人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系的分化

摘要

在神经生物学和神经病毒学研究中，拥有可靠且可重复的方法至关重要 体外 作为所发生事件的转化研究模型的系统 体内 在人类神经元中。本方案描述了如何培养并诱导SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞分化为具有活性的神经元，以用于后续实验研究。 体外 应用。

摘要

建立适当的体内和体外系统，以提供可转化的人类疾病模型，是神经生物学和神经科学研究中的一个关键环节。神经生物学中传统的体外实验模型包括来自大鼠和小鼠的原代神经元培养、神经母细胞瘤细胞系（如大鼠B35和小鼠Neuro-2A细胞）、大鼠PC12细胞以及短期脑片培养。尽管许多研究人员依赖这些模型，但它们缺乏人类成分，所观察到的实验效应可能仅限于特定物种，在人类中未必以相同方式发生。此外，尽管这些细胞属于神经元，但其核型可能不稳定，这使得它们在基因表达研究以及细胞信号通路的可重复性研究中的应用受到限制。因此，开发更为稳定的人类神经系统疾病模型显得尤为重要。

以下实验方案描述了一种简单易行、可重复的方法，通过诱导染色体稳定的人源神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 分化，获得均一且具有活性的人类神经元培养物。该方法整合了此前报道的多种技术^1-4，其核心在于逐步从培养基中去除血清。实验时间线包括逐步进行血清饥饿，并引入细胞外基质蛋白和神经营养因子。该过程促进神经元的分化，同时抑制上皮样细胞的生长，从而获得均一的神经元细胞群体。代表性结果展示了 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞成功地从初始的类上皮细胞表型分化为具有更广泛突起和分支结构的神经元样表型。本方案提供了一种可靠的方法，用于生成均一的神经元细胞群体，可用于后续的生物化学与分子生物学分析，为人类感染与疾病研究提供了更为准确的转化医学模型。

引言

使用的能力 体外 模型系统极大地推动了神经生物学和神经科学领域的发展。细胞培养为研究蛋白质功能及特定现象背后的分子机制、理解疾病与感染的病理过程以及开展药物的初步测试评估提供了高效的平台。在神经生物学中，主要的细胞培养模型包括源自大鼠和小鼠的原代神经元培养，以及神经母细胞瘤细胞系，如大鼠B35细胞。⁵小鼠 Neuro-2A 细胞⁶和大鼠PC12细胞⁷尽管使用此类细胞系极大地推动了该领域的发展，但在处理非人类细胞和组织时仍存在若干混杂因素。这些因素包括了解代谢过程、疾病表型表现以及发病机制方面存在的物种特异性差异。此外，值得注意的是，小鼠与人类在基因表达及转录因子信号传导方面存在显著差异，这凸显了啮齿类动物模型的局限性，也强调了明确哪些通路在啮齿类与人类之间保守的重要性。^8-11其他研究者已采用人类神经元细胞系，包括N-Tera-2（NT2）人类畸胎瘤细胞系以及诱导性多能干细胞（iPSCs）。这些细胞系为研究提供了良好的模型 体外 人类系统。然而，使用视黄酸（RA）诱导NT2细胞分化会生成神经元、星形胶质细胞和放射状胶质细胞的混合群体¹²，需要额外的纯化步骤以获得纯化的神经元群体。此外，NT2细胞表现出高度可变的核型¹³，72%的细胞染色体数目超过60条。不同iPSC细胞系在分化能力上表现出差异，且分化效率各不相同¹⁴因此，拥有一个稳定且可重复的....

方案

1. 一般注意事项

1. 参见材料/设备表以获取所需试剂的清单。所有步骤均须在严格的无菌条件下进行。
2. 凡涉及胎牛血清（FBS）的培养基配制，均应使用热灭活胎牛血清（hiFBS）。热灭活方法：将50 ml FBS置于56 °C水浴中加热30分钟，每10分钟轻轻颠倒混匀一次（另见表1）。
   注意：若FBS未进行热灭活处理，SH-SY5Y细胞培养物中的上皮样表型进展会更快。
3. 每次操作前，需将培养基放入培养箱中预热并平衡，以建立适当的pH值。例如，50 ml培养基在培养箱中（pH 7，37 °C，5% CO₂）约需1小时方可完全平衡。
   注意：本方案采用两步传代法，需对部分分化的SH-SY5Y细胞进行胰酶消化并重新接种。这对极为脆弱的细胞而言是一个应激过程。因此，必须尽可能缩短细胞在胰酶中的孵育时间，以便优先使神经元样细胞脱落，而保留上皮样细胞仍贴附于培养皿表面。
4. 使用10 ml塑料移液管对已分化细胞进行吹打重悬时，应缓慢操作，将管尖紧贴含有细胞的锥形管底部，以缓慢速度上下吹打不超过五次。

