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方法文章

体外利用AC-6饲养系统从共同淋巴样前体细胞生成小鼠浆细胞样树突状细胞

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DOI：

10.3791/53211

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2015年11月23日

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Biochemistry, Chang Gung University College of Medicine, 3Molecular Medicine Research Center, Chang Gung University College of Medicine

本文内容

摘要

本研究中，我们介绍了一种 体外 可高效生成浆细胞样树突状细胞的培养系统 由 在Flt3配体存在下，将普通淋巴样祖细胞与AC-6饲养细胞共培养。

摘要

浆细胞样树突状细胞（pDCs）是一类强大的Ⅰ型干扰素（IFN-I）产生细胞，可在感染或炎症反应中被激活。然而，由于其在淋巴器官中频率较低，加之现有研究方法的局限，pDCs功能的研究受到阻碍。 体外 树突状细胞的生成通常更倾向于产生经典树突状细胞（cDCs）而非浆细胞样树突状细胞（pDCs）。本文介绍一种从常见淋巴样祖细胞（CLPs）高效生成pDCs的独特方法。 体外具体而言，本方案详细描述了如何从骨髓中纯化CLPs，并在Flt3配体存在下，通过与γ射线照射的AC-6饲养细胞共培养以生成pDCs。该培养系统的一个独特特征是CLPs会迁移至AC-6细胞下方，并形成类鹅卵石区域细胞（cobblestone area-forming cells），这是扩增pDCs的关键步骤。在最佳条件下，经过约2周培养后可生成形态上 distinct 的树突状细胞，即pDCs和cDCs，其中pDCs占比为70–90%。通常情况下，采用该方法生成的pDCs数量约为接种CLPs数量的100倍。因此，该系统是一种可高效生成大量pDCs的新型方法，有助于进一步研究这些细胞的发育与功能。

引言

树突状细胞（DCs）是一类专业的抗原呈递细胞，在调控免疫应答中发挥重要作用1。尽管DCs具有异质性，但通常可分为两大类：传统树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）2,3。除了存在于淋巴器官外，cDCs和pDCs也分布于肺、肠道和皮肤等组织中2。cDCs和pDCs在形态上有所不同，cDCs具有树突状突起，而pDCs的形态更类似于浆细胞。此外，小鼠DC的通用标志物CD11c在cDCs上的表达水平高于pDCs。cDCs还可进一步分为CD11b+CD24- cDCs和CD11b-CD24+ cDCs，这两类细胞表达的MHC II类分子和共刺激分子水平均高于pDCs2。相比之下，成熟的pDCs可选择性表达Siglec-H和BST24。在功能上，cDCs的抗原呈递能力优于pDCs；然而，pDCs在病毒感染或炎症刺激下能够产生大量I型干扰素5。

cDC和pDC的寿命较短，因此必须由骨髓（BM）中的前体细胞持续补充6,7将普通髓系祖细胞（CMPs）和普通淋巴系祖细胞（CLPs）过继转移至致死剂量照射的小鼠体内，证明cDCs和pDCs均可由这两种谱系生成8-10然而，存在一部分pDCs表达RAG1/2，并在IgH位点具有重排的D-J片段11,12这些细胞在分子特征上也与B淋巴细胞具有相似性，包括表达B220标志物、核酸感应受体（TLR7/TLR9）以及转录因子Spib 和 Bcl11a)13，这些特征均被认为是淋巴细胞系的标志。因此，CLPs 可能是理想的选择 体外 由于谱系相似性，pDCs的生成。

尽管人类和小鼠中cDCs和pDCs的频率都非常低6，树突状细胞（DCs），特别是经典树突状细胞（cDCs），可以被诱导生成 体外 在细胞因子（如GM-CSF）存在的情况下，从骨髓或前体细胞中11,14 或使用无饲养层系统制备 Flt3 配体（FL） 11,15,16然而，遗憾的是，无法大量生成pDCs 体外 使用 FL11,15,16. 之前我们已证明，pDCs 可被高效地生成 体外 使用AC-6饲养层系统从CLPs中分离17使用AC-6基质细胞系在培养体系中的优势在于其能够提供细胞间接触以及分泌支持从CLPs大量生成pDCs的细胞因子。尽管该体系的产量较高，但仍需严格重复以下所述操作步骤，以确保pDCs的高效生成。

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方案

野生型 C57BL/6 小鼠购自中国台湾国家实验动物中心（NLAC）。所有小鼠均在特定无病原体条件下饲养和保藏。实验方案及动物使用程序均经台湾大学医学院机构动物照护及使用委员会审查并批准（许可编号：20120075）。此外，研究人员在进行实验时尽一切努力减少动物可能经历的疼痛、痛苦或应激。所述所有操作均在室温下佩戴手套进行。

1. AC-6 饲养细胞的制备

注意：AC-6.21（简称 AC-6）基质细胞系18（由斯坦福大学 I. Weissman 提供）应培养在添加了15%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中。为用作饲养层细胞，AC-6细胞需在共培养前一天接受3,000 rad（30 Gy）的γ射线照射，以阻止其增殖。需注意，若AC-6细胞在传代培养过程中过度拥挤，或传代次数超过20代，其支持分化的能力往往会下降。

  1. 用 1 ml 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 AC-6 细胞一次，并通过抽吸去除 DPBS。加入 0.8 ml 胰蛋白酶溶液（含 0.05% 胰蛋白酶和 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液），在 37oC、5% CO2 条件下处理 3–5 分钟，随后用 10 倍体积的培养基稀释以终止反应，制备成单细胞悬液。
  2. 将 AC-6 细胞以每孔 5.9×104 个细胞的密度接种至 12 孔板中，在 37oC、5% CO2 条件下过夜培养。
    注意：AC-6 细胞的密度至关重要，较低的密度有利于 cDC 的生成。以每孔 5.9×104 个细胞的密度接种可使 AC-6 细胞在次日达到汇合状态，此状态最有利于从 CLP 细胞诱导生成 pDC。
  3. 使用 γ 射线辐照仪对 AC-6 细胞进行 3,000 rad（30 Gy）的辐照处理。
    注意：该辐照剂量经过优化，旨在阻止细胞增殖，同时保持细胞足够长的存活时间，以提供 CLP 向 DC 分化过程中所需的细胞因子及细胞间接触信号。
  4. 抽吸培养基，更换为 1 ml 完全 RPMI 培养基（含 10% 热灭活 FBS、50 µg/ml 庆大霉素和 50 µM β-巯基乙醇的 RPMI 培养基）。

2. 从小鼠中分离骨髓细胞

  1. 采用 CO2 窒息法结合颈椎脱位处死小鼠。将小鼠置于解剖托盘上，并用 70% 乙醇进行表面消毒。在腹部中线处做切口，剥离小鼠远端皮肤，包括覆盖下肢的皮肤。
  2. 在半无菌操作台内进行解剖。剪断膝关节上方的股骨和下方的胫骨以取出骨骼。用剪刀去除附着在骨上的肌肉，将骨骼放入含有 5 ml 完全 RPMI 培养基的 6 cm 培养皿中。
  3. 转移至无菌细胞培养超净台。用连接 27G 针头的 3 ml 注射器吸取完全 RPMI 培养基。用剪刀剪去骨的两端，将 27G 针头插入骨髓腔，从每端各轻柔注入一次完全 RPMI 培养基，以冲洗出骨髓细胞。
  4. 取下针头，使用该注射器在培养皿中轻柔吹打细胞 3–5 次，制备单细胞悬液。
  5. 以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  6. 加入 1 ml ACK 裂解缓冲液（150 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM EDTA）裂解红细胞，孵育 1 分钟后，加入 10 倍体积的完全 RPMI 培养基终止反应。静置 5 分钟，使死亡细胞团块和组织碎片在重力作用下沉降形成沉淀。
    注意：静置时间不得超过 5 分钟，否则会导致活细胞沉降而造成细胞损失。
  7. 缓慢将含有细胞的上清液转移至新离心管中，保留沉淀物于原管内。
  8. 以 500 × g 离心 5 分钟使细胞成团，随后吸除并弃去上清液。
  9. 将总骨髓细胞（通常每只小鼠可获得 4–6 × 107 个骨髓细胞）重悬于 100 µl FACS 缓冲液（1× PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA）中。

3. CLP 的 FACS 分析与分选

  1. 在 FACS 缓冲液（步骤 2.9）中加入抗 CD16/32 抗体（杂交瘤上清液，克隆号 2.4G2，每反应 50 µl 或 1–2 µg），作用 1–2 分钟，以阻断 Fc 受体。
    注意：抗 CD16/32 也称为 Fc 封闭抗体，用于防止抗体非特异性结合表达 Fc 受体的细胞，包括粒细胞、单核细胞和 B 淋巴细胞。
  2. 在冰上避光孵育 15 分钟，同时使用以下荧光染料标记的抗体对细胞进行染色（针对 4×107 个细胞）。抗体包括：PE 标记的谱系标记物（每种 0.2 µg），即抗 CD3（17A2）、抗 CD8（53-6.7）、抗 B220（RA3-6B2）、抗 CD19（eBio1D3）、抗 CD11b（M1/70）、抗 Gr-1（RB6-8C5）、抗 Thy1.1（HIS51）、抗 NK1.1（PK136）、抗 TER119（TER-119）和抗 MHC-II（NIMR-4）；0.2 µg 抗 c-Kit-PerCP-Cy5.5（2B8）；0.2 µg 抗 IL-7Rα-PE-Cy7（A7R34）；0.4 µg 抗 M-CSFR-APC（AFS98）；以及 1 µg 抗 Sca-1-FITC（D7）。
  3. 用 3 ml FACS 缓冲液洗涤细胞，并在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  4. 将细胞重悬于 300 µl FACS 缓冲液中，并通过 40 µm 细胞滤器过滤。
  5. 用额外的 100 µl FACS 缓冲液冲洗离心管，以回收残留细胞，并使用同一细胞滤器将液体过滤至无菌 FACS 分选管中。
  6. 染色后立即使用适当的滤光片和电压进行流式细胞术分析，以检测信号。使用 488 nm 激光检测 FITC 和 PerCP-Cy5.5 标记的抗体，561 nm 激光检测 PE 和 PE-Cy7 标记的抗体，633 nm 激光检测 APC 标记的抗体。
  7. 根据以下表型标记分选 CLP 细胞：lin-c-kitintSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+（如步骤 3.2 所染色），使用细胞分选仪进行分选。将分选出的细胞收集至含有 8 ml 完全 RPMI 培养基作为缓冲层的 15 ml 管中。
  8. 记录分选结束时细胞分选仪显示的分选细胞绝对数量。通常，从小鼠骨髓中可获得约 5×104 个 CLP 细胞。

4. 共培养CLPs与AC-6

  1. 将步骤 3.7 中分选的细胞在 500 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，并用足量的完全 RPMI 培养基重悬细胞沉淀，使细胞密度约为 5×104 个细胞/毫升。将 500 个细胞/孔接种至含有步骤 1.4 中制备的饲养细胞的 12 孔板中。
  2. 加入 100 ng/ml FL19（hu-Flt3L-Ig，由瑞士苏黎世大学医院 M. Manz 提供的表达系统在本实验室制备），在 37oC、5% CO2 条件下培养，并定期在显微镜下观察树突状细胞（DC）的发育情况。
    注意：可使用市售的重组人源 FL 或小鼠 FL 替代 hu-Flt3L-Ig，以支持 DC 的发育。
  3. 在第 12 天收集上清液中的细胞，并用 0.5 ml 完全 RPMI 培养基洗涤孔板一次，合并所得上清液。加入 0.5 ml 新鲜培养基，并用细胞刮刀刮下贴壁细胞。
  4. 合并两部分含细胞的培养基，于 500 × g 离心 5 分钟。
  5. 倾去上清液，将细胞重悬于 50 µl FACS 缓冲液中。加入 50 µl 抗 CD16/32 杂交瘤上清液，孵育 1–2 分钟以阻断 Fc 受体。
  6. 使用以下抗体（每种 0.05 µg）对所有细胞进行计数并染色：抗 CD11c-APC（N418）、抗 CD11b-FITC 和抗 B220-PE。
  7. 按照步骤 3.3 所述方法洗涤并离心细胞。
  8. 将细胞重悬于 100 µl FACS 缓冲液中，圈选 CD11c+ 细胞，并分析传统树突状细胞（cDCs，CD11c+CD11b+B220-）和浆细胞样树突状细胞（pDCs，CD11c+CD11b-B220+）17。

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结果

通常从一只6-8周龄的野生型C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离出约4-6×107个骨髓细胞。为分选CLP，需将全部骨髓细胞用PE标记的谱系标志物抗体（CD3、CD8、B220、CD19、CD11b、Gr-1、Thy1.1、NK1.1、TER119和MHC-II）、抗c-Kit-PerCP/Cy5.5、抗Sca-1-FITC、抗M-CSFR-APC以及抗IL-7Rα-PE/Cy7进行染色，随后通过细胞分选仪进行分析和分选。CLP的分选策略见图1。通常，从一只C57BL/6小鼠可获得约5×104个CLP。若需获得更多CLP，可合并3-4只小鼠的骨髓细胞，并在分选前相应调整实验方案。

将500个CLP细胞与5.9×106个AC-6饲养细胞共培养后，到第3-4天开始出现鹅卵石样区域形成细胞（CAFC）。到第8天，出现圆形的浆细胞样树突状细胞（pDC），悬浮于CAFC之上（图2A）。pDC数量在第12-14天左右达到峰值，此时pDC在完全发育后开始发生凋亡，...

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讨论

在此我们描述一种 体外 一种可从少量CLPs高效生成树突状细胞（DCs），尤其是浆细胞样树突状细胞（pDCs）的培养体系。该培养体系的独特之处在于使用AC-6细胞（一种基质细胞系）作为饲养层。该方法已被证实不仅能提供IL-7、SCF、M-CSF和FL等细胞因子，20，还包括细胞间的接触21 支持DC发育所必需。AC-6细胞此前已被用于促进相关研究。 体外 多种前体细胞分化为树突状细胞的发育过程8,16,22我们发现，接种适当密度的AC-6饲养细胞对于支持pDCs从CLPs高效分化至关重要。具体而言，接种5.9×10⁵4 在12孔板中，γ射线照射的AC-6细胞于次日达到汇合状态，适用于pDC的发育。较低的AC-6细胞密度（3.9×10⁵412 孔板中的每个孔）倾向于支持 cDC 的发育24因此，建议首先接种不同浓度的AC-6细胞，以在扩增培养体系时优化培养条件。23此外，同样重要的是 必须严格维护AC-6细胞，包括密切注意传代次数，且绝不可使...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Markus Manz博士和Irving Weissman博士提供试剂。同时感谢台湾大学医学院第一和第二核心实验室的流式细胞分析与细胞分选核心设施以及台湾大学医院所提供的服务。本研究由台湾科技部（MOST 102-2320-B-002-030-MY3）和台湾国家卫生研究院（NHRI-EX102-10256SI 和 NHRI-EX103-10256SI）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗小鼠 Ly6g/Ly6c（PE），克隆 RB6-8C5Biolegend108408谱系标记
抗小鼠 NK1.1（PE），克隆 PK136Biolegend108708谱系标记
抗小鼠  CD11b（PE），克隆 M1/70Biolegend101208谱系标记
抗小鼠 CD19（PE），克隆 eBio1D3Biolegend115508谱系标记
抗小鼠 B220（PE），克隆 RA3-6B2Biolegend103208谱系标记/FACS
抗小鼠 CD3（PE），克隆 17A2Biolegend100308谱系标记
抗小鼠 CD8a（PE），克隆 53-6.7Biolegend100707谱系标记
抗小鼠 MHC-II（PE），克隆 NIMR-4Biolegend107608谱系标记
抗小鼠 Ter119（PE），克隆 TER-119Biolegend116208谱系标记
抗小鼠 Thy1.1（PE），克隆 HIS51eBioscience12-0900-83谱系标记
抗小鼠 M-CSFR（APC），克隆 AFS98Biolegend135510FACS
抗小鼠 c-Kit（PerCP/Cy5.5），克隆 2B8Biolegend105824FACS
抗小鼠 Sca-1（FITC），克隆 D7Biolegend108106FACS
抗小鼠 IL-7Ra（PE/Cy7），克隆 A7R34Biolegend135014FACS
抗小鼠 CD11c（PerCP/Cy5.5），克隆 N418Biolegend117328FACS
抗小鼠 CD11b（FITC），克隆 M1/70Biolegend101206FACS
FACSAria IIIBD Biosciences细胞分选仪
FACS 分选管 BD Biosciences352054
FlowJoFlowJo LLC流式分析软件

参考文献

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -L., Chang, S., Chen, T. -T., Lee, C. -K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217(2015).

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