结肠干细胞突变的定量分析

摘要

我们报告了在小鼠暴露于潜在DNA损伤剂后，对体细胞结肠干细胞突变进行可重复测量的重要改进。

摘要

测量干细胞突变的能力是一种强大的工具，可用于量化某一关键细胞群体中化学物质是否以及在多大程度上可诱导可能致癌的突变。已有研究报道，采用酶法检测技术对X连锁的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因中的干细胞突变进行定量分析.¹ 该方法需要制备冷冻切片，并将切片组织与反应混合物孵育，若细胞产生有功能的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD），则呈现蓝色；若无功能，则细胞呈灰白色。我们对反应混合物进行了改良，使用最佳切割温度化合物（OCT）介质替代聚乙烯醇，这有助于pH值的测定，提高G6PD染色组分的溶解度，并限制G6PD酶的扩散。为证实干细胞中发生了突变，整个隐窝必须完全缺乏G6PD酶活性。只有当干细胞携带表型G6PD突变时，该隐窝内所有子代细胞才会均缺乏G6PD酶活性。为鉴定携带干细胞突变的隐窝，连续切取四张相邻的冷冻切片（一个层面），厚度为7 µ微米厚度。通过连续切片的方式可确认隐窝是否完全突变，因为相同的突变隐窝会在相邻切片中被观察到。组织样本切片厚度超过50 µm 的距离设置样点，以评估总共 >10⁴ 每只小鼠的隐窝数。突变频率是指观察到的突变（白色）隐窝数量 ÷ 通过处理组中野生型（蓝色）隐窝的数量。

引言

结肠癌被认为与接触环境因子和饮食成分有关，这些因子和成分可损伤DNA，并在癌基因中产生激活性的体细胞突变例如，β-catenin）或肿瘤抑制基因的失活突变（例如，APC）。这些关键突变被认为发生在结肠干细胞中。由于结肠上皮具有独特的隐窝结构，因此在将动物暴露于与结肠癌发生相关的化学物质后，有可能检测结肠中干细胞的突变。多种X连锁酶可作为干细胞突变的指示标志，因为这些突变将存在于同一隐窝内所有细胞中。

此前已发表一项方法，证明在小鼠中可诱导结肠肿瘤的化学物质可通过分析X连锁的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因的突变，在结肠中引发体细胞干细胞突变^1-3。该方法可在无任何选择压力的情况下定量检测结肠干细胞中随机体细胞突变的发生率。该操作包括制备经处理小鼠和对照小鼠的未固定冷冻结肠切片，并鉴定出不含能产生功能性G6PD活性细胞的隐窝。这些呈白色的突变隐窝表明，突变发生于一个干细胞中，该干细胞的子代细胞也携带突变的G6PD基因。在酶学检测中，G6PD缺陷型突变隐窝无法氧化葡萄糖-6-磷酸，而后者是还原氮蓝四唑（NBT）所必需的。当G6PD酶具有功能时，染色液中的NBT被还原为不溶性的甲臜并沉淀，积聚在酶所在位置，使细胞呈现蓝色。G6PD突变型细胞则保持浅白色，与染成蓝色的野生型隐窝形成对比。该方法检测的是具有“无效”表型的突变。由于诸如G6PD等酶在未固定的组织切片中若置于水溶液中可能发生细胞外扩散，因此有必要在待分析的组织切片中稳定该酶⁴。组织切片中酶的稳定过程不得干扰G6PD酶促反应所需的小分子试剂的扩散。

我们对原始实验步骤进行了多项重要改进。关键的酶染色所用介质已从聚乙烯醇更改为最佳切割温度化合物（OCT），这有助于更好地控制pH值并促进检测中所用组分的溶解。染色过程使用由钢制垫圈制成的0.4–0.5 ml孔进行，确保每张组织切片获得相同体积的G6PD反应混合液。我们建立了一种方法，用于估算成像切片中隐窝的数量，可在无需手动计数每个结肠超过>10⁵个隐窝的情况下，实现对结肠组织的大样本分析。对相邻的7 µm组织切片进行分析，可使同一个突变隐窝在多张载玻片上被观察到，从而减少潜在的染色假象。这些改进使实验流程更加高效且可重复。

采用这一改进后的方案，我们定量分析了C57Bl/6小鼠暴露于氧化偶氮甲烷后结肠干细胞的突变频率，氧化偶氮甲烷是一种已知的啮齿类动物结肠致癌物。^5-7

方案

实验操作和动物伦理处理已获得匹兹堡大学IACUC的批准（方案编号 #1104674）。

1. G6PD 染色液的配制

注意：确保每种试剂的终浓度如下：5 mM 葡萄糖-6-磷酸（G6P）；2 mM NADP；5 mM MgCl₂；0.35 mM 1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐（MMPMS）和 0.8 mM NBT^1,8,9。每种试剂的初始浓度均按 40 ml 的终体积计算。溶液需每日新鲜配制并使用。

