研究微生物群落在体内:主机之间介互动的典范白色念珠菌和铜绿假单胞菌在航空

摘要

虽然宿主-病原体相互作用的体外研究允许表征特异性免疫反应，但需要体内模型来观察复杂反应的影响。使用白色念珠菌暴露和铜绿假单胞菌介导的肺部感染，我们建立了参与呼吸机相关肺炎致病性的微生物相互作用的小鼠模型。

摘要

研究宿主 - 病原体相互作用使我们能够理解的致病性的基本机制微生物感染时。的主机的预后取决于抗病原菌¹的适于免疫应答的参与。免疫反应是复杂的，结果从的病原体和几个免疫或非免疫细胞类型²的相互作用。 体外研究不能表征这些相互作用并集中于细胞-病原体相互作用。此外，在气道^3中，特别是在患者的化脓性慢性肺疾病或机械通气患者中，多种微生物群落是本和复杂化宿主-病原体的相互作用。 绿脓杆菌 和白色念珠菌都问题病原体^4，从气管样品经常分离，并相关的严重感染，尤其是在重症监护病房^5。微生物相互作用这些病原体之间被报道在体外但是这些相互作用的临床影响仍不清楚^6。研究℃。白色念珠菌和P之间的相互作用假单胞菌，C 的鼠模型白色念珠菌呼吸道定植，随后是P.进行aeruginosa-介导的急性肺部感染。

引言

动物模型，特别是小鼠，已被广泛用来研究对病原体的免疫应答。虽然啮齿动物和人^7之间先天和获得性免疫不同，容易在育种和击倒的发展，为众多的基因，使小鼠极好模型来研究免疫应答^8。免疫反应是复杂的，来自病原体的相互作用的结果，驻地微生物菌群和多种免疫（淋巴细胞，中性粒细胞，巨噬细胞）和非免疫（上皮细胞，内皮细胞）的细胞类型^2。 体外研究不允许观察这些复杂的相互作用，并主要集中在唯一的小区 - 病原体相互作用。而动物模型必须谨慎使用，并仅限于非常具体和相关问题，小鼠模型提供了良好的洞察体内的哺乳动物的免疫反应，并且可以解决重要的临床问题^，7份 。

在气道的微生物群落是复杂的关联有大量不同的微生物^6。而什么构成一个"正常"的气道微生物组仍有待确定，居民社区经常多种微生物，并从不同的生态源产生。化脓性慢性肺疾病（囊性纤维化，bronchectasis）的患者或机械通气患者由环境获得微生物⁹显示出一个特定的菌群，由于气道的定植。 绿脓杆菌 和白色念珠菌都是问题病原体^5，经常分离一起从气管样品，和负责在这些患者严重的机会感染，特别是在重症监护病房^{（ICU）4。}

这些微生物的急性肺炎在ICU的结果对铜绿抗微生物治疗期间隔离铜绿 bUT酵母通常不会在这个网站⁵考虑致病。P.之间的体外相互作用铜绿假单胞菌和C.白色念珠菌得到了广泛的报道，并表明，这些微生物可以影响生长和彼此的生存但研究不能断定，如果C的存在下白色念珠菌是有害还是有益的^主机 10。小鼠模型被开发来解决这个P的相关性铜绿假单胞菌和C. 白色念珠菌在 体内 ，但微生物之间的相互作用不是重点。事实上，建立模型以评价C的参与白色念珠菌在宿主免疫应答，和结果。

通过Roux等建立了以前的模式已经使用初始定植C.白色念珠菌其次是一种急性肺部感染诱发P.铜绿假单胞菌，利用他们的模型中，作者发现P的有害作用rior C.白色念珠菌定植^11。然而Roux等使用℃的高负荷期间连续3天白色念珠菌在其用^2×10 6 CFU /小鼠模型。我们建立了C的 4天模式白色念珠菌呼吸道定植，或至少没有持续性肺损伤，在这个模型C.白色念珠菌被检索长达4天的每只小鼠（图^{2B）12,13 10} 5 CFU单个滴注后。 4天后，没有观察到证据炎性细胞募集，炎症性细胞因子的产生，也没有上皮损伤。在24 - 48小时在C的峰值出现白色念珠菌 ，即使在蜂窝和细胞因子的先天免疫反应，观察，没有任何证据表明肺损伤。出人意料的是，这样的小鼠定植C.白色念珠菌 48小时前鼻内P的滴注绿脓杆菌已经减弱感染相比，小鼠P.绿脓杆菌感染孤单。一世ndeed，小鼠表现出较少的肺损伤和减少细菌负荷^12,13。

