本文所述方法提供了利用少量小鼠骨骼肌分离的线粒体进行基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。这些实验能够检测常用动物模型中线粒体氧消耗的机制性变化与适应性改变。
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摘要
摘要
骨骼肌线粒体在多种疾病的病理过程中发挥着特定作用。因此，以耗氧量作为该组织中线粒体功能的指标，其测量方法已日益普遍。尽管目前已存在多种用于测量不同细胞、组织和物种中线粒体呼吸通路的技术与检测方法，但针对从小鼠骨骼肌分离的线粒体、并适用于微孔板技术的检测方案，尚缺乏系统的文献总结。尤为重要的是，微孔板式呼吸测定技术正日益受到线粒体生物学家的青睐，因其能够在使用极少量分离线粒体的前提下实现高通量检测。因此，本研究建立了一系列基于微孔板的呼吸测定方法，可用于评估常用动物模型中耗氧量的机制性变化与适应性调节。本文所提供的方法详细阐述了实施这些检测的逐步操作流程，包括线粒体蛋白与试剂的最佳用量，以及各检测在整个动态范围内变异度极小所体现出的高精确度。
引言
骨骼肌线粒体的主要生理功能是通过氧化磷酸化产生ATP1重要的是，骨骼肌线粒体在运动能力中发挥着特定作用2, 衰老3，退行性疾病4 2型糖尿病5. 随着社会老龄化，以及2型糖尿病成为第7th 美国的主要死亡原因6，评估线粒体功能的方法在生物医学研究中的需求日益增加7,8具体而言，氧气消耗量的测定在评估线粒体功能方面具有特殊价值，因为它反映了线粒体基因组与细胞核基因组协同作用，以表达氧化磷酸化功能组分的能力。9.
目前已有多种技术可用于测量完整细胞和分离线粒体中的氧气消耗量7-10。此外，已开发出适用于多种细胞类型、组织以及不同物种的检测方法，可用于评估线粒体通路和呼吸控制9,11,12。然而，现有文献中尚缺乏针对从小鼠骨骼肌分离的线粒体，结合微孔板式氧气消耗检测技术所整合的全套检测方案。值得注意的是，微孔板式呼吸测定技术正日益被线粒体研究者所采用，该方法可在使用极少量分离线粒体的前提下实现高通量测量9。因此，本研究建立了一系列基于微孔板的呼吸测定方法，可精确定位电子传递链（ETC）中可能发生的异常或适应性变化位点。此外，还开发了另外两种基于微孔板的呼吸测定方法，用于评估三羧酸（TCA）循环与ETC之间，以及β-氧化与ETC之间的协同关系。重要的是，所提出的方法为在常用动物模型中测量线粒体功能的机制性变化提供了清晰而简洁的途径。
方案
注意：本实验方案从已分离自红骨骼肌的线粒体开始。线粒体的分离方法如前所述，取约 75 - 100 mg 红骨骼肌组织进行分离13。将最终的线粒体沉淀重悬于 ≤50 µl 的线粒体分离缓冲液（IBM）2 中，可从此量组织中获得 5 - 10 µg/µl 的线粒体蛋白（参见 Frisard et al13）。
1. 设置
- 配制工作储备液（表1）和线粒体检测液（MAS）混合液（表2），用于后续检测。
注意：大多数检测前的准备工作可提前完成，因为大多数储备液和MAS均可储存。 - 实验前一晚，在非CO2培养箱中，将呼吸测定仪检测板置于1 ml校准液中，于37 °C水化。
- 实验当天，取出冷冻保存的储备液（底物和线粒体调节剂、MAS混合液、不含BSA的MAS，表1），在37 °C水浴或培养箱中解冻。
- 配制所有底物溶液（表3）和注射液（表4-5），并根据需要调节pH值（pH 7.4）。调节pH后，置于冰上保存。
- 设置多功能微孔氧消耗检测仪的混匀、等待和检测参数（见表6），首先进入分析软件，然后选择“Standard”模式，对背景孔和分组/条件孔进行标记。
