群体感应淬灭酶是一种抗毒力和抗细菌的策略，可通过抑制毒力因子以及与抗生素耐药性和生物膜形成相关基因的表达，在不引发耐药性风险的情况下减轻病原性。在本研究中，我们报告了一种方法，用于验证群体感应淬灭酶在细菌生物膜破坏中的有效性。
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摘要
摘要
多重耐药细菌的迅速出现加剧了对新型治疗手段的需求，以应对威胁生命的感染。细菌感染的持续存在通常与群体感应介导的生物膜形成有关。因此，干扰这一信号通路成为一种有吸引力的抗毒力策略。已有研究报道，群体感应淬灭乳清酸内酯酶可有效破坏群体感应回路。然而，关于这些酶在抑制细菌生物膜形成方面有效应用的报道仍极为少见。本实验方案描述了一种利用基因工程改造的群体感应淬灭乳清酸内酯酶，抑制临床相关 A. baumannii S1 菌株生物膜形成的方法。Acinetobacter baumannii 是一种重要的人类病原体，与全球范围内严重的医院获得性感染密切相关，其致病性主要归因于其生物膜的顽固性。经基因工程改造的乳清酸内酯酶处理后，显著减少了 A. baumannii S1 的生物膜形成。本研究还表明，未来有望利用基因工程改造的群体感应淬灭酶治疗由生物膜介导的细菌性疾病。最后，该方法也可用于评估具有潜力的群体感应淬灭酶的效能。
引言
由于多重耐药细菌的迅速增加，且这些细菌对多种抗生素具有耐药性，使得感染性疾病的治疗选择变得复杂1。由耐药菌引起的感染具有较高的发病率和死亡率，因此迫切需要加快药物开发进程，和/或探索更有效的抗菌替代方案，以改善治疗选择。近年来，抗毒力策略因其可通过非杀菌方式抑制细菌毒力，从而降低耐药机制出现的风险，正受到越来越多的关注2。
群体感应是细菌毒力的“主控开关”，干扰这种信号传导现象是一种有前景的抗毒力策略，可用于对抗病原体致病过程3。毒力的启动需要在细菌达到临界种群密度后，群体感应分子在胞外环境中积累。当这些分子扩散回胞内时，会与其对应的受体结合，从而激活毒力因子以及与抗生素耐药性和生物膜形成相关的基因4。通常，群体感应干扰的作用机制是抑制群体感应分子与其受体的相互作用，而不影响细菌的主要代谢通路。因此，该策略对细胞生长无直接抑制作用。由于未对细菌适应性造成压力，细菌对此类治疗产生耐药性的选择压力极小5。此外，群体感应干扰还可破坏细菌固有的保护机制，例如生物膜的形成，而生物膜可使细菌免受抗菌剂和宿主免疫反应的攻击。
据估计，地球上99%的微生物以复杂的类似生物膜的基质形式存在，这种结构为其中的微生物提供了关键的生存优势6。更重要的是，这些固着群落的形成是大多数持续性和慢性医院获得性感染的根源7。Acinetobacter baumannii 是与全球范围内医院获得性感染相关的主要人类病原体之一，其毒力主要归因于群体感应介导的生物膜形成8。群体感应淬灭酶已被成功用于通过靶向一类称为N-酰基高丝氨酸内酯（AHLs）的化合物来干扰群体感应介导的信号转导，这类化合物由革兰氏阴性菌产生9。多项研究还进一步拓展了这些酶的应用，通过减少生物膜中毒力因子的表达和细菌数量来阻断细菌致病过程10,11。然而，目前仍缺乏对群体感应淬灭酶在抑制病原细菌生物膜形成方面有效应用的切实示范。已有研究尝试使用群体感应抑制剂（AHL类似物）而非群体感应淬灭酶来干扰A. baumannii生物膜的形成12。尽管使用小分子抑制剂是一种有效的方法，但在转化应用中维持其生物可利用性仍具挑战性。相比之下，使用催化性的群体感应淬灭酶可能规避生物可利用性问题，因为酶更易于在生物医学装置表面固定化，从而实现治疗效果。
本文介绍了一种利用结晶紫染色法和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估来自Geobacillus kaustophilus（GKL）的工程化群体感应淬灭乳酸内酯酶13对细菌生物膜形成影响的方法。该研究首次成功证明了利用群体感应淬灭酶可破坏临床相关性A. baumannii S1菌株的生物膜。本研究所描述的方法可用于评估其他群体感应淬灭酶在后续针对致病性革兰氏阴性菌的治疗开发中的有效性。
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方案
1. 结晶紫定量法检测生物膜形成 A. baumannii S1
- 在30 °C、220 rpm的摇床培养箱中，用5 ml的LB液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L）培养A. baumannii S1菌株，培养16小时。
- 将A. baumannii S1菌液调整至OD600为0.8。使用96孔板，将菌液以1:100的比例接种至新鲜LB培养基中，并加入10 µl纯化的GKL酶（40 mg/ml），每孔终体积为100 µl。
- 同时制备对照组培养物，该组不添加任何酶。重复上述操作以获得所需数量的重复样本。
- 用盖子盖好96孔板，并将其放入密封的10 L塑料容器中，在30 °C下孵育3小时后，轻轻移除培养基。
- 向每孔中加入100 µl新鲜LB培养基，继续在30 °C下孵育21小时。
- 第二次孵育结束后，轻轻移除所有培养基，用200 µl无菌水清洗浮游细菌细胞，清洗过程中应尽量减少对细胞的扰动。
- 向每孔中加入100 µl 1%结晶紫溶液，在室温下孵育15分钟。用200 µl无菌水清洗孔板以去除结晶紫溶液，重复清洗三次。
- 向每孔中加入100 µl 33%乙酸溶液，在轻微振荡条件下孵育15分钟，以溶解染料。
- 通过测定600 nm波长处结晶紫的吸光度来定量生物膜的形成量。结晶紫的量与形成的生物膜量成正比。
2. A. baumannii S1 生物膜的共聚焦激光扫描显微镜观察
- 培养5 ml的菌液 A. baumannii S1 在 LB 中，30℃ °在摇床培养箱（220 rpm）中于37°C培养16小时。
- 调整培养物 A. baumannii S1 至目标 OD600 0.8。使用35 mm玻璃底培养皿 µ- 培养皿，将细菌培养物（1:100 稀释）接种至含 30 的新鲜 LB 培养基中 µ1 毫升纯化的 GKL 酶（40 毫克/毫升）；新培养体系的终体积为 1 毫升。
- 覆盖 µ-将培养皿盖好并放入密封的10 L塑料容器中。孵育 µ- 在30℃下培养 °C孵育3小时后，轻轻移除培养基。加入30 µ1 ml 纯化的 GKL 酶和新鲜培养基，总体积为 1 ml。在 30 ℃ 下继续孵育 21 小时 °C.