有几个假说可以解释前定植C.这种有益作用白色念珠菌的P.铜绿假单胞菌介导的急性肺部感染。首先，将种间串扰涉及每个微生物群体感应系统，所述homoserinelactone基P.假单胞菌系统和金合欢醇系C.白色念珠菌系统，进行了评价。其次，C。白色念珠菌作为"诱饵"目标绿脓杆菌转向从肺上皮细胞中的病原体进行了研究。这两种假设都无效（未公布数据）。第三假设是一个由C"启动"先天免疫系统的白色念珠菌负责对铜绿增强后续的先天响应铜绿假单胞菌 。这最后一种假设得到证实。事实上C.白色念珠菌定植导致先天免疫的启动THROUGH，IL-22，主要由分泌的先天淋巴样细胞，导致增加细菌的间隙并减小肺损伤^12。

最后，该宿主是微生物调节先天免疫反应和涉及不同炎性细胞类型之间的相互作用的中心角色。虽然这些复杂的免疫相互作用可以在体外被解剖的初始假设只能通过适当的体内模型提供。以下协议提供的体内研究宿主介导的病原体相互作用的可适于其他微生物的一个例子。

方案

动物实验的区域伦理区域委员会已经批准了这个方法，按照在研究性研究指导原则与各国和国际动物护理和使用。

1.样品采集

1. 样品存储
   1. 收集所有的样品，并立即在存放 - 20℃或在冰上直到冷冻储存以避免恶化。置于冰上的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS），以改善支气管肺泡灌洗（BAL）的性能。
2. 手术
   1. 灭菌用高压灭菌器的所有手术设备。
      注意:如果可能，建议使用两套不同仪器对于腹部和胸部的步骤，以避免交叉污染。需要解剖设备在图4A中详述

2.鼠标，细菌和酵母菌株

1. 家鼠符合在当地再利用动物在通风机架遴选委员会的指导方针不超过5只小鼠笼子，食物和水即兴 ，在生物安全2级的住房设施，由于使用生物安全2级微生物:P。铜绿假单胞菌和C.白色念珠菌。
2. 保持细菌菌株在-80℃下在40％甘油中。
   1. 直接从冷冻股票添加到细菌含有使用10微升接种圈3毫升无菌卢里亚BERTANI肉汤培养管。离开O / N在37℃轨道振荡（400转）滴注的前一天。
   2. 收获细菌离心2000×g离心5分钟。
   3. 吸出上清液到一个合适的封闭的生物危险废物处置。观察白色沉淀粘附在培养管中的底部。
   4. 洗净并暂停用5毫升的PBS的沉淀。
   5. 重复步骤2.2.2至2.2.3第二次进行第二次洗涤。
   6. 悬浮用1ml的PBS的沉淀的细菌和短暂的震荡。
   7. 使用光学密度计在600nm处使用光学密度计确定接种密度。 0.9的密度相当于10 ⁹ CFU /毫升PAO1，淡化相应。
      注意:这个结果对于每个使用的菌株通过确定一个校准接种物的连续稀释液的密度来获得。
   8. 验证接种通过连续对数稀释和板100微升每个稀释度的溴甲酚紫琼脂（BCP）板和O / N培养。管理每个小鼠经鼻内将50μl含^1×10 8到2×10 ⁸ CFU每毫升（5×10 ⁶到1×10 ⁷每鼠CFU）的溶液中。
3. 使用C.白色念珠菌 SC5314作为参考压力。保存在40％的甘油培养基中的菌株在-80℃下。
   1. 补充酵母蛋白胨 - 葡萄糖肉汤0.015％，丁胺卡那霉素，避免细菌污染，有利于进一步计数。
   2. 添加酵母使用10＃181; l接种环成准备YPD肉汤补充阿米卡星O / N在37℃。
   3. 通过离心收获酵母在2000×g离心5分钟。
   4. 除去上清液到适当的bioharzard废物处理。白粘附粒料应培养管的底部被观察到。
   5. 洗净，暂停用5毫升的PBS和短暂的震荡的沉淀细菌。
   6. 重复步骤2.2.2至2.2.3第二次进行第二次洗涤。
   7. 悬浮用1ml的PBS和短暂的震荡的沉淀。
   8. 通过使用标准的显微镜放大40倍于一个Mallassez血细胞计数计数确定所述种菌的大小。
      注:（数酵母×10 ^5）/（计数网格的矩形的对Mallassez血细胞计数数）:浓度（以CFU / ml）的，使用下式求出。
   9. 通过连续对数稀释验证至10 ^{-5和 10} -6，确认溶液含有2×10 ⁶ CFU /毫升。
   10. 板块上YPD琼脂平板上添加了0.015％，丁胺卡那霉素。