1. 在50 ml离心管中，向35 ml OCT培养基加入2 ml 200 mM pH 7.4磷酸盐缓冲液（PB），剧烈振荡。用pH试纸确认溶液pH值约为7.4；若不符合，则弃去该溶液。
2. 加入61 mg G6P溶于0.94 ml 200 mM PB的溶液、61 mg NADP溶于0.94 ml 200 mM PB的溶液，以及41 mg MgCl₂溶于0.96 ml 100 mM PB的溶液。再次用pH试纸确认pH值约为7.4；若pH值不接近7.4，则弃去该溶液。
3. 加入5 mg MMPMS溶于0.25 ml 200 mM PB（pH 7.4）的溶液。剧烈振荡所得反应混合物，形成澄清的深红色匀浆。若溶液浑浊，应弃去。将装有反应混合物的离心管用铝箔包裹，以减少光照暴露。在配制最后一个组分NBT期间，将反应混合物于室温保存。
4. 另取一个带O形圈盖的2 ml离心管，加入164 mg NBT、0.4 ml无水二甲基甲酰胺（DMF）和0.4 ml无水乙醇，配制成5 mM NBT溶液。盖上盖子但不要完全密封，然后将该溶液置于油浴中剧烈煮沸，直至NBT完全溶解。⁸
5. 待溶解后的NBT冷却至室温，然后将全部溶液加入OCT反应混合物中，剧烈振荡以获得澄清溶液。观察溶液颜色随时间由初始的橙红色逐渐变为深红色或紫色，此现象属正常。
6. 将最终的G6PD染色混合物置于37 °C温室内孵育1小时后再使用。

2. 动物处理与组织采集

1. 对6周龄C57Bl/6雄性小鼠给予DNA损伤剂处理， 例如，腹腔注射200 µl PBS溶解的10 mg/kg 偶氮甲烷（AOM）。对照组小鼠腹腔注射200 µl PBS。
2. 在第90天，通过CO处死小鼠₂ 根据IACUC批准的方案，采用窒息法后进行颈椎脱位。
3. 从肛门上方至胸骨基部手术切开腹腔。将小肠移出体腔，但不切除。从盲肠下方至直肠切除下段肠道。¹⁰
4. 使用显微解剖剪沿结肠一侧小心切开，并用干净的无菌 PBS 冲洗以清除结肠内的粪便。将切除的结肠卷成瑞士卷状，管腔面朝外，放入组织包埋模具中。¹⁰
5. 将结肠完全浸入OCT包埋剂中，并将模具置于装有液氮的杜瓦瓶内₂. 手持模具，使塑料底面恰好与液氮接触₂ 直到OCT包埋剂完全冻结。
6. 将冷冻组织块于 -80 ℃ 保存  直至切取冷冻切片前均不要使用任何固定剂，以免导致G6PD酶失活。

3. 冷冻切片的制备

1. 使用冷冻切片机在 -25 °C 下将冷冻组织切成 7 µm 厚的切片。连续切取 4 片 7 µm 的切片，并将其中两片置于同一张载玻片上（图 1）。制备 2 张载玻片，即共四张连续的 7 µm 切片，以代表结肠的一个切片层面（图 1）。
2. 对下一个层面进行切片时，应与上一个层面最后一张切片保持至少 >50 µm 的距离。此间距可确保各层面所评估的隐窝不发生重复。
3. 切片过程中应频繁使用 100% 乙醇擦拭冷冻切片机刀片，以清除积聚的 OCT 包埋剂残留。在重新开始切片前，用防静电干燥纸擦拭干燥的刀片，以消除积聚的静电荷。将带有冷冻切片的载玻片储存于 -80 ^oC 环境中。

4. 冷冻切片组织染色

1. 在37 °C 、高湿度的温室内进行酶组织化学反应。
   注意：在培养箱或载玻片加热器上进行酶促反应会导致G6PD染色效果差且不一致。
2. 使用两个粘合在一起的1.5 cm × 0.15 cm钢制垫圈（内径 × 高度）构建用于组织染色的反应腔（图1）。将石蜡膜裁剪成适合反应腔底部的形状，中心挖空，并将反应腔置于载玻片的组织切片上方。
   注意：垫圈底部的石蜡膜可在载玻片与垫圈之间形成密封，使黏稠的G6PD染色混合液保留在组织切片上。该装置形成的反应腔体积为0.4–0.5 ml，确保研究中每张切片上的组织区域接受相同体积的G6PD反应染色液。
3. 将冷冻组织切片置于温室中37 ^oC预孵10分钟。在37 °C条件下，向每个组织切片反应腔（每张载玻片含2个切片）中加入G6PD染色反应混合液，孵育45–50分钟。取出载玻片，小心地将不锈钢反应腔从载玻片上取下。
4. 将载玻片竖立放置，使反应液自然流尽。将载玻片放入100 mM PB缓冲液（pH 7.4）中30–60分钟，以去除组织中的G6PD染色反应液，同时不破坏组织染色。随后将载玻片浸入蒸馏水中5–10分钟，以去除PB盐分。
5. 用滴管向组织上滴加氟胶（fluoro-gel）以封固组织，静置约30分钟使其干燥。避免产生气泡，以免干扰突变隐窝的识别。
   注意：若出现气泡，可将载玻片浸入蒸馏水中去除氟胶后重复该步骤。请勿使用盖玻片，因其容易困住气泡。

