结肠干细胞突变定量

Summary

我们报告了小鼠暴露于潜在 DNA 损伤剂后体细胞结肠干细胞突变的可重复测量的显着改善。

Abstract

测量干细胞突变的能力是一个强有力的工具中的一个关键的细胞群进行量化如果，以及在何种程度，化学可诱导的突变可能导致癌症。使用的酶测定法来量化干细胞突变在X连接的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因已被报道 ^。1此方法要求与反应混合物能够产生一个在制备冰冻切片的切片组织和培养如果细胞产生功能葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）酶的蓝色。如果不是，该细胞出现发白。我们已修改代替聚乙烯醇使用最佳切削温度化合物（OCT）中的反应混合物中。这有利于pH测量，提高了G6PD染色成分的溶解和限制G6PD酶的扩散。为了证明突变发生在干细胞中，整个隐窝必须缺乏G6PD酶促活动。只有当一个干细胞藏着表型G6PD基因突变都会在地下室的后代缺乏G6PD酶的活性。要确定隐窝干细胞突变，连续四个相邻的冰冻切片（A级）切成7微米的厚度。使得相邻削减这种方法提供了构象地穴充分突变，因为相同的突变隐窝将相邻路段进行观察。幻灯片与组织样本均大于50μm相距已准备共> 10 ⁴每只小鼠隐窝来评估。突变频率是所观察到的突变的（白色）由野生型（蓝色）隐窝中一个治​​疗组的数量÷隐窝数。

Introduction

结肠癌被认为涉及暴露于环境剂和膳食成分，可以破坏DNA和产生激活体细胞突变在致癌基因（例如，β-catenin的）或失活突变的肿瘤抑制基因（例如，APC）。据推测，这些关键突变发生在结肠的干细胞。由于结肠上皮的独特隐窝结构的，有可能让动物接触与结肠癌的发生​​相关联的化学品之后测量干细胞突变在结肠。几个X连锁酶可作为指标发生在干细胞突变，如突变将存在于一个隐窝内的所有细胞。

以前，一个过程被出版表明化学品诱导结肠肿瘤小鼠也通过在X连接的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因突变的分析生成体干细胞突变在结肠^1-3该方法量化了结肠干细胞随机体细胞突变的发生没有任何选择压力。该过程涉及从处理的小鼠和对照小鼠未固定的冷冻切片结肠癌的生产和隐窝缺乏产生官能G6PD活性细胞的鉴定。这些突变隐窝，呈现白色，表明突变发生在给人们带来的后代也携带突变基因G6PD干细胞。在酶测定中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷突变隐窝不能氧化葡萄糖-6-磷酸，这是需要的硝基四氮唑蓝（NBT）的还原。当G6PD酶是功能性的，在NBT在染色混合物降低到不溶性甲臜和沉淀物，积累在酶和"染色"细胞蓝色的位置。细胞，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶突变体仍然发白而相比之下，蓝染野生型隐窝。这种方法测量的是有一个"空"的表型变异。因为恩P450酶活，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，可以扩散上，如果节放在水溶液未定影组织部分的细胞出来，有必要稳定酶在组织切片进行分析^。4，

Protocol

实验过程和善待动物组织批准匹兹堡IACUC大学（协议＃1104674）。

1.制备G6PD染色混合

注:确保每个试剂的最终浓度如下: 5mM葡萄糖-6-磷酸（G6P）; 2mM的NADP，5mM的_MgCl 2的，0.35毫1-甲氧基-5-甲基吩甲基硫酸（MMPMS）和0.8mM的^NBT。1,8,9-对于每个试剂的初始浓度推导对于40 ml的终体积。解决方案新鲜制备，每天使用。

1. 加入2毫升200毫pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PB）到35 ml的十月培养基的50ml管中，并剧烈振荡。确认用pH试纸，该溶液是pH为〜7.4。如果不丢弃溶液。
2. 加入61毫克G6P溶解在0.94毫升200mM的PB，61毫克NADP溶解在0.94毫升200mM的PB和41毫克的MgCl ₂溶于毫升100mM的0.96 PB。再次确认该pH值为7.4〜机智^ h pH试纸。如果没有〜7.4，丢弃的解决方案。
3. 添加5毫克MMPMS溶解在0.25毫升200mM的PB（pH 7.4）中的。用力摇动所得的反应混合物以产生一种清晰的暗红色匀浆。如果溶液混浊，使混合物应该被丢弃。被包裹在箔含有反应混合物的管，以尽量减少暴露于光。在室温储存的反应混合物，而最后一个组件，NBT，制备。
4. 通过加入0.4 ml的无水二甲甲酰胺（DMF）和0.4 ml的无水乙醇，以164毫克....

Results

衡量结肠干细胞基因突变的动物的能力提供了一个独特的方式来关联突变诱发癌症。通常情况下，假定在癌变的关键步骤包括激活突变在癌基因和/或失活的肿瘤抑制基因的突变。我们注射C57BL / 6小鼠用200μl的PBS或10mg / kg的急性中耳炎在200μlPBS中。 AOM是一种已知的致癌物质冒号^5-7在90日进行了结肠干细胞基因突变分析。这个时间是必需的，以允许干细胞能够充分填充隐窝，只有当整个隐窝中不产生葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是鉴定为干细胞突变一个隐窝。完全突变体隐窝例子示于图2中 。该图显示了两个不同的方位发生在冷冻切片的制备隐窝（垂直和水平）。垂直视图俯视隐窝的长轴，而水平提供了侧视图。该哭点是野生型葡萄糖-6-磷酸脱氢酶染色蓝与白一些是由于来自杯状细胞粘液生产。通过计数上滑动（图1）和突变隐窝数隐窝的总数，对MF为突变隐窝可以计算出来。没有突变隐窝任何检查对照的> 100,000野生型隐窝观察（PBS处理）的小鼠。我们设置MF为对照小鼠为<0.1×10 ^-4，这是接近之前对C57BL / 6小鼠的报道

Discussion

常的化合物的基因毒性作用是通过其来修改DNA的能力来确定。这通常是通过分离组织和测量DNA加合物的全球水平上进行。对于AOM，这将涉及量化^O 6 -甲基鸟嘌呤加合物在结肠。上使用的特定细胞类型，如在干细胞小生境中的损害此方法的信息，将丢失。此外，DNA加合物的是不一样的突变，因为加合物的只有一小部分被最终转化成固定的突变^。12我们提供本文所述细节基于由格里菲思所述的初始方法可再现地量化干细胞突变在结肠等人 ^1和基于由VanNorden开发G6PD染色^{。4,8,9,13,14}

有这种酶组织化学方法产生可量化的结果是几个关键步骤。一个是在组织的切片。显著更多的组织宗派离子必须产生，并且比将典型的做法用H＆E组织学分析来分析。我们确定，7微米的部分，得到最好的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶染色的5，6，7，8和10微米厚的切片评估后。

其次，染色的有价值的组织切片的必要数量需要可再现的反应混合物中。我们发现，使用在原始协议中使用聚乙烯醇.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
硝基蓝四唑
NADP
葡萄糖-6-磷酸
1-甲氧基-5-甲基吩嗪 甲基硫酸
二甲基甲酰胺
磷酸盐缓冲液 （pH 7.4
最佳切割温度化合物 （OCT）
设备
光学显微镜 配备 5 MP 相机
低温恒
器 温暖室