3.航空公司定植C.白色念珠菌

注:环境适应后，小鼠每天称重两次。

1. 在通风橱下，存款500微升七氟醚的在一块4厘米×4厘米的纱布（开滴技术^）14。
   1. 立即将纱布上的约750 ml的感应腔室的地板上。立即将纱布上述网状凸起的平台，以避免动物和纱布之间的直接接触。
   2. 关闭气密盖，并等待1至2分钟，以允许七氟烷扩散在腔室。
   3. 传输鼠标从笼网平台，并盖上盖子。浅麻醉用保守的自主呼吸应在30至45秒来实现。
   4. 通过观察翻正反射消失在这一点鼠标可以F为拆除监视肌张力低下光盘盒子和灌输。
2. 滴鼻（可在10秒由受过训练的人员进行）。
   1. 按住鼠标单手依偎在它的背上直立举行（ 图4B）。
   2. 使用食指，支撑头部和用拇指以保持钳口闭合，以避免咳痰（图4C）。
   3. 由于在步骤2.3.8中所述，确保准备C.白色念珠菌液中含有每毫升2×10 ⁶ CFU为50微升灌输量。
      注:第二个关键点是滴注量。体积小于50微升，可能会导致不充分的殖民统治或气道滴入不均匀，较大的体积可能诱发溺水/窒息而死亡。
   4. 灌输鼠标鼻内由接近吸管鼻孔。
   5. 吸管50微升下降形成含有鼻孔溶液中的泡沫，由spontaneousl随后吸入Ÿ呼吸鼠标。
   6. 在恢复区位鼠标（ 例如，一个大的良好的通气裸笼顶置加热灯）。小鼠必须直至完全苏醒进行监控。不要让动物无人看管，直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧和翻正反射。在这一点上，鼠标可以返回到正常壳体笼。

4. P.铜绿假单胞菌诱导的急性肺部感染

注:小鼠在以下四个天称重。通常情况下，老鼠C.期间长胖白色念珠菌介导的气道定植（图2A）。

1. 制备含P.暂停铜绿假单胞菌滴注后，O / N增长（2.2节）的一天。
2. 简要麻醉使用七氟烷吸入以上（3.1节）中的说明。
   注:要执行急性肺部感染，建议细菌负担的建议中表1中。
3. 灌输鼠标上面（3.2节）所描述的特别注意后滴入恢复。

