我们开发了一种基于光学谐振器技术的无标记生物传感系统，该技术称为频率锁定光学回音壁模式倏逝波谐振器（FLOWER），能够检测溶液中的单个分子。本文将介绍并展示该工作的相关实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
检测低浓度分子直至单分子水平，对疾病早期诊断以及分子行为的基础研究等领域具有重要意义。单分子检测技术通常依赖荧光标记物或量子点等标记物，然而标记物并非总是可用，且会增加成本和实验复杂性，并可能干扰所研究的生物事件。光学谐振器作为一种有前景的技术，能够在无需标记的情况下实现单分子检测。目前，非等离激元增强的裸光学谐振器系统在溶液中检测到的最小粒子为25 nm的聚苯乙烯小球1。我们开发了一种名为频率锁定光学回音壁模倏逝波谐振器（FLOWER）的技术，能够突破这一限制，实现在水溶液中的无标记单分子检测2。由于信号强度与粒子体积成正比，本工作在信噪比（SNR）方面相较当前技术水平提升了> 100倍。本文旨在介绍FLOWER技术背后的实验流程，以促进其在相关领域的广泛应用。
引言
单分子检测实验有助于减少生物传感器中分析物的使用量、实现疾病的早期检测以及研究分子的基本特性3。此类实验通常依赖标记物进行，然而，标记物并不总是能够针对特定蛋白质获得，且会增加成本，可能干扰所研究的生物事件，同时在实时现场实验或即时诊断中使用时可能带来不便。
目前无标记生物传感的金标准是表面等离子体共振4，然而商用的表面等离子体共振系统的检测下限通常在纳摩尔（nM）量级。近年来，光学谐振器作为一种有前景的技术，已被用于无标记单分子生物检测5。光学谐振器的工作原理基于光的长期（纳秒级）限域效应6,7。光通常通过光纤以渐逝场耦合方式进入这些器件。当光纤中传输的光波长与谐振器的共振波长匹配时，光便能高效地耦合进入谐振器。耦合后的光在谐振腔内发生全内反射，进而在谐振器周缘附近产生渐逝场。当粒子进入该渐逝场并与谐振器结合时，谐振器的共振波长会发生改变，其变化量与粒子的体积成正比8。
在检测能力方面，微球谐振器此前已被用于检测单个甲型流感病毒颗粒（100 nm）9,10。最近，等离子体增强型微球光学谐振器已被用于检测单个牛血清白蛋白分子11和8聚寡核苷酸12，但该方法将每个器件的颗粒捕获面积限制在0.3 µm2。较大的捕获面积生物传感器更有利于最大化颗粒检测的概率。目前，具有大（> 100 µm2）捕获面积的基于溶液的无标记生物传感技术仅限于检测直径≥ 25 nm的聚苯乙烯颗粒。
我们开发了一种基于光学谐振器技术的无标记生物传感系统，该技术称为频率锁定光学 whispering gallery 模式回音壁谐振器（Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator, FLOWER）13（图1），能够实现溶液中单分子的时间分辨检测。FLOWER 利用微环形光学谐振器的长光子寿命，结合频率锁定反馈控制、平衡检测和计算滤波技术，实现对微小粒子的检测，灵敏度可达单个蛋白质分子。频率锁定技术的使用使系统能够在粒子结合时持续追踪微环谐振频率的偏移，而无需对激光波长进行大范围扫描或调谐。FLOWER 的原理可用于增强其他检测技术的性能，包括等离子体增强技术。下文将描述实施 FLOWER 的具体操作步骤。
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方案
1. 实验设置与样品制备
- 采用先前所述的光刻、刻蚀和熔融工艺制备微环谐振器6在硅晶圆（芯片）上制备微环形谐振器，其典型主直径为80–100 µm，次直径为2 µm。
- 从光纤盘上解开约一米长的单模光纤（包层直径125 µm，模场直径4.3 µm）。
- 在光纤未缠绕部分的中间位置，使用剥线钳剥离光纤周围的一小段（2.5 cm）聚合物涂层。注意：此部分光纤将用于通过渐逝场耦合将光导入微环谐振器。
- 使用异丙醇和无绒布清洁已剥除涂覆层的光纤。
- 使用磁性夹具制成的光纤夹具固定这段光纤。
- 使用氢气喷灯和两个以60 µm/min速度反向移动的步进电机，通过熔融和拉伸将剥离后的光纤变细至约500 nm。将光纤置于火焰上部，火焰高度应约为10 mm。当光纤的透射光不再发生波动时，停止拉伸操作；透射光的变化可通过肉眼观察（观察光纤侧向散射光的闪烁）或通过将光纤连接至连接示波器的光电二极管进行监测。
