通过光谱荧光法测定心肌梗死后大鼠杏仁核中的 Caspase-3 活性

摘要

心肌梗死（MI）不仅会导致心脏功能受损，还会引发杏仁核的细胞凋亡，杏仁核是参与心肌梗死后行为学改变的脑区。本方案描述了如何诱导心肌梗死、采集杏仁核组织，并检测其中的caspase-3活性——一种细胞凋亡的标志物。

摘要

心肌梗死（MI）在生理和行为层面上具有显著的中期和长期后果，但其潜在机制仍不明确。本实验室建立了一种心肌梗死后综合征的大鼠模型，该模型表现出心脏功能受损、边缘系统神经元丢失、认知障碍以及抑郁样行为表现。在神经元层面，caspase-3 的激活介导了心肌梗死后不同边缘区（如杏仁核）的细胞凋亡，其活性在 MI 后第 3 天达到峰值。认知与行为障碍出现在 MI 后 2 至 3 周，且这些障碍在统计学上与 caspase-3 活性指标相关。本文所述方案用于诱导心肌梗死、采集杏仁核组织，并通过荧光分光光度法测定 caspase-3 活性。为诱导心肌梗死，需对冠状动脉降支进行 40 分钟的结扎闭塞。caspase-3 激活评估方案始于 MI 后第 3 天：处死大鼠后迅速从脑中分离杏仁核组织。样本立即在液氮中速冻，并保存于 -80 °C，直至实际检测。用于评估 caspase-3 激活的技术基于 caspase-3 对底物（DEVD-AMC）的切割作用，该过程释放出一种可被荧光分光光度法检测的荧光化合物。该方法具有定量准确、可重复性高的优点，但所需设备昂贵，且样本定量过程耗时较长。该技术可应用于其他组织，如心脏和肾脏。DEVD-AMC 可替换为其他底物，以检测其他 caspase 的活性。

引言

Caspases（即依赖半胱氨酸的天冬氨酸定向蛋白酶）是一类参与多种稳态过程的酶¹。根据其在细胞凋亡或炎症中的作用，Caspases 可 broadly 分为两类。其中，Caspase-1、-4、-5 和 -12 参与炎症反应；而参与细胞凋亡的 Caspases 可进一步分为起始型 Caspases（Caspase-8 和 -9）和效应型 Caspases（Caspase-3、-6 和 -7）。

Caspase 在多种病理过程中发挥重要作用，主要见于细胞凋亡过度的疾病，例如心肌梗死（MI）或脑缺血后所观察到的情况。

在我们实验室所采用的MI后综合征大鼠模型中，已证实caspase-3不仅在心肌组织²中被激活，也在参与情绪和情感调控的边缘系统中被激活^3-6。此外，caspase-3在边缘系统的不同区域（如杏仁核和海马）均被激活，且其激活水平在缺血损伤后约3天达到峰值⁴。有趣的是，caspase-3的活性与MI后的行为功能障碍相关，通过药理学和营养干预手段抑制其活性可减轻这些损伤，提示caspase-3可能与MI后抑郁存在关联^7-12。

Caspase-3 的激活可通过多种技术进行检测。Western 印迹法可确定caspase酶的酶学特性，能够检测到活性酶及其前体酶形式。然而，Western 印迹法为半定量方法，微小的变化可能因信噪比较低而难以察觉¹³。更优的技术是基于caspase-3对底物（DEVD-AMC）的切割作用，释放出荧光化合物，可通过荧光分光光度法进行测定。Caspase-3 的激活是细胞凋亡的一个可靠标志物。由于细胞凋亡发生的时间窗口较短，且邻近细胞可能吞噬凋亡小体或凋亡细胞¹⁴，因此凋亡的检测结果可能不稳定。细胞凋亡还可通过其他技术进一步确认，例如末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法，该方法可检测由凋亡信号级联反应引起的DNA片段化⁶，或通过检测促凋亡/抗凋亡蛋白的比例（如Bax/Bcl2）⁶来验证。

方案

动物的饲养和操作严格遵守当地动物护理委员会的规定，并符合加拿大动物护理委员会指南的要求. 大鼠在恒定环境条件下单独饲养（温度 21–22 ºC，湿度 40–50%），并维持 12 小时光照-黑暗循环，光照始于上午 08:00。自由供应饲料颗粒和自来水 随意供应 在整个研究过程中，动物在供应商交付后需经过3天的适应期方可开始实验。本方案常规使用体重在300–800 g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠。