5.测量肺损伤指数

1. 制备含有FITC-标记的白蛋白溶液。注入人道毁灭之前，这个解决方案2小时。
   1. 称量0.2毫克白蛋白-FITC与适当的设备。
   2. 加0.2毫克到1毫升的PBS。简单地说旋涡。如果不立即使用，将解决方案箔以避免暴露于环境光。
   3. 注入腹膜内200μl的FITC标记的白蛋白溶液到每只小鼠。
2. 安乐死
   1. 称重小鼠最后重量数据。
   2. 安乐死按照使用一个腹腔注射苯巴比妥致死的过量研究委员会指导当地动物使用一个单一的鼠标:300微升5.47％戊巴比妥。
   3. 从笼中取出鼠标和接收升ethal注射操作员。
   4. 注射后，独自一人转移鼠标移动到另一个笼子，瞒过任何其他动物。观察鼠标，直到不存在运动。确认死亡是由缺乏运动，特别是呼吸运动，缺少脉的。
   5. 执行对动物尸体样本的采集手术，因此无需麻醉剂，也不镇痛药。
3. 手术标本采集:胸阶段。
   注:为了保持无菌条件下，用消毒设备在生物安全2级的环境中进行的所有手术。
   1. 适用乙醇到皮肤上。从胸骨到用剪刀中间腹部进行中线切开皮肤。从沿两边胸腔中线裁。折回上胸部两侧的皮肤以可视化的肋笼。
   2. 两侧往上朝着锁骨按顺序执行胸腔的垂直切口，以便能够与船尾放倒整个前胸壁嗯让心脏和肺（ 图5A，5B）的完美可视化。
   3. 使用预heparined注射器通过打孔旁室间动脉的心脏采集血液。撤回至少500微升，以获得至少100微升血浆。置于冰上血样。
   4. 执行中线颈部切开以可视化的气管（图5B 和5C）。仔细解剖周围的气管筋膜。放置气管（图5C 和5D）后面的缝合线。随后，缝合线将围绕cannulating针封闭，以确保适当灌洗。
   5. 使用20-G的改性灌胃针（图5D 和图4A）导尿气管。领带外科结周围的气管插管与先前放置缝合。
   6. 要执行支气管肺泡灌洗（BAL），轻轻地，并逐步注入和吸取500微升冰冷的PBS到/从肺。放在我的样本CE避免细胞裂解。
   7. 重复步骤5.3.6，3次，得到总1500微升BAL液和池灌洗样品到2ml离心管（图5E）。
   8. 从胸部取出肺。放置一个肺段（大小应该对应于一个肺或一个波瓣的一半）到1.5毫升离心管中，并在快速存储 - 80℃。
   9. 放置一个肺段在含PBS中，以确定细菌负荷，并将其放置在冰上预称重溶血管。
4. 手术标本采集:腹部阶段。
   1. 上腹部的左侧执行另一个切口。通过观察腹膜脾。
   2. 取出脾并放入第二溶血管含1毫升的PBS置于冰上。
5. 肺损伤指数
   注:肺泡 - 毛细血管膜渗透性是通过测量评估FITC标记白蛋白漏出从血管腔隙的肺泡 - 刘晓丹itial舱。
   1. 离心血样和BAL液在1500×g的10分钟。收集上清液到新的离心管中。粒料对应招募血浆或BAL细胞和应放置在冰上。
   2. 加入100微升每血液上清液（血浆，黄色）或BAL上清液至96孔透明板（300微升孔）。放置的箔上盘如果不立即使用。
   3. 测定血浆荧光水平，并用荧光酶标仪（激发，487纳米，发射520纳米）BAL上清液。
   4. 通过计算荧光比率确定肺损伤指数[（BAL上清液/血液上清液）×100]。
6. 支气管肺泡灌洗（BAL）差异细胞计数。
   注:使用从BAL液离心分离得到的细胞沉淀步骤5.5.1。
   1. 如果需要的话，可以使用红细胞裂解缓冲液。加入500微升红细胞裂解缓冲液入含有CEL离心管升沉淀。简言之涡和置于冰上10分钟。加入500μlPBS阻止红细胞溶解。
   2. 收获的细胞离心，在1500×g下10分钟。除去上清，悬浮细胞沉淀在1ml无菌PBS中。枚举在Mallassez血细胞计数细胞，利用血球计数器来计数细胞。专注于一个带离心涂片幻灯片细胞。
   3. 使用着色工具包，允许细胞识别和计数（巨噬细胞，淋巴细胞，中性粒细胞）染色的细胞。
7. 肺部细菌负担和细菌传播
   注:为了评估肺部细菌负担和细菌传播，肺和脾，分别收集并存储到含1毫升的PBS（步骤5.3.9）的预先称重溶血管。
   1. 称重含有1ml PBS中并任肺或脾溶血管。使样品均质化用组织匀浆器以获得肺匀浆和脾匀浆。
   2. 存入100微升组织同源的genates到含有900微升无菌PBS，得到串行数稀释离心管中。
   3. 板最后两个适当稀释的样品^（10 -3和10 ^-2）在任BCP琼脂为P.绿脓杆菌或YPD，丁胺卡那霉素，补充琼脂C.白色念珠菌肺和脾的负担的决心。
   4. 孵育板O / N在37℃。次日，列举在平板上的菌落。
   5. 指数的结果肺重量，得到每克肺的CFU。肺样本大小是不一样的，结果应表示为每克肺的CFU。
      公式索引:[CFU]×[重溶血管和肺] - [重溶血管。

