本实验方案描述了一种从鸡胚中分离、实验性操作及培养完整视网膜外植体的方法。当需要高成功率、高效性和可重复性以检测用于电穿孔和/或试剂物质的质粒效果时，此类外植体培养具有重要应用价值。 即， 酶抑制剂
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
视网膜是研究发育中中枢神经系统的良好模型。眼睛体积较大，且最重要的是便于进行实验操作 在卵内/体内 使鸡胚胎视网膜成为一个多功能且高效的实验模型。尽管鸡视网膜易于靶向操作 在卵内 通过玻璃体内注射或电穿孔, 视网膜内试剂的有效浓度和精确浓度可能难以完全控制，这可能是由于注射位点的细微差异、眼球内液体渗漏或物质扩散不均所致。此外，电穿孔等侵入性操作后，畸形发生率和死亡率相对较高。
本方案描述了一种鸡胚全视网膜外植体的ex ovo培养技术，并提供了一种可控暴露视网膜于试剂的方法。该方案详细说明了如何从鸡胚中分离、实验性操作并培养全视网膜外植体。外植体可培养约24小时，并可进行诸如电穿孔等不同处理。其主要优势在于实验不依赖于胚胎存活，且可调节和控制所引入试剂的浓度，从而确定并优化有效浓度。此外，该技术快速、经济，且实验成功率高，可确保结果的可重复性 。需要强调的是，该方法是in ovo实验的极佳补充。
引言
视网膜是中枢神经系统的一部分，由于其结构相对简单且细胞架构已被充分表征，因此成为研究中枢神经系统发育的常用模型。鸡胚的眼睛相对于胚胎其他部分而言较大，因此在体（in ovo）实验操作时易于接近，适用于注射或电穿孔等实验操作，是研究视网膜细胞生物学和发育生物学在体（in vivo）机制的优良工具。尽管具有这些显著优势，当实验具有侵入性时（如电穿孔、重复注射或多种实验操作联合进行），胚胎的存活率可能较低。
将DNA质粒电穿孔转入鸡胚 在卵内 是一种重要且成熟的技术1可用于标记神经元、示踪细胞命运及中枢神经系统中的神经纤维通路，也可实现异位基因表达以分析蛋白质功能 体内该技术已用于神经管的研究2, 后脑3，以及视网膜4胚胎视网膜电穿孔 在卵内 存在一些与之相关的实验困难 体内 情况。由于胚胎的颅部折叠，眼睛的位置相对靠近心脏。这种解剖上的邻近性使得电穿孔后发生心脏骤停的风险增加，且该风险随胚胎发育年龄的增长而升高。此外，为了接近眼睛，必须打开胚胎膜，从而增加了出血、畸形以及后续存活率降低的风险。在测试和优化一种表型结果未知的新DNA质粒时，这些局限性可能降低实验方法的有效性和可靠性，即使对于经验丰富的研究者也是如此。如本实验方案所述，视网膜外植体整体培养——定义为去除色素上皮后的完整神经视网膜——是一种高效的补充方法 在卵内 方法
眼内注射化学试剂相对容易操作 在卵内然而，注射试剂在神经视网膜内的有效浓度和精确浓度可能难以完全控制。由于可能存在渗漏，注射体积可能发生变化，且注射的确切位置可能影响试剂在眼内的分布以及其通过玻璃体的扩散。这种变异性将对结果的解读产生重大影响，当 即， 确定酶抑制剂的剂量反应曲线；特别是当效应较小时，且效应的时间窗口较窄。此外，在进行实验时，每个胚胎只能使用一只眼睛 在卵内 由于可能存在通过血液系统对对侧眼睛产生全身性影响，因此在实验中需注意。在研究发育过程时，年龄匹配非常重要，而处理组与对照组胚胎之间的个体差异可能导致额外的实验变异。
基于上述原因，开发了一种基于鸡胚视网膜外植体的ex ovo方法，可在体外（in vitro）使神经视网膜暴露于均一且可控的实验条件下。本实验方案是在先前已发表的方案5-9基础上建立的。取发育阶段为20期（st20，胚胎第3天[E3]）至31期（st31，E7）的鸡胚视网膜外植体，进行分离、培养，并通过电穿孔导入特定浓度的DNA质粒，或将其暴露于含有特定浓度化学试剂的培养基中。本方案已在近期多项研究中成功应用，所使用的化学试剂包括多种不同物质，如DNA损伤通路调节剂KU55933、SB 218078和NSC 109555 ditosylate，以及细胞周期调节剂Cdk1/2 inhibitor III10,11。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案的实施遵循“视力与眼科学研究协会实验动物护理与使用指南”中的建议。
1. 卵的处理与眼睛采集
- 将白来航鸡鸡蛋储存在 12–14 °C 环境中，储存时间不得超过 1 周。如有条件，可使用冷藏式酒柜储存受精卵。
注意：储存温度过高会导致胚胎发育异常，而温度过低则会增加死亡率。延长储存时间会同时增加胚胎死亡率和发育异常的发生率。 - 将鸡蛋置于 37.5 °C、湿度 60% 的恒温孵卵器中孵化，并以每 24 小时轻轻摇晃 5 次的频率进行轻柔振荡。