- 将光纤一端切断，并插入裸纤适配器中。将该端光纤放入光电探测器的输入端口。
- 将光纤卷的另一端通过光纤耦合器与激光器连接。
- 将微环芯片使用环氧树脂或双面胶带固定在样品台（不锈钢，37.8 mm × 6.4 mm × 3.2 mm）上。
- 将样品台安装在定位平台上方，该平台由一个三维微米调节装置（三维微调架）支撑的三维纳米定位（纳米立方体）平台组成（参见设备清单）。所有实验均需在气浮隔振光学平台上进行，以最大限度减少振动。
- 使用三轴千分尺粗略定位样品芯片。
- 使用纳米定位器将含有微环谐振腔的芯片与光纤对齐。注意：需将微环谐振腔调整至与入射光波长距离范围内（约633 nm）。为便于观察此过程，可在芯片上方和侧方各放置一个成像柱（含物镜和相机的镜管，参见设备清单）。
- 使用光纤在线偏振控制器（见设备清单）调节通过光纤的激光偏振态，该控制器带有可调节偏振的旋钮。注意：当测得的光纤透射率下降峰最窄时，即达到最佳偏振状态。在示波器上观察该下降峰（详见步骤2.2）。
- 使用玻璃载片作为间隔物，用环氧树脂将盖玻片固定在样品台上，构建样品室。注意：可用聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas） enclosure 覆盖整个装置，以减少空气流动；应留出一个小开口，以便通过管路泵入溶液。
- 将颗粒悬浮液或单分子水溶液在室温水浴（约500 ml）中热平衡至少1小时。注意：使用制造商指定的相应缓冲液在微量离心管中将样品稀释至所需浓度。 例如，PBS 或 HEPES。若未检测到结合事件，可提高缓冲液的盐浓度。
- 涡旋含有颗粒的溶液（1 ml）约 2 秒。
- 使用1 ml注射泵，以1 ml/min的流速将含有颗粒的溶液注入样品室。
- 样品室充满后，关闭注射泵。
- 等待30秒后再记录数据，以尽量减少流体流动引起的机械振动对测量结果的影响。
2. 频率锁定
- 由于注入液体会导致耦合状态受到干扰，因此通过使用纳米定位器移动样品架，将环形谐振器重新耦合至光纤。
- 通过计算机控制输入激光器扫描多种波长，定位微环谐振器的共振波长。该步骤通过向激光控制器内的压电元件发送三角波电压信号来调节激光波长。实验采用可见光（635 nm ± 2.5 nm），因为在此波长下水对光的吸收较低。
- 将光纤输出端接入自动平衡光电接收器，测量光纤中的光传输。使用BNC电缆将光电接收器的输出端连接至示波器。在示波器上可观察到，当处于微环谐振器的共振波长时，光纤中的光传输量下降。
- 通过电缆将光电接收器的输出端连接至频率锁定反馈控制器的主输入端（参见设备列表）。
- 在软件界面中以Ziegler-Nichols整定规则14经验性设置比例-积分-微分（PID）参数，并以2 kHz的调制频率和19 fm的波长振荡幅度，运行频率锁定反馈控制器的自动锁定模式。注意：这些参数只需在所有实验开始前设置一次。
- 在样品腔填充完成后，将激光波长自动锁定至微环谐振器的共振波长。注意：若波长偏移过大，反馈控制器将失去锁定，并自动切换至扫描模式以重新定位共振波长。此情况通常发生在波长偏移超过约一个线宽时（本研究所涉及的所有系统中至少为600 fm）。
- 使用24位数据采集卡以20 kHz的采样频率记录反馈控制器的输出信号，并通过数据采集软件将数据导出为文本文件。
3. 数据处理 & 分析
- 在 MATLAB 中对数据进行傅里叶变换。
- 使用低通滤波器对数据进行处理 "砖墙" 使用截止频率为1 kHz的滤波器，以去除施加的2 kHz抖动频率（参见补充代码文件截图1）。
- 使用16 Hz的窗口大小对数据进行计算式陷波滤波。注意：此步骤旨在去除已知的噪声源，本例中包括60 Hz的电源线噪声及其谐波，以及来自激光驱动器的100 Hz噪声及其谐波（参见补充代码文件截图1）。
- 将数据进行逆傅里叶变换，还原至时域。
- 使用1,001个样本的窗口大小对数据进行中值滤波（参见补充代码文件截图2）。
- 使用 Kerssemakers 的步进检测算法定位共振波长的阶跃变化 等15.
- 生成每个结合步骤振幅的直方图。
- 使用公式 (1) 计算粒径（见讨论部分）。
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结果