结果

作为协议的描述中之前看到的，实验需要5个一天就能完成（ 图1:实验时间表）。在实验的整个运行过程中的一个操作员请求的和可处理的处理最多10只小鼠。如果更多的动物是必需的，需要特别用于外科样品收集两个人。实际上，所有样本必须收集在下2小时，以避免在最后的小鼠FITC标记的白蛋白的增加的被动肺泡 - 毛细血管渗漏。

第一步是C的制备白色念珠菌接种和鼻内滴入，以获得由 C呼吸道定植白色念珠菌 。由5×10 ⁵ CFU C.鼻内滴入获得一个4天兴持久化模型每只小鼠白色念珠菌 （图2B）。在这4天，小鼠体重增加的^5×10 5 CFU（ 图2A）和滴注不诱导升UNG损伤（ 图2C）。虽然C.白色念珠菌可能持续长达在此模型中4天，负载48小时后降低。因此，P。铜绿假单胞菌诱导的...

讨论

动物模型，特别是哺乳动物，是有用的阐明宿主 - 病原体相互作用的复杂机制的免疫的领域。当然，对信息的需求只能从动物模型一定是必不可少的获得;否则，使用动物必须由体外模型来代替。该动物模型示出了只能由动物模型来提供自病原体之间的相互作用是由多组分宿主反应介导的洞察力。目前用来研究这种宿主 - 病原体相互作用小鼠是6岁到10周与成熟，不变的免疫反应的年轻人。当着眼于先天免疫应答，C57BL6 / J小鼠背景是优选的。避免性和激素周期（特别是雌激素）对免疫应答的效果，因此，男性是最好的选择。为了达到统计学显着性，基团必须具有至少5个个体在实验结束时，但所建议的所有动物experimen塔季翁指导，使用动物的数量应该减少和改进，以严格的最低限度。

从饲养员提供的动物研究设施交通诱导应力老鼠。其结果是炎性细胞因子可以改变后续实验像我们这样的分泌增加。此外，一个新的环境，新的"笼队友"贡献的压力。因此，老鼠必须适应在其新的居住环境，研究前至少7天。这个外壳的环境已被控制，提供标准的食物和水即兴，昼/夜循环，以及适当的稳定的湿度和温度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
七氟烷， 七氟烷	Abott	05458-02	250 ml 塑料瓶
荧光阅读器 Mithras LB940	Berthold Technologies	第一列	参考文献 无评论
溴甲酚紫色琼脂	Biomerieux	43021	每单位 20 倍
戊巴比妥钠 5.47%	CEVA	6742145	100 ml 塑料瓶
2 头阀	Distrimed	92831	无评论
无菌接种环 10 µl	Dutscher	10175	x1,000 调节
胰岛素注射器 1 ml	Dutscher	30003	每 100 调节
2 位 培养管 8 ml	Dutscher	64300	无评论
Ultrospec 10	通用电气生命科学	80-2116-30	无评论
溶血管 13 x 75 毫米	Gosselin	W1773X	每 100
PBS - 磷酸盐缓冲盐水	Life 技术	10010023	包装在 500 ml
amikacin 1 g	Mylan	62516778	每 10 个
肝素 10,000 UI 在 2 ml	中 Pan pharma	9128701	每单位 10 倍
RAL 555 着色套件	RAL Diagnostics	361550	3 个 100 mL
1.5 ml 微量离心管	Sarstedt	55.526.006	x 1000
透明 300 和微量;l 96 孔板	Sarstedt	82 1581500	没有评论
Yest-蛋白胨-葡萄糖肉汤	Sigma	95763	粉末
FITC-白蛋白	Sigma	A9771	粉末
Luria Bertani 肉汤	Sigma	L3022	粉末
25 号针	Terumo 或 unisharp	A231	x 100 调节
细胞离心机	Thermo Scientific	A78300003	无可奉告