留沉淀用于质粒提取，可使用任何商业化的质粒提取及内毒素去除试剂盒进行提取，或在液氮中快速冷冻后于 -80 °C 保存，以备后续提取使用。
结果
DNA 提取后，可回收残留的前体质粒、LCC 原核骨架以及 DNA 微环体。总体质粒产量和纯度可通过分光光度计进行评估。纯度通过 260 nm 与 280 nm 处吸光度比值（A260/A280）估算，其中 1.9–2.0 的比值为最佳。所有 LCC 和 CCC 产物均可通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）进行分离（图 2）。AGE 可在微环体纯化前，直观展示热诱导后微环体生成的结果。图 2 中可通过比较微环体（2.4 kb）与亲本质粒（5.6 kb）条带的强度，对此阶段的微环体生成情况进行定性评估。在 AGE 后，可采用标准的质粒凝胶提取方案回收微环体 DNA。图 3 总结了在执行本方案过程中可能遇到的各种条件下微环体的生成效率。微环体生成效率基于 DNA 条带强度，使用制造商提供的分析软件确定。任何类似的密度分析软件均可用于分析 AGE 结果。
图1：微环DNA生产的概述。 (A) 亲本载体包含一个与报告基因转录融合的多克隆位点，两侧由两个SS位点框定。载体骨架编码β-内酰胺酶以提供氨苄青霉素抗性，还含有多个仅存在于骨架中的独特酶切位点 体外 消化。B) 主要实验方案概述。步骤 2）生长阶段和步骤 3）微小片段生产以示意图形式呈现，以整体展示所涉及的操作流程，突出本方案的简便性。C) 微型质粒诱导。热诱导使温度敏感型阻遏蛋白失活，从而允许 端粒 表达后，亲本质粒上的SS位点出现端粒酶活性。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：偏离实验方案后的Ministring产量。1：对照组；2：未诱导组；3：过度生长组；4：过度诱导组；5：提前终止组。DNA ministring大小约为2.4 kb，LCC骨架为3 kb，pNN9亲本质粒为5.6 kb。当偏离标准操作流程时，ministring与LCC骨架条带的强度下降，表明ministring产量降低。从左至右：New England Biolabs的1 kb DNA Marker；对照组，按标准流程操作；未诱导组，无温度升高；过度生长组，在静止期进行温度升高；过度诱导组，延长温度升高时间；提前终止组，无温度降低。质粒提取使用Omega-Biotek E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit进行。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：操作偏离标准流程对微环DNA生产效率（PE）的影响。 结果为三次实验的平均值。PE根据琼脂糖凝胶电泳（AGE）后使用AlphaImager HP测量的条带相对强度进行估算。各项偏离操作发生于以下步骤：对照组，遵循标准流程；未诱导组，在步骤2未进行升温诱导；过度生长组，在步骤1.6的稳定期开始升温；过度诱导组，在步骤2.3延长升温时间；提前去除组，在步骤2.3未降温即收获并提取细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们在此介绍一种简单的LCC DNA ministring生产系统，该系统采用一步热诱导法，除常规细菌培养与操作所需设备外，无需特殊仪器。DNA ministring是无拓扑张力、稳定的线性DNA表达盒，不含原核遗传元件。它们可替代传统方法用于基因转移、报告基因表达，以及真核系统中外源基因表达效率的评估。DNA ministring结合了生物相容性与转染效率提高的优势， "微型" 具有更优安全特性的线性DNA载体。我们强大的一步法 体内 生产平台可快速、简便地生产适用于任何基因转移应用的DNA微环，无需多次昂贵的 体外 过程。
确保最优微环（ministring）生产的几个关键步骤包括（图2 和 3）。热诱导是微环DNA生产中最关键的步骤。完全无法产生微环DNA最可能的原因是未进行热诱导（细胞始终维持在30 °C），此时端粒酶表达受到抑制，导致前体质粒无法转化为LCC微环DNA。按照热诱导方案操作，预期生产效率约为75%。细胞处于对数生长期时进行热诱导效果最佳。尽管使用处于稳定期的细胞时，微环DNA的生产效率（PE）与对数期细胞相比无统计学显著差异（"过度生长", 图3)，我们观察到质粒总产量几乎下降了50%。产量将取决于所使用的质粒提取方法。为获得最佳的微小质粒（ministring）产量，应在细胞处于对数生长期时触发热诱导。微小质粒产量低下很可能是因为温度升高的时间过长或温度降低不充分。不建议长时间升温，因为这会激活 E. coli 热激反应15，这可能会抑制末端转移酶活性并干扰质粒的稳定性。因此，控制降温时机是实现高效微环DNA生产的关键步骤之一。若在30 °C下未进行额外的孵育，微环DNA的生产效率会显著降低（"早期移除", 图3）。这可能归因于Tel蛋白表达和发挥活性所需的时间。编码Tel蛋白酶的原噬菌体PY54通常感染 耶尔森菌，最适生长温度约为 28 °C12，表明30 °C对Tel活性而言也可能更为适宜。
DNA微型载体生产系统利用一种体内平台来生成高质量、无细菌序列的DNA微型载体。对本方案的修改可能包括调整培养基，以优化质粒和蛋白质的表达，从而促进生长阶段的细胞生长（例如使用TB培养基替代LB培养基），或提高微型环状DNA（ministring）的产量和转化效率。对于较大体积的培养物（200 ml及以上），可将温度下调并继续在30 °C下孵育过夜，而不会对微型环状DNA的PE（plasmid efficiency）产生严重不利影响。我们在方案中以500 ml培养物为例，提供了相应的修改建议。通过体外内切酶消化原核骨架部分，可加快DNA微型环状载体的纯化过程。前体质粒的原核骨架上含有多个内切酶识别位点（例如，PI-SceI、PvuI、ScaI），经切割后可暴露出开放的线性末端，从而实现原核骨架的体外降解。此外，还可通过阴离子交换膜色谱法16将微型环状DNA与其他载体组分分离。