- 重复步骤 2.3 并孵育 µ- 在30℃下再培养24小时 °C. 然后，轻柔地移除培养基。
- 加入500 µ5 分之 1 µg/ml Alex Fluor 488 标记的麦胚凝集素（WGA）溶于 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中 µ- 将培养皿置于37℃培养箱中孵育 °C 孵育 30 分钟；此步骤将对形成的生物膜进行染色。移除染色液并清洗生物膜 µ-加入2 ml HBSS的培养皿中。重复洗涤步骤一次。
- 加入500 µl 3.7% 甲醛溶于HBSS中，37℃孵育 °C 孵育 30 分钟；此步骤可将生物膜固定于 µ- 培养皿。清洗 µ用 2 ml HBSS 洗涤一次，然后完全去除溶液。 µ- 形成生物膜的培养皿可在4℃避光保存 °C 在共聚焦激光扫描显微成像之前。
- 对于共聚焦激光扫描显微镜成像与分析，使用63倍放大倍数，以0.21的间隔生成每幅图像97个光学切片 µ每堆 m 个。
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结果
在结晶紫定量实验中，使用了两种群体感应淬灭酶来验证其干扰生物膜形成的可行性：野生型 GKL 和一种改良的 GKL 双突变体（E101G/R230C）。这两种酶均已被证明对 A. baumannii S1 所使用的主要群体感应分子 3-羟基-癸酰-L-高丝氨酸内酯（3-OH-C10-HSL）具有内酯酶活性14。为了有效评估生物膜的破坏情况，实验中还同时包含了各自对应的催化失活突变酶（此前已证实这些突变体不会结合 AHL 配体）作为直接对照（GKL D266N 突变体和 GKL E101G/R230C/D266N 突变体）。除了使用野生型 A. baumannii S1 外，还检测了 ΔabaI 突变株（缺乏 AHL 合成酶）的生物膜形成能力。结果显示，两种群体感应淬灭酶——野生型 GKL 和 GKL E101G/R230C 突变体——均能显著降低经预处理的 A. baumannii S1 培养物中的生物膜形成（n = 10；p 值 ≤ 0.0001）（
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讨论
在两组实验中，A. baumannii S1 均在不含 NaCl 的 LB 培养基中培养，因为高盐浓度可能会减少细菌形成的生物膜量15。此类人为因素的存在可能低估生物膜的形成量，以及不同处理条件下群体感应淬灭酶的作用效果。使用无催化活性的酶作为阴性对照至关重要，可排除酶对信号分子的非特异性结合（隔离）可能带来的影响。图1显示，即使无活性的酶能够结合群体感应分子，生物膜的形成也不会受到干扰。
A. baumannii S1 在 96 孔板孔内气液界面处形成精细的环状生物膜结构。因此，在去除培养基和洗涤过程中必须避免过度震荡，以防意外去除细菌生物膜。每次孵育后均需移除 LB 培养基，以清除浮游细胞。此外，将 96 孔板置于 10 L 塑料容器中，以减少气流扰动，并创造有利于生物膜形成的微厌氧环境。在 96 孔板中对生物膜进行定量时，还取决于每孔中加入的结晶紫染料的量。若某孔中加入过量结晶紫，可增加洗涤次数。结晶紫染色实验可对群体感应淬灭在生物膜破坏中的效率进行相对比较。尽管结晶紫染色法在测量生物...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作得到了新加坡教育部学术研究基金、国家医学研究理事会和国家研究基金会资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白胨 | BD | 211705 | |
| 酵母提取物 | BD | 212750 | |
| 96 孔板 | Costar | 3596 | |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| 乙酸 | Lab-Scan | PLA00654X | 注意：易燃 |
| μ-皿 | Ibidi | 80136 | |
| Alexa Fluor 488 标记的 WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s 平衡盐溶液 | Invitrogen | 141475095 | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | 注意：腐蚀性 |
| Synergy HT 微孔板读板仪 | BioTek | ||
| 1X-81 倒置荧光显微镜 | Olympus |
参考文献
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重印与许可