2. SH-SY5Y 维持培养物的传代

1. 当细胞生长至70-80%融合度时进行传代培养，传代次数不得超过10至15代。通常每3-5天需传代一次（假设传代时稀释倍数不超过5倍....

结果

目前，在神经生物学和神经病毒学领域，有许多研究使用未分化的 SH-SY5Y 细胞作为人类神经元的功能模型^27-36，且重要的是，未分化的细胞可能缺乏最佳病毒摄取等表型² 准确解释所必需的。在使用SH-SY5Y细胞或任何其他细胞系时，至关重要的是 体外 神经系统，细胞被适当地分化为神经元，以获得最能代表神经元中可能发生的生理过程的数据 体内上述方案可在18天内获得高存活率、均一且已分化神经元细胞培养物，可用于后续的生物化学和成像分析。未分化的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞表现出较大、扁平、类似上皮样的表型，具有大量向外延伸的短突起（图2A），而分化后的细胞则具有多个神经突起，可与周围细胞相连接（图2B）。在诱导 SH-SY5Y 细胞分化时，需用胰蛋白酶孵育细胞尽可能短的时间，以确保仅神经元从培养皿中脱落，从而保留未分化的上皮样细胞，避免其污染已分化的神经元细胞群体。完全分化的 SH-SY5Y 细胞的神经元特性可通过免疫荧光检测经典神经元标志物等技术加以验证（图3

讨论

上述方案提供了一种简单且可重复的方法，用于生成均一且具有活性的人类神经元培养物。该方案结合了多种先前已发表的方法^1-4中的技术与实践，旨在阐明每一环节的最佳操作规范。SH-SY5Y细胞的分化依赖于逐步去除血清；添加视黄酸、神经营养因子和细胞外基质蛋白；以及通过连续传代筛选出已分化成熟的贴壁神经元。该细胞系初始时由贴壁细胞和悬浮细胞组成的异质性群体构成。本方案旨在通过在传代或更换培养基前省略PBS洗涤步骤，以保留这两类细胞群体，但需牺牲部分悬浮细胞，以便清除死亡的上皮样细胞。所介绍的方法可获得均一的已分化人源SH-SY5Y神经元群体，适用于后续实验研究。

尽管其他试剂也可用于引导神经元向胆碱能或肾上腺素能表型分化^16,17，但既往研究已采用视黄酸（RA）诱导SH-SY5Y细胞分化，以获得多巴胺能表型的神经元^37,38。研究表明，添加RA可通过多种机制诱导细胞分化，包括使细胞周期停滞于G0/G1期、上调细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制因子p21和p27^Kip1以及抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
B-27	ThermoFisher Scientific	17504-044	制备方法见表1
脑源性神经营养因子（BDNF）	Sigma	SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg)	制备方法见表1
二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）	Sigma	D0627	制备方法见表1
DMSO	ATCC	4-X	-
最低必需培养基（EMEM）	Sigma	M5650	-
胎牛血清（FBS）	Hyclone	SH30071.03	制备方法见表1
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
谷氨酰胺	Hyclone	SH30034.01	-
氯化钾（KCl）	Fisher Scientific	BP366-1	制备方法见表1
MaxGel 细胞外基质（ECM）溶液	Sigma	E0282	参见实验方案第11步
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	Life Technologies	15140-122	-
维甲酸（RA）	Sigma	R2625	该试剂对光敏感，应避光保存于4 °C
SH-SY5Y 细胞	ATCC	CRL-2266	-
0.5% 胰蛋白酶 + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35 mm TC 培养皿	Falcon (A Corning Brand)	353001	-