- 进入“Guest”界面，点击“Assay Wizard”。进入“Assay Wizard”后，点击“Protocol”以修改混匀、等待和检测参数。在“Back. Correction”标签下标记背景孔，并确保勾选“Do background correction”。
- 首先点击“Groups & Labels”标签，再点击“Group Info”标签，对各条件进行分组标记。输入上述参数后，点击“End”，然后点击“Save Template”。
2. 检测运行
- 将注射溶液加载至检测运行 cartridge 中，然后启动校准：首先进入分析软件，选择“Standard”模式。进入“Guest”界面，在“XF”驱动器下的“Templates”选项卡中打开步骤1.5保存的模板。模板打开后，点击“Start”开始校准。
注意：将检测运行卡插入仪器时，应使有缺口的角落位于左下角。此过程大约需要30分钟。注射溶液时务必注入正确的端口。注射位置在 表4-5 按上样顺序列出。 - 使用200 µl移液枪头轻轻搅拌线粒体储备液以充分混匀，随后用剪刀将另一支200 µl移液枪头末端剪去约3 mm以扩大其孔径，再用该枪头轻轻吹打混匀储备液。
- 采用二辛可宁酸（BCA）法测定线粒体储备液的蛋白浓度。
- 根据步骤 2.3 获得的储备浓度，将 10 µg 线粒体蛋白重悬于 200 µl 琥珀酸/鱼藤酮底物混合液中（表3). 将14 µg线粒体蛋白重悬于200 µl剩余的底物混合液中（此步骤必须对每个样本分别进行 每个 底物混合物) (表3)。将所有线粒体蛋白/底物混合物置于冰上。
注意：每孔测定所需的线粒体蛋白最适用量按先前所述方法确定9确定丙酮酸/苹果酸、棕榈酰肉碱/苹果酸、谷氨酸/苹果酸及电子传递链活性检测每孔使用3.5 µg线粒体蛋白，而琥珀酸/鱼藤酮检测每孔使用2.5 µg线粒体蛋白。因此，研究者在此步骤中需重悬足量的线粒体蛋白以满足4个复孔的需要，因为每孔上样量为50 µl，其中含2.5 µg或3.5 µg线粒体蛋白（见步骤2.6）。 - 用200 µl移液枪头轻轻搅拌线粒体/底物溶液，使其充分混匀，随后使用剪去末端约3 mm的200 µl移液枪头轻轻吹打混悬原液。
- 将细胞培养板置于冰上，每种线粒体/底物混合物以每孔50 µl的体积设三个复孔加入。基于微孔板的呼吸测定法开发者建议至少设置两个空白孔（不加线粒体），最好位于细胞培养板的两侧。
- 在 4 °C 条件下，以 2,000 g 离心细胞培养板 20 分钟。离心期间，将底物溶液置于 37 °C 水浴中预热。
- 离心结束后，小心地将每种底物溶液各450 µl加至对应孔的上层（即将丙酮酸/苹果酸底物加入最初用该底物溶液重悬线粒体的孔中。确保在室温下加样。注意：空白孔应加入500 µl底物。用于电子流测定的空白孔需加入电子流底物（丙酮酸/苹果酸 + FCCP），而用于偶联测定的空白孔可加入任意一种偶联测定底物。
注意：若在同一批次的微孔板上同时进行偶联测定和电子传递测定，研究人员必须在测定运行结束后，通过“XF Reader”平台的“Instrument”选项卡，为各自的测定重新指定背景孔。进入“Instrument”设置后，点击“Administration”选项卡，随后选择“Background Correction”。完成操作后，点击“End Instrument Setup Mode”。这是因为抗坏血酸/TMPD组合可能消耗O₂2因此，每种检测类型都需要单独进行背景校正。 - 在向每个孔中加入 450 µl 底物后，观察孔中线粒体层，确保线粒体均匀分散成单层（20X 放大倍数 [参见 Rogers9, 图 4）。不呈现均匀单层分布的孔可予以剔除 事后检验.