- 在所需胚胎发育阶段，将孵化中的鸡蛋从孵卵器中取出。
注意：鸡胚胎的发育年龄以孵化时间计算，通常表示为胚胎日（E）或发育阶段（st），依据 Hamburger 和 Hamilton 所描述的胚胎发育阶段系列进行判定12。 - 将选定的鸡蛋放入超净工作台中，用 70% 乙醇擦拭蛋壳，以避免胚胎污染。
注意：所有操作均应在无菌条件下进行，使用无菌 溶液 https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions 和无菌器械。 - 将鸡蛋侧面用力敲击坚硬表面，使蛋壳破裂。将内容物转移至 100 mm 培养皿中。使用小勺将胚胎转移至含有预热（37 °C）1× PBS 的 35 mm 培养皿中，以防止组织干燥。
- 将含有胚胎组织的 35 mm 培养皿置于超净工作台内的双目体视显微镜下。 用精细镊子夹住胚胎颈部将其断头，并弃去身体部分。
- 用精细镊子从口部开始、在眼腹侧做切口。从切口处开始，撕开围绕整个眼球的组织。夹断视神经，将完整的眼球从眼窝中取出。从同一胚胎中采集左眼和右眼，分别作为对照组或处理组使用。
- 使用小勺将眼球转移至另一个含有预热（37 °C）1× PBS 的 35 mm 培养皿中。
2. 全视网膜外植体的制备
- 使用精细镊子去除眼球周围的所有组织，包括巩膜原基。
注意：组织将容易分离，仅留下视网膜附着在玻璃体和晶状体上，且色素上皮保持完整（图1A-B）。 - 使用精细镊子在眼球背侧的色素上皮上夹出一个小切口，注意不要损伤神经视网膜（图1C）。
- 从切口处开始，用精细镊子轻轻撕开色素上皮，使晶状体和整个视网膜仍附着在玻璃体上（图1D）。将眼球保持在温热（37 °C）的1×PBS中，以利于去除色素上皮。
注意：色素上皮的去除可能较为困难，尤其是在瞳孔周围睫状体区域、眼球前部以及脉络膜裂处。因此，部分色素上皮可能仍残留在神经视网膜上（图1E-F）。
3. 整体视网膜外植体的处理
- 全视网膜外植体的电穿孔
注意：全视网膜外植体的电穿孔可在步骤2完成后直接进行。- 准备培养基，包含1:1的DMEM:F12营养混合物、10%胎牛血清（FBS）、10 U/ml 青霉素-链霉素、5 µg/ml 胰岛素和2 mM L-谷氨酰胺。
- 使用细刃锯从底部向上约8 mm处切断一个1.5 ml 一次性塑料比色皿（12.5 mm x 12.5 mm x 45 mm）（或任何可容纳300–400 µl 溶液的小容器）。
- 将所选DNA质粒用1xDPBS稀释至终浓度为0.1 µg/µl。
- 打开电穿孔仪，将参数设置为：st20–st25（E3–E4）期视网膜使用15 V ，st26–st27（E5）期视网膜使用20 V ；脉冲重复次数设为5次，每次脉冲持续50毫秒，间隔1秒。使用可通过脚踏开关控制的脉冲发生器，因为操作时需要双手固定电极。
- 将两个桨状（扁平圆形，直径4 mm）铂电极（图2A）连接至脉冲发生器的输出接口。
注意：本方案中使用的铂电极由大学车间制作，材料为0.1 mm厚的铂板“圆片”（铂纯度：950 Pt/5 Cu），连接用0.8 mm导线并以塑料管绝缘。 - 使用剪去尖端的聚乙烯巴斯德移液管，小心地将步骤2.3中的全视网膜外植体转移至比色皿（或等效小容器）中，确保移液管开口大小适合视网膜外植体。避免使用标准移液枪头，因为视网膜容易黏附在塑料表面而撕裂。
- 使用100 µl移液器轻柔地完全移除包围视网膜外植体的1x PBS，注意不要触碰视网膜，以防撕裂。
- 向比色皿中加入100 µl质粒溶液，以完全覆盖视网膜外植体。若视网膜漂浮至液面，可用镊子轻轻将其压下。使用镊子或电极调整晶状体朝向比色皿一侧，视神经朝向比色皿底部。
- 将正极置于晶状体前方，负极置于视网膜后方（图2A），注意不要接触组织。
- 踩下脚踏开关施加电流。观察电极处是否有气泡产生，以确认放电成功。
- 使用100 µl移液器小心移除比色皿中全部质粒混合液，避免损伤视网膜。质粒混合液可重复使用3至5次。
- 用预热（37 °C）的1x PBS充满比色皿。使用镊子轻柔地将视网膜外植体从比色皿壁上分离。电穿孔后视网膜表面有时会附着气泡，导致其黏附于器壁。
- 使用聚乙烯巴斯德移液管将全视网膜外植体转移至24孔板中，每孔含1 ml 预热（37 °C）的培养基。每孔孵育一个视网膜外植体。
- 将视网膜外植体置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2 条件下，以50 rpm恒定转速在旋转摇床上孵育24小时。旋转可确保外植体充分接触培养基，并防止其黏附于24孔板底部。
- 进入步骤4。
- 化学试剂处理全视网膜外植体
注意：全视网膜外植体的化学处理可在步骤2完成后直接进行。- 准备培养基，包含1:1的DMEM:F12营养混合物、10%胎牛血清（FBS）、10 U/ml 青霉素-链霉素、5 µg/ml 胰岛素和2 mM L-谷氨酰胺。
- 使用小勺将步骤2.3中的视网膜外植体转移至24孔板中，每孔含1 ml 预热（37 °C）的培养基。每孔孵育一个视网膜外植体。
- 在加入化学试剂或溶剂前，将全视网膜外植体置于细胞培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下，在旋转摇床上以50 rpm恒定转速孵育60分钟。
- 配制化学溶液，例如Cdk1/2抑制剂III（一种M期进程抑制剂13），用DMSO配制成终浓度为30 µM的溶液。
- 从细胞培养箱中取出含全视网膜外植体的24孔板，直接向培养基中加入10 µl化学试剂或溶剂（DMSO），使终浓度为300 nM Cdk1/2抑制剂III，DMSO终浓度为0.01%。手动旋转24孔板，使化学试剂或溶剂在溶液中均匀分布。
- 将视网膜外植体置于培养箱中，于37 °C、5% CO2条件下，在旋转摇床上以50 rpm恒定转速孵育所需时间（最长可达24小时）。
- 进入步骤4。
4. 整体视网膜外植体的固定与冷冻
- 从细胞培养箱中取出含有经处理的全视网膜外植体的24孔板。
- 用小勺将视网膜外植体转移至另一24孔板中，每孔含1 ml冰上预冷的4%多聚甲醛（溶于1×PBS）。冰上固定15分钟。
- 用小勺将全视网膜外植体转移至另一24孔板中，每孔含1 ml冰上预冷的1×PBS，用于洗涤视网膜。冰上孵育10分钟。
- 用小勺将全视网膜外植体转移至另一24孔板中，每孔含1 ml冰上预冷的30%蔗糖（溶于1×PBS）。根据视网膜的胚胎发育天数，在冰上孵育1–3小时 。对于st20–st25（E3）阶段的视网膜，孵育1小时；较老的视网膜需更长的蔗糖孵育时间。
- 用小勺将全视网膜外植体转移至含有约500 µl 冷冻切片包埋介质的石蜡膜上。用小勺轻轻搅动外植体，尽可能去除残留的蔗糖溶液。
- 将视网膜外植体转移至含有包埋介质的模具中，调整眼球位置以便后续切片。将含有全视网膜外植体的模具置于干冰上，直至包埋介质完全冻结。随后于-80 °C保存。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案描述了鸡胚完整视网膜外植体的制备（图1A-F）与培养方法。该方案已成功应用于孵化第3天（st20，E3）至第7天（st31，E7）鸡胚的完整视网膜外植体。
将DNA质粒电穿孔转染至完整的视网膜外植体中，可实现对视网膜前体细胞的标记与示踪，或不同基因产物的过表达。在电穿孔实验中，小心去除st25（E4½）胚胎眼球的色素上皮层。将完整的视网膜外植体置于含有DNA质粒溶液的电转杯中，浸入电极（图2A），并施加电流。培养24小时后，可在大部分完整视网膜中观察到GFP阳性细胞（图2B）。切片后，沿视网膜的顶-基底轴可清晰检测到单个GFP阳性细胞（图2C）。电穿孔导致较大范围的视网膜区域摄取质粒并表达报告基因。以电穿孔区域大于整个视网膜面积1/5的视网膜数量来衡量成功率，完整视网膜外植体电穿孔的成功率为75%（83个视网膜中62个成功），而体内电穿孔（in ovo electroporation）的成功率仅为14%（263个眼球中37个...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种从鸡胚中分离、电穿孔或化学处理以及培养完整视网膜外植体的详细实验方案。该方案操作简便、快速，具有较高的成功率和可重复性 结果。
对整个视网膜外植体进行电穿孔可使较大区域的细胞表达目标基因构建物。该方法易于准确放置电极，并可使视网膜的特定区域暴露于确定浓度的DNA质粒中。此方法 提供了一种可靠的技术，用于研究基因在视网膜中的功能，其成功率通常高于在卵内（in ovo）进行的电穿孔。使用整个视网膜外植体还可使视网膜暴露于含有确定浓度化学试剂的培养基中，从而在神经视网膜中实现试剂的均匀分布。该实验方案支持联合处理，即先对视网膜进行电穿孔，再用特定物质进行处理。由于可从同一个胚胎获取处理眼和对照眼，并分别进行处理，因此可最大限度地减少个体胚胎间的差异影响。
