鸡胚全视网膜外植体用于电穿孔及化学试剂处理

摘要

本实验方案描述了一种从鸡胚中分离、实验性操作及培养完整视网膜外植体的方法。当需要高成功率、高效性和可重复性以检测用于电穿孔和/或试剂物质的质粒效果时，此类外植体培养具有重要应用价值。 即， 酶抑制剂

摘要

视网膜是研究发育中中枢神经系统的良好模型。眼睛体积较大，且最重要的是便于进行实验操作 在卵内/体内 使鸡胚胎视网膜成为一个多功能且高效的实验模型。尽管鸡视网膜易于靶向操作 在卵内 通过玻璃体内注射或电穿孔, 视网膜内试剂的有效浓度和精确浓度可能难以完全控制，这可能是由于注射位点的细微差异、眼球内液体渗漏或物质扩散不均所致。此外，电穿孔等侵入性操作后，畸形发生率和死亡率相对较高。

本方案描述了一种鸡胚全视网膜外植体的ex ovo培养技术，并提供了一种可控暴露视网膜于试剂的方法。该方案详细说明了如何从鸡胚中分离、实验性操作并培养全视网膜外植体。外植体可培养约24小时，并可进行诸如电穿孔等不同处理。其主要优势在于实验不依赖于胚胎存活，且可调节和控制所引入试剂的浓度，从而确定并优化有效浓度。此外，该技术快速、经济，且实验成功率高，可确保结果的可重复性 。需要强调的是，该方法是in ovo实验的极佳补充。

引言

视网膜是中枢神经系统的一部分，由于其结构相对简单且细胞架构已被充分表征，因此成为研究中枢神经系统发育的常用模型。鸡胚的眼睛相对于胚胎其他部分而言较大，因此在体（in ovo）实验操作时易于接近，适用于注射或电穿孔等实验操作，是研究视网膜细胞生物学和发育生物学在体（in vivo）机制的优良工具。尽管具有这些显著优势，当实验具有侵入性时（如电穿孔、重复注射或多种实验操作联合进行），胚胎的存活率可能较低。

将DNA质粒电穿孔转入鸡胚 在卵内 是一种重要且成熟的技术¹可用于标记神经元、示踪细胞命运及中枢神经系统中的神经纤维通路，也可实现异位基因表达以分析蛋白质功能 体内该技术已用于神经管的研究², 后脑³，以及视网膜⁴胚胎视网膜电穿孔 在卵内 存在一些与之相关的实验困难 体内 情况。由于胚胎的颅部折叠，眼睛的位置相对靠近心脏。这种解剖上的邻近性使得电穿孔后发生心脏骤停的风险增加，且该风险随胚胎发育年龄的增长而升高。此外，为了接近眼睛，必须打开胚胎膜，从而增加了出血、畸形以及后续存活率降低的风险。在测试和优化一种表型结果未知的新DNA质粒时，这些局限性可能降低实验方法的有效性和可靠性，即使对于经验丰富的研究者也是如此。如本实验方案所述，视网膜外植体整体培养——定义为去除色素上皮后的完整神经视....

方案

本方案的实施遵循“视力与眼科学研究协会实验动物护理与使用指南”中的建议。

1. 卵的处理与眼睛采集

1. 将白来航鸡鸡蛋储存在 12–14 °C 环境中，储存时间不得超过 1 周。如有条件，可使用冷藏式酒柜储存受精卵。
   注意：储存温度过高会导致胚胎发育异常，而温度过低则会增加死亡率。延长储存时间会同时增加胚胎死亡率和发育异常的发生率。
2. 将鸡蛋置于 37.5 °C、湿度 60% 的恒温孵卵器中孵化，并以每 24 小时轻轻摇晃 5 次的频率进行轻柔振荡。
3. 在所需胚胎发育阶段，将孵化中的鸡蛋从孵卵器中取出。
   注意：鸡胚胎的发育年龄以孵化时间计算，通常表示为胚胎日（E）或发育阶段（st），依据 Hamburger 和 Hamilton 所描述的胚胎发育阶段系列进行判定¹²。
4. 将选定的鸡蛋放入超净工作台中，用 70% 乙醇擦拭蛋壳，以避免胚胎污染。
   注意：所有操作均应在无菌条件下进行，使用无菌 溶液 https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions 和无菌器械。
5. 将鸡蛋侧面用力敲击坚硬表面，使蛋壳破裂。将内容物转移至 100 mm 培养皿中。使用小勺将胚....