- 在检查线粒体是否已贴附后，将微孔板插入呼吸测定仪中，并单击“OK”开始检测运行。
注意：必须完成2.1步骤中的校准，运行才会开始。一旦研究人员点击“OK”，仪器将弹出用于校准的工具板。- 取下工具板，将含有线粒体的细胞培养板放入托盘中，细胞培养板上的蓝色缺口应置于托盘的左下角。点击“继续”以开始检测运行。
- 运行结束后，按屏幕上的“Eject”按钮弹出细胞培养板和 cartridge。
- 平板弹出后，取下并丢弃细胞培养板和盒式卡匣，然后在屏幕上点击“Continue”。运行结果将自动保存为“Data”文件夹中的 .xls 文件。
- 打开此文件，通过点击“Y1:”标记下方的向下箭头，将显示内容从“O2”更改为“OCR”。
- 接下来，在“显示速率数据为：”选项下，将“中点”更改为“点对点速率”。单击“确定”以应用这些更改。
- 单击屏幕左下角的“孔分组模式”标签，将条件相似的孔进行分组。最后，单击屏幕中偏左位置的“样本均值/标准误”标签。或者，这些设置也可在实验开始前通过“实验向导”设置中完成。
注：每种条件下，每种速率的测量值将以均值 ± 标准差的形式表示。每种条件均进行多次速率测量 （偶联状态2[偶联]/电子传递状态3u，随后进行四次注射）。采用第二次测量的偶联状态2速率的平均值，以寡霉素注射后达到的最低点确定偶联状态4o，以ADP和FCCP注射后达到的最高点分别确定状态3和状态3u，以抗霉素A诱导呼吸的最低点用于偶联检测。以丙酮酸/苹果酸诱导的状态3u呼吸的最高点、鱼藤酮诱导呼吸的最低点、琥珀酸诱导的状态3u呼吸的最高点，以及抗霉素A诱导呼吸的最低点，用于电子传递检测。所有实验均重复3次，图示数据为一次代表性实验结果 示踪。
结果
图1展示了丙酮酸/苹果酸、琥珀酸/鱼藤酮、棕榈酰肉碱/苹果酸以及谷氨酸/苹果酸检测（偶联检测）中的氧消耗速率（OCR）。这些检测曲线以氧消耗速率（OCR）随时间变化的形式呈现，已进行背景校正，并以逐点速率显示。每个图示代表线粒体在Chance和Williams14所描述的不同状态下的氧消耗情况。第一个图示代表基础氧消耗，即状态2。第二个图示在加入ADP后，代表最大偶联呼吸，即状态3。第三个图示在加入寡霉素A（复合体V抑制剂）后，代表由质子漏引起的呼吸，即状态4o。第四个图示在加入FCCP后，代表最大非偶联呼吸，即状态3u。最后，第五个图示在加入抗霉素A后，代表氧化呼吸的抑制。值得注意的是，所有线粒体状态的标准差均极小。这归因于线粒体储备液及线粒体/底物混合液的充分混匀，以及在贴壁离心步骤（步骤2.6）后形成了单层线粒体。相反，若每个孔中加入的线粒体数量不均，或未能在微孔板孔内形成单层线粒体，则会导致各状态的标准差增大，如图2所示。
图1中的曲线显示了每种线粒体状态和每种底物的稳定平台期。经过两次测量循环后达到的稳定平台表明线粒体质量良好，并且在整个实验过程中线粒体始终保持附着在孔板上。此外，获得稳定的最大速率可能更为理想，因为这允许研究者对这些线粒体状态下的氧消耗率（OCR）取平均值，从而减少因任意选择时间点而可能产生的偏差。
每孔线粒体数量通过优化实验确定。每孔最佳线粒体用量应使状态2呼吸速率达到100–200 pmol/min/well，状态3呼吸速率 < 1,500 pmol/min/孔，因为这些值处于多孔板式耗氧量检测仪的动态氧传感范围内。每孔加入过多的线粒体蛋白可能导致耗氧率超出仪器的动态检测范围图3A). 图3 显示上样 3.5 µg 每孔线粒体蛋白量（蓝色轨迹）与上样量的比较 2.5 µg 每孔线粒体蛋白质量（红色轨迹）用于琥珀酸/鱼藤酮检测。每孔加入过多的线粒体蛋白可能导致微孔腔内氧气耗尽，从而影响后续每次测量的氧消耗率（OCR）的准确测定9 (图3B）。点对点OCR是OCR的瞬时变化率。若呈平坦状态，则OCR稳定；若呈下降趋势，则可能存在生物学或技术性问题。在3态和3u态呼吸中OCR的急剧下降（图3A）是由于线粒体在测量结束前耗尽了氧气供应所致（图3B).
图4 显示了电子传递测定中氧耗率（OCR）随时间的变化。该曲线的校正与展示方式如图1所述。本测定中的第一个阶段代表通过复合物I利用丙酮酸/苹果酸进行的State 3u呼吸。第二个阶段在加入鱼藤酮后，代表复合物I介导的呼吸被抑制。第三个阶段在加入琥珀酸后，代表底物刺激下的State 3u呼吸，此时电子通过复合物II进入电子传递链（复合物II介导的呼吸）。第四个阶段在加入抗霉素A后，代表复合物III被抑制，从而反映总呼吸被抑制的状态。最后，第五个阶段在加入抗坏血酸/TMPD后，代表复合物IV介导的呼吸。与图1中的曲线类似，所有线粒体状态的呼吸率标准差均极小，且各速率均已达到或接近稳态平台期。
图 1. 耦联呼吸测定。(A) 10 mM 丙酮酸盐/5 mM 苹果酸盐，(B) 10 mM 琥珀酸盐/2 µM 鱼藤酮，(C) 40 µM 棕榈酰肉碱/1 mM 苹果酸盐，以及 (D) 10 mM 谷氨酸盐/10 mM 苹果酸盐条件下的线粒体耦联呼吸测定曲线，通过多孔板氧气消耗检测获得。数据以均值 ± 标准差表示。除琥珀酸盐/鱼藤酮组每孔使用 2.5 µg 线粒体蛋白外，其余各组每孔均加载 3.5 µg 线粒体蛋白。数据来自 n=3 组配对的生物学重复实验。OCR = 耗氧率；ADP = 二磷酸腺苷；Oligo = 寡霉素 A；FCCP = 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；Anti-A = 抗霉素 A；PYR = 丙酮酸盐；SUCC = 琥珀酸盐；ROT = 鱼藤酮；PAL-C = 棕榈酰肉碱；GLUT = 谷氨酸盐。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2. 丙酮酸/苹果酸检测结果高度变异。 使用10 mM丙酮酸和5 mM苹果酸进行检测时结果高度变异，原因是线粒体储存液与底物/MAS混合液混合不充分，导致每孔中线粒体蛋白加样量不一致。每孔加入的线粒体蛋白量为3.5 µg。数据来自n=3的配对生物学重复实验。OCR=氧消耗速率；ADP=二磷酸腺苷；Oligo=寡霉素A；FCCP=羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙；Anti-A=抗霉素A；PYR=丙酮酸。请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 琥珀酸/鱼藤酮检测中线粒体蛋白过载。（A） 每孔加入3.5 µg线粒体蛋白（蓝色曲线）导致氧消耗率超出多功能微孔板氧消耗测量仪的动态范围，相比之下，每孔加入2.5 µg线粒体蛋白（红色曲线）则处于正常范围。（B） 每孔加入过量线粒体蛋白（3.5 µg）后，在ADP和FCCP注射后氧张力接近零（蓝色曲线），而每孔加入适量线粒体蛋白（2.5 µg）时氧张力保持在合理水平（红色曲线）。数据代表每种线粒体蛋白用量下n = 3对生物学重复样本。OCR = 氧消耗率；ADP = 二磷酸腺苷；Oligo = 寡霉素A；FCCP = 羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙；Anti-A = 抗霉素A；SUCC = 琥珀酸；ROT = 鱼藤酮；O2 = 氧气；mm Hg = 毫米汞柱。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4. 电子流测定。 5 mM 丙酮酸盐/1 mM 苹果酸盐 + 4 µM FCCP，通过多孔板氧气消耗量测定所获得的线粒体呼吸电子流轨迹。数据以均值 ± 标准差表示。每孔加载的线粒体蛋白为 3.5 µg。数据代表 n=3 对应的生物学重复实验。OCR = 氧气消耗率；Anti-A = 抗霉素 A；Asc = 抗坏血酸；TMPD = N,N,N′,N′-四甲基-p-苯二胺。请点击此处查看该图的放大版本。
| 试剂 | 储存浓度 | 分子量 | 终体积 | 添加质量 | 备注/描述 |
| (M) | (g/mol) | (ml) | (g 或 ml) | ||
| EGTA, pH 7.2 | 0.1 | 380.35 | 100 ml of 1M Tris Base | 3.801 g | 4 °C 保存 |
| HEPES | 1 | 238.3 | 250 ml of DiH2O | 59. 57 g | 4 °C 保存 |
| MgCl2, hexahydrate | 1 | 203.31 | 250 ml of DiH2O | 50.82 g | 4 °C 保存 |
| 丙酮酸, pH 7.4 | 0.1 | 88.06 (以 14.11 M 溶液形式提供) | 40 ml of DiH2O | 0.283 ml 丙酮酸 | 分装为 1 ml 份量，-20 °C 保存，每两周新鲜配制一次 |
| 琥珀酸, pH 7.4 | 0.5 | 118.09 | 100 ml of DiH2O | 9.4 g 琥珀酸 | 分装为 1 ml 份量，-20 °C 保存 |
| 苹果酸, pH 7.4 | 0.5 | 134.09 | 100 ml of 95% Ethanol | 6.7 g 苹果酸 | 分装为 200 μl 份量，-20 °C 保存 |
| TMPD | 0.01 | 164.25 | 10 ml | 0.0164 g | 分装为 300 μl 份量，-20 °C 保存；与等摩尔量的抗坏血酸混合以维持 TMPD 的还原状态 |
| 棕榈酰-L-肉碱氯化物 | 0.01 | 436.07 | 1.14 ml of 95% Ethanol | 0.005 g | 分装为 40 μl 份量，-20 °C 保存 |
| 寡霉素 A | 0.006 | 791.06 | 0.987 ml of 95% Ethanol | 0.005 g | 分装为 20 μl 份量，-20 °C 保存 |
| FCCP | 0.01 | 254.17 | 3.9 ml of 95% Ethanol | 0.01 g | 分装为 40 μl 份量，-20 °C 保存 |
| 鱼藤酮 | 0.001 | 394.4 | 10 ml of 95% Ethanol | 0.0039 g | -20 °C 保存 |
| 抗霉素 A | 0.005 | 548.63 | 9.12 ml of 95% Ethanol | 0.025 g | -20 °C 保存 |
| K+ ADP | 0.5 | 501.32 | 3.9 ml of DiH2O | 1.0 g | -20 °C 保存 |
| 苹果酸, pH 7.4 | 0.5 | 134.09 | 40 ml | 2.68 g | 分装为 200 μl 份量，-20 °C 保存 |
表1. 储备溶液
| 试剂 | 储存浓度 | 添加质量 | 终浓度/百分比 |
| (M) | (g 或 ml) | ||
| Sucrose | -- | 11.98 g | 70 mM |
| Mannitol | -- | 20.04 g | 220 mM |
| 磷酸二氢钾 | -- | 0.34 g | 5 mM |
| MgCl2, hexahydrate | 1 | 2.5 ml | 5 mM |
| HEPES | 1 | 1.0 ml | 2 mM |
| EGTA | 0.1 | 5.0 ml | 1 mM |
| 基本无脂肪酸-BSA | -- | 1.0 g | 0.20% |
表2. MAS缓冲液配方。 pH 7.4，500 ml：分装成25 ml每份，于-20 ºC保存。*注意：用于上样注射的MAS缓冲液中不添加BSA。
| 底物培养基 | 终浓度 | 母液添加量 (µl) | MAS* 添加量 (ml) |
| 丙酮酸/苹果酸 | 10 mM/5 mM | 丙酮酸：1,000 | 9 |
| 苹果酸：100 | |||
| 琥珀酸/鱼藤酮 | 10 mM/2 µM | 琥珀酸：200 | 10 |
| 鱼藤酮：20 | |||
| *丙酮酸/苹果酸 + FCCP | 5 mM/1 mM/4 µM | 丙酮酸：500 | 10 |
| FCCP：4 | |||
| 苹果酸：20 | |||
| 棕榈酰左旋肉碱/苹果酸 | 40 µM/1 mM | 棕榈酰肉碱：40 苹果酸：20 | 10 |
| 谷氨酸/苹果酸 | 10 mM/10 mM | 谷氨酸：400 | 10 |
| 苹果酸：200 |
表3. 底物溶液 pH 7.4：在实验当天新鲜配制。*电子传递测定用溶液。
| 注射介质 | 浓度 | 储存液用量 (µl) | MAS 用量 (ml) | 注入 cartridge 的体积 | 最终浓度 |
| （注入培养板后） | |||||
| ADP | 50 mM | 300 µl | 3 | 50 µl | 5.0 mM |
| Oligomycin A | 20 µM | 10 µl | 3 | 55 µl | 2.0 µM |
| FCCP | 40 µM | 12 µl | 3 | 60 µl | 4.0 µM |
| Antimycin A | 40 µM | 24 µl | 3 | 65 µl | 4.0 µM |
表4. 耦合测定中的注射试剂。 pH 7.4：需在实验当天新鲜配制。*耦合测定包括（但不限于）丙酮酸/苹果酸、琥珀酸/鱼藤酮、棕榈酰肉碱/苹果酸以及谷氨酸/苹果酸。
| 注射介质 | 浓度 | 储备液体积（g 或 µl） | MAS 体积（ml） | 注入 cartridge 的体积 | 最终浓度（注入培养板后） |
| Rotenone | 20 µM | 60 µl | 3 | 50 µl | 2.0 µM |
| Succinate | 50 mM | 300 µl | 3 | 55 µl | 5.0 mM |
| Antimycin A | 40 µM | 24 µl | 3 | 60 µl | 4.0 µM |
| TMPD/Ascorbate | 1 mM, 100 mM | TMPD : 300 µl | 3 | 65 µl | 100 µM, 10 mM |
| Ascorbate: 0.059 g |
表5. 电子传递测定中的注射液。 pH 7.4：需在实验当天新鲜配制
| 指令 | 时间（分钟） | 循环次数 |
| 校准 | ||
| 等待 | 10 分钟（使微孔板从黏附步骤中恢复至室温） | |
| 混匀 | 1 分钟 | 2 |
| 检测 | 2 分钟 | |
| 注入 A | ||
| 混匀 | 1 分钟 | 2 |
| 检测 | 2 分钟 | |
| 注入 B | ||
| 混匀 | 1 分钟 | 2 |
| 检测 | 2 分钟 | |
| 注入 C | ||
| 混匀 | 1 分钟 | 2 |
| 检测 | 2 分钟 | |
| 注入 D | ||
| 混匀 | 1 分钟 | 2 |
| 检测 | 2 分钟 |
表6. 仪器运行程序。
讨论
本文介绍的方法提供了使用从小鼠骨骼肌（75 - 100 mg）中分离的线粒体进行一系列基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。这些呼吸测定实验具有高度精确性，三复孔之间的标准差极小即可证明这一点。重要的是，在这种常用动物模型中，这些呼吸测定实验能够精确定位电子传递链（ETC）、三羧酸循环（TCA循环）、β-氧化途径、底物转运蛋白等过程中可能发生的异常或适应性变化的位置。
有必要强调本方案中所用各种底物和抑制剂的选择依据。丙酮酸/苹果酸和谷氨酸/苹果酸呼吸测定法可用于评估由复合物I介导的呼吸作用，同时可评估各自底物转运体的功能，对于谷氨酸而言，还可评估其脱氨酶活性15。另一种方法是使用琥珀酸/鱼藤酮组合，通过抑制电子传递链（ETC）中的复合物I，并由琥珀酸通过还原黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）向复合物II提供电子，从而评估线粒体经由复合物II的呼吸通量15。这些测定可提供有关偶联效率和最大呼吸能力的底物特异性信息。电子流测定法的独特之处在于，通过底物与抑制剂的组合，可在一次实验中同时评估电子传递链中多个复合物的呼吸通量9。初始加入丙酮酸/苹果酸并辅以FCCP，可评估由复合物I驱动的最大呼吸；随后依次注入鱼藤酮和琥珀酸，可评估由复合物II驱动的最大呼吸。接着注入复合物III抑制剂抗霉素A，再加入抗坏血酸/TMPD，可评估由细胞色素C/复合物IV驱动的呼吸，因为抗坏血酸/TMPD可作为向细胞色素C/复合物IV传递电子的供体。尽管该方法无法提供偶联效率的信息，但特别适用于样本量极小、无法独立进行多种底物测试的情况。最后，使用棕榈酰肉碱/苹果酸组合可评估β-氧化与电子传递链之间的协调性，因为棕榈酸氧化（即β-氧化）过程中产生的还原当量通过电子转移黄素蛋白进入电子传递链15。需要注意的是，偶联测定与电子流测定也可联合使用，以识别某些干预措施（如药物处理或基因操作）所引起的线粒体功能变化。
这些检测所达到的高精密度主要归因于线粒体的充分混匀，无论是在进行蛋白质测定之前，还是与底物溶液混合时。因此，一旦将线粒体重悬于底物溶液中，按照步骤2.2所述，使用扩口移液器吸头在将溶液加入细胞培养板之前必须彻底混匀。若未能充分混匀线粒体，将导致检测结果出现较大变异。此外，使用窄口移液器吸头在混匀线粒体时会产生剪切力，增加损伤线粒体膜并释放细胞色素C的风险。黏附步骤（2.7）也是本实验方案中的关键步骤。若加载后的细胞培养板离心时间不足或转速不够，将导致线粒体未能充分黏附于孔底，从而引起孔间及测量值之间的变异性增加。
本方案经过优化，包括：每孔加载适量的线粒体蛋白，使用正确的浓度和制备方法配制储备液和底物溶液，调整检测运行参数以确保线粒体状态达到平台期，以及在加载前充分混匀线粒体储备液与线粒体/底物混合液。在完成这些优化之前，作者在实验过程中曾遇到若干问题。以下将讨论有助于优化本方案的故障排查方法和修改措施。关于最佳加载量，每孔加载的线粒体过少将无法产生明显的反应信号，而过多则会耗尽微室中的氧气，导致测量结果不准确。Rogers et al9 提供了 针对基于微孔板的呼吸测定实验中每孔线粒体最佳加载量的确定示例。通常情况下，每孔加载的线粒体过多表现为状态2（state 2）速率超过100–200 pmol/min/well，状态3（state 3）速率>1500 pmol/min/well。若出现过量加载，应开展实验，尝试不同浓度的线粒体蛋白（例如，1–10 μg），以获得处于氧耗量检测仪器动态范围内的OCR值。正确配制和使用底物及储备液的浓度至关重要。底物或注射液应始终使用酸性形式，并用氢氧化钾或盐酸调节pH值；不建议使用含钠的缓冲液或溶液。此外，若将底物或储备液溶于DMSO或100%乙醇，将导致测量失败或误差。请务必在需要时使用95%乙醇。棕榈酰肉碱在冻存储备液解冻后常会从95%乙醇中析出沉淀，从而引起较大变异性。因此，使用前应将棕榈酰肉碱储备液充分温育并涡旋混匀。此外，丙酮酸/苹果酸检测结果若变异性较高，可能是因为丙酮酸储备液存放时间超过>2周。建议每2周重新制备一次丙酮酸的冷冻分装储备液。本实验的检测运行已调整为每步2分钟的测量时长，以确保线粒体状态达到平台期。若需观察ADP耗尽过程，研究人员可在“检测向导”（Assay Wizard）界面下的“方案”（Protocol）标签中延长测量时间。最后，若线粒体储备液与线粒体加底物溶液在加载前未充分混匀，会导致较大的实验变异性。若检测运行后各孔间数据变异性较高，请确保在下次实验前将底物溶液彻底混匀。切勿涡旋震荡线粒体/底物混合液，而应通过搅拌、轻柔研磨或使用扩口移液枪头进行温和吹打混匀。
该技术存在一些值得注意的局限性。首先，用于这些检测的细胞培养板上的孔数相对较少（即，24 孔，且至少预留 2 孔作为空白对照孔）。若希望在同一块板上同时进行全部 5 种检测，则研究者一次仅能检测一只小鼠的反应。但需注意，已有 96 孔仪器可用于更高通量的检测。其次，与在完整细胞中相比，对分离线粒体进行线粒体功能障碍评估具有其固有的优势与局限性1一些缺点包括与完整细胞相比生理相关性较低，以及分离过程可能引发的人工假象。最后，该方法的成功取决于线粒体分离过程的质量。
