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VDJ-Seq：重排免疫球蛋白重链基因的深度测序分析揭示B细胞淋巴瘤的克隆演化模式

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DOI：

10.3791/53215

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2015年12月28日

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1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过深度测序分析淋巴瘤中重排的免疫球蛋白重链VDJ区域的方法，可获取VDJ重排及体细胞高频突变状态，以解析单个肿瘤的克隆结构。通过比较配对的初诊与复发样本之间的克隆结构，揭示淋巴瘤复发过程中的克隆演化模式。

摘要

了解肿瘤克隆性对于理解肿瘤发生及疾病进展的机制至关重要。此外，了解肿瘤在特定微环境或治疗干预下发生的克隆组成变化，可能有助于设计更精细且有效的策略以根除肿瘤细胞。然而，由于缺乏可区分的标记物，追踪肿瘤克隆亚群一直具有挑战性。为解决这一问题，研究人员开发了一种VDJ-seq技术，利用B细胞淋巴瘤所特有的两种特征——VDJ重排和体细胞高频突变（SHM），来追踪弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）复发过程中的克隆演化模式。

在本方案中，从成对的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）初诊与复发样本中扩增的免疫球蛋白重链（IgH）VDJ重排区域构建了具有加索引能力的高通量测序（NGS）文库。测序后每个样本平均获得超过五十万条VDJ序列，这些序列包含VDJ重排及体细胞超突变（SHM）信息。此外，开发了定制化的生物信息学分析流程，以充分利用序列信息对这些样本中的IgH-VDJ组库特征进行表征。该流程还可重建并比较个体肿瘤的克隆结构，从而分析初诊肿瘤内的克隆异质性，并推断初诊与复发肿瘤配对样本之间的克隆演化模式。将此分析应用于多对初诊-复发样本时，我们发现了关键证据，表明多种不同的肿瘤演化模式均可导致DLBCL复发。此外，该方法还可拓展至其他临床应用，如微小残留病灶的检测、复发进程与治疗反应的监测，以及非淋巴瘤背景下免疫组库的研究。

引言

癌症是一种克隆性疾病。自从30年前Peter C. Nowell提出癌症克隆进化模型1以来，许多研究致力于解析肿瘤样本中的克隆群体，并重建驱动肿瘤发生过程的克隆扩增与进化模式2。近年来，全基因组测序技术使研究人员能够深入探究克隆异质性及其进化过程3,4。然而，由于许多细胞类型缺乏可追踪的标记，推断精确的克隆结构和进化路径仍然困难。幸运的是，在成熟B细胞中存在一种天然的克隆性标记，而包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）在内的许多淋巴系统恶性肿瘤正是起源于此类细胞。在抗原刺激下，每个B细胞可通过从大量可变（VH）、多样性（D）和连接（JH）基因片段中各选择一个进行重排，形成唯一的功能性IgH VDJ序列。在此过程中，原始序列的部分区域可能被删除，同时可能插入非模板依赖的核苷酸，从而产生独特的VDJ重排。这种特异性的VDJ重排可在该B细胞的所有子代细胞中遗传，因而可标记单个成熟B细胞及其后代5。此外，在随后的生发中心（GC）反应中，体细胞高频突变（SHM）会作用于已重排的VDJ序列，引入额外突变，以扩大抗体库并增强抗体亲和力6。因此，通过比较和分析经历上述过程的淋巴瘤样本中的VDJ重排模式与SHM特征，可以描绘肿瘤内部的异质性，并推断疾病的克隆进化路径。

此前，VDJ重排和体细胞高频突变（SHM）的鉴定依赖于通过PCR扩增重排区....

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方案

1. VDJ 扩增

1.1）从肿瘤样本中提取DNA

  1. 从冷冻的O.C.T.包埋正常或恶性组织的薄切片（10–20 µm）中提取DNA。
    1. 在15 ml离心管中，将恒冷切片机切取的10–30片包埋组织薄切片加入4 ml核酸裂解缓冲液（0.0075 M Tris HCl，pH 8.2；0.3 M NaCl；0.002 M Na2EDTA），并加入蛋白酶K（终浓度0.5 mg/ml）和0.625% SDS，在37 °C水浴中过夜消化。
    2. 向消化液中加入1 ml饱和NaCl溶液（5 M），剧烈振荡15秒。
    3. 在室温下以1,100 × g离心15分钟。
    4. 将上清液转移至新的15 ml离心管中，加入两倍体积的100%乙醇。
    5. 通过反复倒置试管6–8次混匀，然后在4 °C下以5,000 × g离心60分钟，以收集沉淀的DNA。
    6. 用70%乙醇洗涤DNA沉淀两次，每次在室温下以5,000 × g离心15分钟，收集沉淀。
    7. 将DNA溶解于100–400 µl TE缓冲液中，在摇床上室温过夜。DNA得率为5至200 µg（终浓度为50–500 ng/µl），具体取决于组织大小。
  2. 从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的正常或恶性组织薄切片（10–20 µm）中提取DNA。....

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结果

VDJ测序（VDJ-seq）的整体流程，包括DNA提取、重排的VDJ区扩增与纯化、测序文库构建、读段处理以及系统发育分析，如图1所示。通常可从冷冻的实体组织切片中提取5–200 μg DNA，或从福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中提取0.5–20 μg DNA。根据各样本的质量、重排模式及体细胞高频突变（SHM）程度的不同，可获得来自不同样本的多种VDJ PCR产物（图2），包括IGVHFR1（310–380 bp）、FR2（250–295 bp）和FR3（70–120 bp）。若某样本经VDJ PCR仅能获得FR3片段，则因产物过短、无法为后续数据分析提供足够的序列信息而被排除于后续研究之外。仅当样本在琼脂糖凝胶上可观察到主要的FR1或FR2 PCR产物时，才继续用于构建测序文库。经凝胶纯化后，主要PCR产物的总得率范围为10至50 ng。

将全部纯化的PCR产物用于后续的测序文库构建。在接头连接后，每个样本获得其独特的索引序列。在文库扩增过程中，进行10个PCR循环，可产生超过30 ng的最终文库产物。文库质量通.......

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讨论

由于人类B细胞IGH基因座上通过VDJ重排和体细胞高频突变（SHM）编码的序列信息具有近乎无限的多样性，通过高通量深度测序来分析整个IGH组库已被证明是描绘克隆及亚克隆B细胞群体的一种高效且全面的方法。此外，通过比较在疾病不同阶段采集的患者样本中克隆和亚克隆结构，该策略还可用于研究B细胞肿瘤发生、缓解及复发过程中的克隆演化路径。尽管使用市售引物从原始样本DNA中扩增重排的VDJ序列在实验室条件下易于实现，但扩增效率在很大程度上依赖于样本DNA的质量。特别是，从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取的DNA扩增效率较低，通常只能成功扩增出较小的FR3片段，导致其不适合后续分析。由于本研究旨在了解B细胞淋巴瘤的克隆性——这是一种以一个或多个主要克隆重构整个肿瘤的克隆性疾病——我们仅收集并测序了主要的VDJ-PCR产物。对于希望对例如外周血中全部B细胞克隆群体进行系统分类的研究，可切取凝胶中包含多个VDJ-PCR产物（凝胶上呈现多条带或弥散条带）的更大区域进行测序。然而，需要特别指出的是，由于某些体细胞高频突变可能发生在引物结合区域，从而影响这些VDJ序列的扩增，因此无法完全捕获全部重排的IGH组库。此外，近期已推出一种将IGH重排扩增与.......

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披露

作者无任何利益冲突需披露。

致谢

作者谨感谢Rita Shaknovich博士以及Elemento实验室、Melnick实验室和Tam实验室成员的深入讨论。我们还要感谢威尔康奈尔医学院基因组资源核心设施完成VDJ测序工作。YJ获得了美国血液学会（ASH）学者奖的支持。WT和OE获得了威尔康奈尔癌症中心试点项目基金的支持。OE还获得了美国国家科学基金会（NSF）职业奖、斯塔癌症联合会以及希尔施尔信托基金的支持。我们还要感谢Katherine Benesch（法律博士，公共卫生硕士）对本项目的大力支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙醇VWR89125-170200 proof，分子生物学用
TE缓冲液Life Technologies12090-01510 mM Tris·Cl，pH 8.0；10 mM EDTA
二甲苯VWREM-XX0055-6500 ml
蛋白酶K Life Technonogies25530-015100 mg
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物PromegaU1515每种核苷酸10 mM
10x PCR缓冲液 Roche11699105001不含MgCl2
AmpliTaq Gold DNA聚合酶（含Gold缓冲液和MgCl2）Life Technonogies431180650 µl，5 U/µl
标本对照大小阶梯Invivoscribe Technologies 2-096-002033次反应
IGH体细胞高突变检测v2.0 - 凝胶检测法Invivoscribe Technologies 5-101-003033次反应，用于IGVHFR1检测的混合液2
IGH基因克隆性检测 - 凝胶检测法Invivoscribe Technologies 1-101-002033次反应，用于IGVHFR2检测的B管
GoTaq Flexi DNA聚合酶PromegaM829120 µl，5 U/µl
10X Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液Corning (cellgro)46-011-CM6x1 L
50x TAE缓冲液  VWR101414-2981 L
溴化乙锭溶液Sigma-AldrichE151010 mg/ml
25 bp DNA阶梯Life Technologies105970111 µg/µl
100 bp DNA阶梯Life Technologies15628-0191 µg/µl
UltraPure琼脂糖Life Technologies16500-500500 g
40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液Bio-Rad Laboratories1610144500 ml
QIAquick凝胶提取试剂盒Qiagen2870450个柱
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881
Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒Life TechnologiesQ32854
高灵敏度DNA试剂盒Agilent Technologies5067-4626
2100 BioanalyzerAgilent Technologies
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
MiSeqIllumina
Qubit 2.0荧光计Life TechnologiesQ32872
重悬缓冲液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
末端修复混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
A尾化混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
连接混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
DNA接头索引（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
终止连接缓冲液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
PCR引物混合物（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
PCR主混合液（Illumina TruSeq DNA样本制备试剂盒v2）IlluminaFC-121-2001
磁力架Life Technologies4457858
凝胶成像系统Bio-Rad Laboratories170-8370

参考文献

  1. Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al.

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VDJ DNA

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