5. G6PD 突变隐窝的鉴定及突变频率的测定

1. 在光学显微镜下分析G6PD突变隐窝的切片。
   注意：用于鉴定完全突变隐窝的标准包括：(i) 整个隐窝无蓝色染色；(ii) 隐窝的外部结构完整；(iii) 在相邻的7 µm连续切片上均观察到该突变隐窝；(iv) 两名观察者均需确认同一隐窝为突变型。在相邻7 µm切片上观察到的同一突变隐窝计为一个突变事件。
2. 以40倍放大倍数对每个G6PD突变隐窝进行成像，并使用500万像素相机配合图像采集软件对图像进行归档。
3. 通过为每只小鼠选择表面积最小层面的代表性切片，以10倍放大倍数成像，以量化每只小鼠检测的隐窝总数 （图1C）。
   注意：一个层面指连续的四个7 µm切片 （图1D），由于切片间距较近，同一突变隐窝常在多个切片中出现。不同层面之间间隔 >50 µm，以确保可观察到结肠不同区域的隐窝。
4. 打开每张图像文件，通过分析文件内容（如 图1C 中方框所示）目视计数一个层面内的隐窝数量。单个图像文件中观察到的隐窝数量可从低至20个到 >300个不等。
5. 将每只小鼠所选层面的隐窝总数 （图1C）乘以每段结肠用于筛查G6PD突变隐窝的层面数。例如，每层面计数1,250个隐窝，乘以8个筛查层面，总计为10,000个隐窝。每段结肠至少需评估10,000个隐窝，以满足统计分析要求。
6. 将所有动物中观察到的突变隐窝总数除以筛查的隐窝总数，计算各处理组的突变频率（MF）。未经处理小鼠的背景干细胞MF水平为 < 0.1×10^-4 （表1），与既往在C57Bl/6小鼠中报道的结果相近¹¹。

结果

测量动物结肠干细胞突变的能力为关联突变与癌症诱导提供了独特的方法。通常认为，致癌过程中的关键步骤涉及癌基因的激活突变和/或肿瘤抑制基因的失活突变。我们向C57Bl/6小鼠注射了 200 µl PBS 或 10 mg/kg AOM 200 µl PBS。AOM 是一种已知的结肠致癌物。^5-7 在90天时，对结肠组织进行干细胞突变分析。该时间点的设定是为了确保干细胞有足够时间完全占据整个隐窝；只有当整个隐窝均不产生G6PD时，才被认定为干细胞突变隐窝。完全突变隐窝的示例如下所示。 图2图中显示了冷冻切片制备过程中隐窝的两种不同方向（垂直和水平）。垂直方向是沿隐窝长轴的俯视图，而水平方向则为侧视图。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）野生型的隐窝染成蓝色，其中部分白色区域源于杯状细胞产生的黏液。通过计数一张载玻片上隐窝的总数（图1）以及突变隐窝的数量，可计算突变隐窝的突变频率（MF）。在任何样本中均未观察到突变隐窝。 >对照组（PBS处理）小鼠中检测了100,000个野生型隐窝。我们将对照组小鼠的突变频率（MF）设定为 < 0.1×10

讨论

化合物的遗传毒性效应通常由其修饰DNA的能力决定。常规方法是分离组织并检测DNA加合物的整体水平。对于AOM而言，这包括定量结肠中的O⁶-甲基鸟嘌呤加合物。然而，该方法会丢失特定细胞类型（如干细胞微环境）内损伤情况的信息。此外，DNA加合物并不等同于突变，因为只有一小部分加合物最终会转化为固定的突变¹²。本文提供了基于Griffiths et al.¹最初描述的方法以及VanNorden开发的G6PD染色技术^4,8,9,13,14，用于可重复地定量结肠干细胞突变的详细步骤。

该酶组织化学方法要获得可定量的结果，有几个关键步骤。其中之一是组织切片。与常规的H&E组织学分析相比，必须制备并分析更多的组织切片。我们通过评估5、6、7、8和10 µm厚度的切片后确定，7 µm的切片可获得最佳的G6PD染色效果。

其次，对所需数量的珍贵组织切片进行染色需要可重复的反应混合液。我们发现原始方案中使用的聚乙烯醇（PVA）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
氮蓝四唑
NADP
葡萄糖-6-磷酸
1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐
二甲基甲酰胺
磷酸盐缓冲液（pH 7.4）
最佳切割温度化合物（OCT）
设备
配备500万像素相机的光学显微镜
冷冻切片机
温育室