尽管其中一些检测方法已在不同系统中开发或在其他动物模型中得到验证，但本文所述方法首次综合了上述所有检测，以优化在多孔氧气消耗测量仪中使用小鼠骨骼肌进行实验。重要的是，这5种检测均可仅使用从约75–100 mg小鼠骨骼肌中分离出的线粒体量来完成，从而实现了高通量且所需材料极少。尤为关键的是，多孔氧气消耗技术能够在使用极少量线粒体的情况下进行检测，结合优化的分离方法，使研究者可利用剩余的骨骼肌组织开展多种其他实验（例如，Western blot、RT-PCR、酶学检测等），而这一点在该动物模型中通常难以实现。
综上所述，本文介绍的方法提供了使用少量小鼠骨骼肌进行一系列基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。重要的是，这些方法对组织和线粒体的用量要求极低。一旦掌握，研究人员即可利用这些技术，在常用动物模型中确定某种化合物或基因产物对线粒体耗氧量的潜在作用机制。
披露
George W. Rogers 是 Seahorse Bioscience 的员工，该公司生产了开发这些检测方法所用的仪器。开放获取费用由 Seahorse Bioscience（安捷伦科技公司旗下企业）提供。
致谢
弗拉林生命科学研究所以及弗吉尼亚理工学院的代谢表型分析核心实验室为本研究提供了支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S7903 | 室温保存 |
| D-甘露醇 | Sigma Aldrich | 63559 | 室温保存 |
| 磷酸二氢钾，纯度≥99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | 室温保存 |
| 六水合氯化镁，ACS级试剂，纯度99.0–102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | 室温保存 |
| HEPES，滴定法测定纯度≥99.5% | Sigma Aldrich | H3375 | 室温保存 |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | 室温保存 |
| 基本无脂肪 | Sigma Aldrich | A6003 | 4 °C保存 |
| 无脂肪酸-BSA | |||
| 丙酮酸，纯度98% | Sigma Aldrich | 107360 | 4 °C保存 |
| 琥珀酸 | Sigma Aldrich | S9512 | 室温保存 |
| L(-)苹果酸，BioXtra，≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | 室温保存 |
| L-谷氨酸 | Sigma Aldrich | G1251 | 室温保存 |
| N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺 | Sigma Aldrich | T7394 | 室温保存 |
| 纯度≥99%，粉末 [TMPD] | |||
| 棕榈酰-L-肉碱氯化物 | Sigma Aldrich | P1645 | -20 °C保存 |
| 寡霉素A，≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | -20 °C保存 |
| 羰基氰-4-(三氟甲氧基) | Sigma Aldrich | C2920 | 2–8 °C保存 |
| 苯腙 | |||
| ≥98% (TLC)，粉末 [FCCP] | |||
| 链霉菌来源抗霉素A | Sigma Aldrich | A8674 | -20 °C保存 |
| 腺苷5′-二磷酸单钾盐二水合物 [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | -20 °C保存 |
| 鱼藤酮 | Sigma Aldrich | R8875 | 室温保存 |
| Pierce™ BCA蛋白质定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | 不适用 |
参考文献
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