本方案已针对孵化第3天（E3）至第5天（st20至st27）胚胎的完整视网膜外植体进行电穿孔，以及孵化第3天（E3）至第7天（st20至st31）胚胎进行化学物质处理进行了优化。在更早期的...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了瑞典儿童癌症基金会（Barncancerfonden，项目编号 PR2013-0104）、瑞典研究理事会（12187-18-3）、眼科基金会（ögonfonden）、玛格丽特王储夫人视力障碍者工作委员会、视觉促进研究基金会（Synfrämjandets forskningsfond）以及圣埃里克眼科医院研究奖学金的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1xPBS（片剂） | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm 培养皿 | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl 移液器吸头 | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml 一次性塑料比色皿 | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24 孔板 | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm 培养皿 | VWR | 391-1998 | |
| 70% 乙醇 | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 抑制剂 III | 217714 | Calbiochem | 0.01% DMSO 中 300 nM |
| 细胞培养孵育箱 | Thermo Forma | ||
| 解剖显微镜 | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| 电极 | 铂金，定制 | ||
| 电穿孔仪 ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 营养混合物 | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| 镊子 | AgnThos | 0108-5-PS | |
| 冷冻保存液 NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| 表达 GFP 的 DNA 质粒（pZGs） | |||
| 加湿孵育箱 | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| 胰岛素 | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030024 | |
| 含 DAPI 的 ProLong Gold 封片剂 | Life Technologies | P36935 | |
| 石蜡膜 | VWR | 291-1214P | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way 包埋模具 | Sigma Aldrich | E6032 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| 磷酸化组蛋白 3（PH3） | Millipore | 06-570 | 稀释比例 1/4,000 |
| 铂电极（由 "rondelles" 定制） | Sargenta | 390-R (rondeller) | 直径：4 mm，厚度：0.1 mm |
| 铂电极 | Sonidel | CUY700P4L | 直径：4 mm |
| 聚乙烯巴斯德吸管 | VWR | 612-2853 | |
| 旋转摇床 | VWR | 444-2900 | |
| 小勺 | VWR | 231-2151 | |
| 蔗糖 | VWR | 443815S | |
| 白来航鸡蛋 | 本地供应商 | ||
| 葡萄酒冷藏柜 | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
参考文献
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