1. 心肌梗死手术

1. 使用氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行腹腔注射以诱导麻醉。通过轻捏足掌无反射反应确认麻醉成功。
2. 剃除手术部位毛发。使用气管插管（16G，1.77英寸导管）对大鼠进行插管，并将动物置于侧卧位。将动物放置在加热垫上，维持体温约37 °C。将气管插管连接至2%异氟烷。
3. 用氯己定葡萄糖酸盐和异丙醇准备手术部位。手术过程中使用无菌手套和灭菌器械。在麻醉期间，于双眼涂抹眼用软膏以防止干燥。将动物置于无菌区域，并将器械放置在动物旁边的另一无菌区域上。
4. 用10号手术刀片切开皮肤。用止血钳剥离肌肉组织。将动物置于俯卧位。用止血钳打开胸壁并放置胸廓牵开器。用止血钳切开心包膜。
5. 为制造冠状动脉闭塞，将一根长360 mm的4-0丝线缝合线环绕于冠状动脉降支，并穿过相邻的心肌组织。将丝线的两端穿入一段长1.25 cm、14G的塑料管中。
6. 牵拉丝线缝合线的两端，将导管向下推压紧贴动脉以阻断血流，持续40分钟。使用止血钳夹紧塑料导管，确保阻断牢固。
7. 40分钟后，松开止血夹以解除阻断，随后移除软管和丝线。
   注：假手术对照组大鼠接受相同的手术操作，但不进行冠状动脉结扎。
8. 在关闭胸壁前，将一根软质导管（18G，4.5 cm）穿过胸腔，用5 ml注射器抽出胸腔内的空气，以防止气胸的发生。
9. 用2-0缝线闭合胸腔，4-0丝线缝合肌肉，3-0丝线缝合皮肤。
10. 在缝合最后一处皮肤切口前，再次通过先前置于胸腔内的导管，用5 ml注射器抽出胸腔内的空气。
11. 缝合最后一针皮肤。停止异氟烷通气。
12. 监测大鼠苏醒情况。在动物未恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得离开动物无人看管。
13. 每8小时给大鼠注射一次镇痛剂（布托啡诺，0.05 mg/kg，腹腔注射）和抗生素（双氯西林单剂量，0.2 mg/kg，腹腔注射），持续24小时。
14. 手术后，将大鼠单独饲养至处死时间点 即，心肌梗死后第3天
15. 梗死面积，主要为坏死区域，以左心室风险区中梗死组织所占比例表示。可通过三苯基四氮唑染色法进行测量。¹¹.

2. 杏仁核分离

1. 将动物头部朝前放入锥形袋中，使其鼻部从窄端开口处伸出。固定大鼠以避免任何移动。将其头部适当放置在剪切器的刀片之间，进行断头。
2. 将大鼠头部置于盛有碎冰的培养皿中。所有组织分离操作均需在碎冰上（4 °C）进行。
3. 用剪刀剪开颅骨，使用骨钳小心向上牵拉，剥离骨膜，注意避免损伤下方组织。
4. 将刮勺的平刃置于颅底与脑后腹面之间，沿颅底轻轻向前推动刮勺，使脑组织逐渐与颅骨分离，直至可缓慢将脑取出。弃去颅骨。
5. 将脑组织背侧朝下放置。辨认下丘脑（位于小脑前方的结构），在下丘脑前端之前和后端之后进行冠状切面切割；若前后部分无需用于其他用途，则予以弃去。
6. 在双侧颞叶下方、紧邻下丘脑处，可见杏仁核呈小球状结构。
7. 将脑组织前端平放，背侧朝远离实验操作者方向。
8. 从脑的左侧或右侧开始。分离两侧半球，再将皮层与相邻的杏仁核分开。切除约 8 mm 的松散皮层组织，以便分离杏仁核。用手术刀切除杏仁核。
9. 沿贯穿该结构的深色缝线进行切割，将近似均等地分离杏仁核的基底外侧部与内侧中央部。此缝线结构并不总是易于识别。
10. 将杏仁核亚区分别放入已标记的样品管中，并置于碎冰上保存。
11. 对另一侧脑半球重复上述解剖步骤。
12. 将样品管浸入液氮中 1 分钟。随后将样品管保存于 -80 °C 冰箱中，待后续使用。