微环谐振波长随时间发生的阶梯状变化清晰地反映了颗粒结合事件（图 2A）。这些阶梯的高度以直方图形式展示于图 2B中。图 2-4 分别展示了外泌体（纳米囊泡）、5 nm 二氧化硅微球以及单个人类白细胞介素-2 分子结合过程的代表性信号轨迹。阶梯状信号的变化幅度随颗粒尺寸变化而变化，这一事实表明该技术操作正确。可通过生成阶梯高度的直方图（图 2B），并将观测到的最大阶梯高度与理论预测值进行比较来分析该结果，如下文所述。
图 1. 环形谐振器传感系统...
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讨论
当颗粒结合时，环形谐振腔的共振波长（λ）增加；若颗粒解离，则共振波长相应减小（即发生下降台阶事件）。通过统计每个波长台阶幅度的直方图，可确定颗粒直径（d）。每个波长台阶的高度变化源于结合颗粒的尺寸差异以及颗粒在微环上的结合位置。当颗粒结合在微环赤道处——此处电场（E0,max）最强——共振波长的变化达到最大值（即最大台阶高度）。该最大波长变化量（Δλ）与颗粒直径的关系由公式（1）8给出，其中a为颗粒半径，D为基于结合颗粒及其周围介质折射率的介电常数，Vm为通过有限元模拟确定的微环内光场的模式体积2，E0(rs)为同样通过有限元模拟确定的颗粒赤道处的电场振幅：
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究部分得到了美国国家普通医学科学研究所国家研究服务奖（T32GM07616）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 可调谐二极管激光器 | Newport | TLB-6300 | |
| 激光控制器 | Newport | TLB-6300-LN | |
| 频率锁定反馈控制器 | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| 自动平衡光电接收器 | Newport | Model 2007 | |
| 在线偏振控制器 | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24位数据采集卡 | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| 重组人白细胞介素-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm 聚苯乙烯微球 | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ 压电平台 | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| 光学平台 | Newport | VH3660W-OPT | |
| 成像柱物镜 | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| 成像柱（适配管） | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| 成像柱用高分辨率CCD相机 | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
参考文献
- Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
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- Vahala, K. J. Optical microcavities. Nature. 424, 839-846 (2003).
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- Su, T. -T. J. Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , California Institute of Technology. (2014).
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重印与许可