目前与LCC DNA载体生产系统相关的一个局限性是需要从其他LCC和CCC产物中纯化出DNA微环（ministring）。尽管使用标准质粒提取方法可较容易地实现纯化，但在大规模生产中，该纯化步骤仍可能成为不利因素。若微环与LCC原核骨架在大小上过于相近，使用琼脂糖凝胶电泳（AGE）进行分离可能耗时较长。 alternatively，阴离子交换膜层析可能更有效地实现微环与CCC载体组分的分离。16温度升高可能是另一个潜在的限制因素，因为高温也会激活热休克反应 大肠杆菌，这对重组蛋白的产量产生负面影响17 从而降低质粒向最小串状DNA的转化率。我们已在其他文献中报道了对该生产平台的优化，以规避和/或减轻热激带来的此类影响。18我们目前正在优化方法，以消除或减少LCC原核生物骨架污染 体内.
染色体整合LCC DNA微环可破坏宿主染色体，导致细胞发生凋亡。这不仅降低了插入突变可能带来的负面影响（如致癌作用及邻近基因沉默），从而提高了安全性；其致死效应还可作为基因敲入和基因替换研究的理想方法，避免了整合相关的副作用与损伤。DNA微环载体可用于将编码治疗性蛋白质、RNA、抗体或抗原的基因递送至特定靶细胞并实现表达 体内 或替换功能异常或无功能的等位基因。简单的一步热诱导 体内 生产系统可轻松制备用于临床或工业应用的DNA微环载体。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）对本工作的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| E. coli W3NN | Mediphage | 用于微环DNA加工的菌株：Nafissi & Slavcev, 2012 | |
| pDMS.IRES.GFP | Mediphage | 微环DNA加工的母体质粒：也称为pDNA微环质粒（pDMS） | |
| BD Difco 脱水培养基：LB Broth, Miller（Luria-Bertani） | Fisher Scientific | 244620 | |
| Fisher BioReagents 优质肉汤 | Fisher Scientific | BP2468500 | |
| BD Bacto 脱水琼脂 | Fisher Scientific | 214010 | |
| 氨苄青霉素 | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
| 超纯 Milipore 水 | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | 型号：Mili-Q Advantage A10 水纯化系统 |
| 外科手套 | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
| Fisherbrand 带透明盖、凸缘培养皿（100 × 15 mm） | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 30 ml KIMAX 试管 | VWR | 89001-448 | |
| 分光光度计比色皿 | Sarstedt | 67.74 | |
| 无菌15 ml Falcon离心管 | BD Falcon | 62406-200, | |
| 无菌50 ml 离心管 | FroggaBio | 2930-S0 | |
| BD Falcon 一次性聚苯乙烯刻度移液管 10 ml | BD Falcon | 13-675-20 | |
| BD Falcon 一次性聚苯乙烯刻度移液管 25 ml | BD Falcon | 13-668-2 | |
| 微量移液器（100–1,000 μl） | FroggaBio | C1000-1 | |
| 微量移液器（20–200 μl） | FroggaBio | C200-1 | |
| 无菌移液器吸头（100–1,250 μl） | VWR | 89079-472 | |
| 无菌移液器吸头（1–200 μl） | VWR | 89079-460 | |
| Fisher Scientific 经济型酒精灯 | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
| 无菌锥形瓶（125 ml） | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
| 无菌锥形瓶（250 ml） | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
| 无菌锥形瓶（500 ml） | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
| 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | 335901 | 型号：Genesys 10 Vis |
| 落地式离心机 | Beckman Coulter | 369001 | 型号：Avanti J-E |
| 台式离心机 | Beckman | 362114 | 型号：GS-6R |
| Fisher Scientific 模拟旋涡混合器 | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| 1 kb DNA Marker | New England BioLabs | N3232S |
参考文献
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