结果

本方案描述了鸡胚完整视网膜外植体的制备（图1A-F）与培养方法。该方案已成功应用于孵化第3天（st20，E3）至第7天（st31，E7）鸡胚的完整视网膜外植体。

将DNA质粒电穿孔转染至完整的视网膜外植体中，可实现对视网膜前体细胞的标记与示踪，或不同基因产物的过表达。在电穿孔实验中，小心去除st25（E4½）胚胎眼球的色素上皮层。将完整的视网膜外植体置于含有DNA质粒溶液的电转杯中，浸入电极（图2A），并施加电流。培养24小时后，可在大部分完整视网膜中观察到GFP阳性细胞（图2B）。切片后，沿视网膜的顶-基底轴可清晰检测到单个GFP阳性细胞（图2C）。电穿孔导致较大范围的视网膜区域摄取质粒并表达报告基因。以电穿孔区域大于整个视网膜面积1/5的视网膜数量来衡量成功率，完整视网膜外植体电穿孔的成功率为75%（83个视网膜中62个成功），而体内电穿孔（in ovo electroporation）的成功率仅为14%（263个眼球中37个.......

讨论

本文介绍了一种从鸡胚中分离、电穿孔或化学处理以及培养完整视网膜外植体的详细实验方案。该方案操作简便、快速，具有较高的成功率和可重复性 结果。

对整个视网膜外植体进行电穿孔可使较大区域的细胞表达目标基因构建物。该方法易于准确放置电极，并可使视网膜的特定区域暴露于确定浓度的DNA质粒中。此方法 提供了一种可靠的技术，用于研究基因在视网膜中的功能，其成功率通常高于在卵内（in ovo）进行的电穿孔。使用整个视网膜外植体还可使视网膜暴露于含有确定浓度化学试剂的培养基中，从而在神经视网膜中实现试剂的均匀分布。该实验方案支持联合处理，即先对视网膜进行电穿孔，再用特定物质进行处理。由于可从同一个胚胎获取处理眼和对照眼，并分别进行处理，因此可最大限度地减少个体胚胎间的差异影响。

本方案已针对孵化第3天（E3）至第5天（st20至st27）胚胎的完整视网膜外植体进行电穿孔，以及孵化第3天（E3）至第7天（st20至st31）胚胎进行化学物质处理进行了优化。在更早期的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1xPBS（片剂）	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm 培养皿	VWR	734-0006
100 μl 移液器吸头	VWR	613-0798
1.5 ml 一次性塑料比色皿	Thomas Scientific	8495V01
24 孔板	Sigma Aldrich	D7039
35 mm 培养皿	VWR	391-1998
70% 乙醇	Solveco	1054
Cdk1/2 抑制剂 III	217714	Calbiochem	0.01% DMSO 中 300 nM
细胞培养孵育箱	Thermo Forma
解剖显微镜	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
电极			铂金，定制
电穿孔仪 ECM 830	Harvard Apparatus
F12 营养混合物	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
镊子	AgnThos	0108-5-PS
冷冻保存液 NEG50	Cellab, Sweden	6502
表达 GFP 的 DNA 质粒（pZGs）
加湿孵育箱	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
胰岛素	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030024
含 DAPI 的 ProLong Gold 封片剂	Life Technologies	P36935
石蜡膜	VWR	291-1214P
多聚甲醛	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way 包埋模具	Sigma Aldrich	E6032
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-122
磷酸化组蛋白 3（PH3）	Millipore	06-570	稀释比例 1/4,000
铂电极（由 "rondelles" 定制）	Sargenta	390-R (rondeller)	直径：4 mm，厚度：0.1 mm
铂电极	Sonidel	CUY700P4L	直径：4 mm
聚乙烯巴斯德吸管	VWR	612-2853
旋转摇床	VWR	444-2900
小勺	VWR	231-2151
蔗糖	VWR	443815S
白来航鸡蛋			本地供应商
葡萄酒冷藏柜	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany