我们开发了一种基于光学谐振器技术的无标记生物传感系统，该技术称为频率锁定光学回音壁模式倏逝波谐振器（FLOWER），能够检测溶液中的单个分子。本文将介绍并展示该工作的相关实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
检测低浓度分子直至单分子水平，对疾病早期诊断以及分子行为的基础研究等领域具有重要意义。单分子检测技术通常依赖荧光标记物或量子点等标记物，然而标记物并非总是可用，且会增加成本和实验复杂性，并可能干扰所研究的生物事件。光学谐振器作为一种有前景的技术，能够在无需标记的情况下实现单分子检测。目前，非等离激元增强的裸光学谐振器系统在溶液中检测到的最小粒子为25 nm的聚苯乙烯小球1。我们开发了一种名为频率锁定光学回音壁模倏逝波谐振器（FLOWER）的技术，能够突破这一限制，实现在水溶液中的无标记单分子检测2。由于信号强度与粒子体积成正比，本工作在信噪比（SNR）方面相较当前技术水平提升了> 100倍。本文旨在介绍FLOWER技术背后的实验流程，以促进其在相关领域的广泛应用。
引言
单分子检测实验有助于减少生物传感器中分析物的使用量、实现疾病的早期检测以及研究分子的基本特性3。此类实验通常依赖标记物进行，然而，标记物并不总是能够针对特定蛋白质获得，且会增加成本，可能干扰所研究的生物事件，同时在实时现场实验或即时诊断中使用时可能带来不便。
目前无标记生物传感的金标准是表面等离子体共振4，然而商用的表面等离子体共振系统的检测下限通常在纳摩尔（nM）量级。近年来，光学谐振器作为一种有前景的技术，已被用于无标记单分子生物检测5。光学谐振器的工作原理基于光的长期（纳秒级）限域效应6,7。光通常通过光纤以渐逝场耦合方式进入这些器件。当光纤中传输的光波长与谐振器的共振波长匹配时，光便能高效地耦合进入谐振器。耦合后的光在谐振腔内发生全内反射，进而在谐振器周缘附近产生渐逝场。当粒子进入该渐逝场并与谐振器结合时，谐振器的共振波长会发生改变，其变化量与粒子的体积成正比8。
在检测能力方面，微球谐振器此前已被用于检测单个甲型流感病毒颗粒（100 nm）9,10。最近，等离子体增强型微球光学谐振器已被用于检测单个牛血清白蛋白分子11和8聚寡核苷酸12，但该方法将每个器件的颗粒捕获面积限制在0.3 µm2。较大的捕获面积生物传感器更....
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方案
1. 实验设置与样品制备
- 采用先前所述的光刻、刻蚀和熔融工艺制备微环谐振器6在硅晶圆（芯片）上制备微环形谐振器，其典型主直径为80–100 µm，次直径为2 µm。
- 从光纤盘上解开约一米长的单模光纤（包层直径125 µm，模场直径4.3 µm）。
- 在光纤未缠绕部分的中间位置，使用剥线钳剥离光纤周围的一小段（2.5 cm）聚合物涂层。注意：此部分光纤将用于通过渐逝场耦合将光导入微环谐振器。
- 使用异丙醇和无绒布清洁已剥除涂覆层的光纤。
- 使用磁性夹具制成的光纤夹具固定这段光纤。
- 使用氢气喷灯和两个以60 µm/min速度反向移动的步进电机，通过熔融和拉伸将剥离后的光纤变细至约500 nm。将光纤置于火焰上部，火焰高度应约为10 mm。当光纤的透射光不再发生波动时，停止拉伸操作；透射光的变化可通过肉眼观察（观察光纤侧向散射光的闪烁）或通过将光纤连接至连接示波器的光电二极管进行监测。
- 将光纤一端切断，并插入裸纤适配器中。将该端光纤放入光电探测器的输入端口。
- 将光纤卷的另一端通过光纤耦合器与激光器连接。
- 将微环芯片使用环氧树脂或双面胶带固定在样品台（不锈钢，37.8 mm × 6.4 mm × 3.2 mm）上。
- 将样品台安装在定位平台上方，该平台由一个三维微米调节装置（三维微调架）支撑的三维纳米定位（纳米立方体）平台组....
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结果
微环谐振波长随时间发生的阶梯状变化清晰地反映了颗粒结合事件（图 2A）。这些阶梯的高度以直方图形式展示于图 2B中。图 2-4 分别展示了外泌体（纳米囊泡）、5 nm 二氧化硅微球以及单个人类白细胞介素-2 分子结合过程的代表性信号轨迹。阶梯状信号的变化幅度随颗粒尺寸变化而变化，这一事实表明该技术操作正确。可通过生成阶梯高度的直方图（图 2B），并将观测到的最大阶梯高度与理论预测值进行比较来分析该结果，如下文所述。
图 1. 环形谐振器传感系统.......
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讨论
当颗粒结合时，环形谐振腔的共振波长（λ）增加；若颗粒解离，则共振波长相应减小（即发生下降台阶事件）。通过统计每个波长台阶幅度的直方图，可确定颗粒直径（d）。每个波长台阶的高度变化源于结合颗粒的尺寸差异以及颗粒在微环上的结合位置。当颗粒结合在微环赤道处——此处电场（E0,max）最强——共振波长的变化达到最大值（即最大台阶高度）。该最大波长变化量（Δλ）与颗粒直径的关系由公式（1）8给出，其中a为颗粒半径，D为基于结合颗粒及其周围介质折射率的介电常数，Vm为通过有限元模拟确定的微环内光场的模式体积2，E0(rs)为同样通过有限元模拟确定的颗粒赤道处的电场振幅：
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究部分得到了美国国家普通医学科学研究所国家研究服务奖（T32GM07616）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 可调谐二极管激光器 | Newport | TLB-6300 | |
| 激光控制器 | Newport | TLB-6300-LN | |
| 频率锁定反馈控制器 | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| 自动平衡光电接收器 | Newport | Model 2007 | |
| 在线偏振控制器 | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24位数据采集卡 | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| 重组人白细胞介素-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm 聚苯乙烯微球 | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ 压电平台 | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| 光学平台 | Newport | VH3660W-OPT | |
| 成像柱物镜 | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| 成像柱（适配管） | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| 成像柱用高分辨率CCD相机 | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
参考文献
- Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
- Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. Label-free detecti....
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重印与许可