3. Caspase-3 活性

1. 用0.32 M蔗糖、1% Triton-X-100、10 mM Tris-HCl（pH 8）、5 mM乙二胺四乙酸、2 mM二硫苏糖醇、1 mM苯甲基磺酰氟、10 µg/µl亮抑蛋白酶肽、10 µg/µl胃蛋白酶抑制剂A和10 µg/µl抑肽酶配制裂解缓冲液。
2. 向每个样品（5–10 mg）中加入150 µl裂解缓冲液，置于冰上。在冰上以最大强度（40 W）对每个样品超声处理5秒。将组织在裂解缓冲液中于冰上孵育30分钟。每个样品涡旋振荡5分钟。
3. 通过将样品交替置于液氮和设定为37 °C的温控加热板上，进行3次冻融循环。在13,000 g（4 °C）下离心组织10分钟。小心移去上清液，并将上清液置于冰上的管中保存。
4. 使用牛血清白蛋白配制0至10 µg/ml之间的标准蛋白浓度梯度。仅用缓冲液配制空白对照。
5. 向每个标准品中加入200 µl Bradford试剂。在595 nm波长下测定标准品吸光度。测定蛋白含量时，将5 µl样品上清液加入795 µl蒸馏水中，再加入200 µl Bradford试剂。在595 nm波长下测定每个样品的吸光度，并利用标准曲线定量蛋白浓度。
6. 用50 mM Tris-HCl（pH 7）、5 mM MgCl₂、1 mM乙二醇四乙酸、0.1% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐和1 mM二硫苏糖醇配制反应缓冲液。
7. 向反应缓冲液中加入25 µg蛋白和caspase-3底物，以获得阳性和阴性反应样品。对于阴性样品，加入反应缓冲液、25 µg蛋白、0.4 µl 800 µM Ac-DEVD-CHO和0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC。对于阳性样品，将25 µg蛋白加入反应缓冲液中，并加入0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC。所有阴性和阳性样品均设三个重复。通过加入反应缓冲液将每个样品的终体积补至200 µl。
8. 制备阴性对照：向188.7 µl反应缓冲液中加入0.5 µl 800 µM Ac-DEVD-CHO、0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC和10 µl裂解缓冲液。制备阳性对照：向189.2 µl反应缓冲液中加入0.8 µl 10 mM Ac-DEVD-AMC和10 µl裂解缓冲液。
9. 将样品和对照在避光条件下于37^oC孵育3小时。
10. 向每个样品和对照中加入600 µl 0.4 M甘氨酸和0.4 M NaOH（pH 10）以终止反应。
11. 使用荧光分光光度法在激发波长365 nm、发射波长465 nm下测定荧光强度。在玻璃比色皿中向反应液中加入2 ml蒸馏水。对每个对照和样品连续读数10秒，每秒采集1个数据点。
12. 计算各样品的特异性活性：[(阴性样品荧光值减去阳性样品荧光值) × 2.8 ml总体积] 除以 (孵育时间3小时 × 蛋白量25 mg)。

结果

在缺血/再灌注处理后第3天，从8只假手术（对照）大鼠和8只心肌梗死（MI）大鼠中分离出杏仁核组织。使用一种可被活化型caspase-3切割的荧光底物，通过荧光分光光度法检测该组织中的caspase-3活性。阳性与阴性测量值（见步骤3.11、3.12和3.16）均设三个重复，测量持续10秒，每秒记录1个数据点。计算阳性与阴性对照之间的差值，并将本实验中所有假手术组组织的差值平均值设定为100%。心肌梗死大鼠的结果据此参考值进行归一化处理，图1展示了最终结果：与假手术组相比，心肌梗死大鼠的caspase-3活性显著升高（p <0.05）。

图 1. 心肌梗死大鼠杏仁核中 Caspase-3 活性，以假手术对照组平均活性的百分比表示，对照组设为 100%（每组 8 只大鼠）。* 表示组间差异具有统计学意义（p <0.05）。数据以均值 ± 标准误表示。

讨论

在过去10年使用该方案的经验中，我们识别出了一些关键的方法学问题。首先，在装有碎冰的培养皿中快速进行脑组织解剖对于保持制备质量至关重要。其次，必须认识到，与心脏（10秒）或肾脏（20秒）等其他组织相比，大脑杏仁核组织的超声处理时间更短。第三，在将底物加入样品前，应仔细充分混匀底物；若混匀步骤不当，我们曾观察到信号出现波动。第四，读取样品时石英比色皿中不得含有气泡，否则可能导致信号异常。

近年来，我们进行了一项改进以提高实验结果的可重复性：增加底物体积，以避免体积低于1 µl。尽管如此，连续实验之间仍可能出现微小差异，因此至少应使用3个对照样品来控制变异。这些对照样品的荧光测量值取平均值，并将该平均值设定为100%。实验样品的荧光测量值则转换为对照样品的百分比形式。

该技术的另一个局限性在于仅使用了部分组织，因此可能低估caspase-3的活性。事实上，在特定细胞中，凋亡的时间窗口较短，在取样时即使邻近区域发生了凋亡，也可能被遗漏^1,4,15。相反的情况也有可能发生：在某些组织区域中凋亡可能特别剧烈，从而导致caspase-3活性被高估。我们建议将剩余的组织（如杏仁核）用于其他补充性技术，例如TUNEL检测或Bax/Bcl2比值分析（参见引言部分）。

与蛋白质印迹法相比，荧光分光光度法至少具有两个优势。第一，它可直接生成定量数据。第二，它测量的是酶活性本身，而非可能与酶活性无关的蛋白质或RNA表达水平；已知蛋白质表达水平可能升高，而酶活性并无变化。此外，荧光分光光度法可用于其他组织或不同动物物种，并可通过使用不同的底物调整用于其他半胱天冬酶（caspase）亚型，从而实现安全的比较分析。

综上所述，本文展示了利用荧光分光光度法检测杏仁核中caspase-3活性的方法，提供了心肌梗死3天后边缘系统这一区域发生细胞凋亡的证据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光分光光度计	Photon technology Instrument（现为 Horiba）	Ratiomaster M-40	配备 DeltaRAM  随机存取单色器
呼吸机	Harvard apparatus	683	小型动物通气
玻璃比色皿	NSG precision cells	3G10	光学玻璃（340–2,500 nm），10 mm 光程
超声破碎仪	Cole Parmer	4710  系列
分光光度计	Varian	Cary 50 Bio